白细胞介素33(IL-33)/ST2介导的肥大细胞活化在变态反应性疾病的病理生理过程中起着重要作用。因此，针对肥大细胞中IL-33/ST2通路的药理作用可能有助于这类疾病的治疗。我们发现白藜芦醇抑制IL-33/ST2介导的肥大细胞活化。白藜芦醇抑制IL-6、IL-13和TNF-α在小鼠骨髓源性肥大细胞(BMMC)、小鼠胎皮源性肥大细胞和人嗜碱性粒细胞中的产生.白藜芦醇还能抑制IL-33在小鼠肺组织中的表达。IL-33介导的肥大细胞产生细胞因子需要激活NF-κB和MAPKp38-MAPK激活的蛋白激酶-2/3(MK 2/3)-PI3K/Akt通路，白藜芦醇明显抑制IL-33诱导的MK 2/3-PI3K/Akt通路的激活，而不影响NF-κB通路。重要的是，白藜芦醇能抑制MK2的激酶活性，而MK2/3抑制剂则能抑制白藜芦醇的抑制作用。白藜芦醇和MK 2/3抑制剂还能抑制BMMC中IgE依赖性脱颗粒和细胞因子的产生，同时抑制MK2/3-PI3K/Akt通路。这些结果表明，白藜芦醇抑制IL-33/ST2介导的和IgE依赖性肥大细胞的激活主要是通过靶向p38下游的MK2/3-PI3K/Akt轴。因此，白藜芦醇可能具有预防和治疗广泛的过敏性疾病的潜力。

IL-33是IL-1家族的一员，它通过其受体ST2在组织稳态和炎症过程中发挥多种作用。最近的研究表明，IL-33/ST2相互作用在变态反应性疾病的发生发展中起着至关重要的作用。当接触过敏原时，上皮细胞释放出IL-33作为一种alarmin，激活包括肥大细胞和2型固有淋巴样细胞(ILC 2)在内的表达ST2的免疫细胞，导致IL-5和IL-13的产生，并引发变应性炎症。IL-33/st2通路被认为参与了IgE依赖性和非依赖性变态反应性炎症的发展。1...因此，针对肥大细胞(或ILC 2)中的IL-33/ST2信号通路，是广泛防治变态反应性疾病的重要策略。

白藜芦醇(反式3，4，5-三羟基二苯乙烯)是一种天然多酚，由几种开花植物产生，如红色葡萄，以应对环境胁迫。白藜芦醇对多种细胞类型有多向性作用，从而对衰老、新陈代谢、癌症和炎症产生有益作用。2,3...在肥大细胞中，白藜芦醇限制IgE介导的脱颗粒，前列腺素D2细胞因子的合成与抑制或激活多种途径，包括磷脂酶C(Pc)γ、细胞外信号调节激酶(Erk)/c-jun nh。2-末端激酶(Jnk)/p38、AMP活化蛋白激酶(AMP)/sirt 1和核因子-κB(NF-κB)4,5...然而，白藜芦醇是否抑制IL-33/ST2介导的肥大细胞活化尚不清楚。

IL-33/ST2介导的肥大细胞产生细胞因子需要激活NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38通路。6...MAPK激活的蛋白激酶2和3(MK2和MK3)是p38下游丝氨酸/苏氨酸激酶，在IL-33/ST2诱导的肥大细胞活化中起关键作用。骨髓源性肥大细胞(Bmcs)在IL-33刺激下产生IL-6、IL-13和肿瘤坏死因子(α)，这种反应依赖于mk 2/3介导的磷脂酰肌醇3-激酶(Pi3k)/Akt通路的激活。7.

在本研究中，我们试图确定白藜芦醇是否能抑制IL-33/ST2介导的肥大细胞激活，如果可以，如何抑制。为此，我们研究了白藜芦醇对BMMC中IL-33介导的IL-6、IL-13、TNF-α的产生及多种信号通路(包括MK 2/3-PI3K/Akt)的影响。我们还研究了白藜芦醇对骨髓基质细胞IgE依赖性脱颗粒和细胞因子产生的影响。结果显示白藜芦醇是IL-33/ST2介导的肥大细胞活化的抑制剂，MK 2/3是白藜芦醇的新靶点。

材料

Reagents used in this study were acquired from the indicated suppliers：trans-resveratrol，cyclodextrin，5Z-7-Oxozeaenol and Evans blue(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)；LY294002，wortmannin，and ICI 182，780(Abcam，Cambridge，UK)；PF-3644022(TOCRIS Bioscience，Bristol，U.K.)；recombinant mouse IL-3，recombinant mouse stem cell factor(SCF)，and recombinant human IL-33(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)；recombinant human IL-3(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)；重组小鼠IL-33(研发系统，明尼阿波利斯，MN，美国)；抗TNP IgE，抗DNP小鼠IgE单抗，抗小鼠CD 16/32，PE结合抗小鼠c-kit Ab和APC-结合抗小鼠ST2 Ab(BD生物科学，美国圣何塞，CA)；DNP-BSA(日本东京Cosmo Bio)；APC-共轭抗CD 63抗体(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)；抗磷转化生长因子β激活激酶1(TAK 1)Ab(Thr 184/187)；#4508)，anti–phospho–IκB kinase(IKK)α/βAb(Ser176/177；#2078)，anti–phospho–p65 Ab(Ser536；#3033)，anti–phospho–p38 Ab(Thr180/Thy182；#4511)，anti–phospho–MK2 Ab(Thr334；#3007)，anti–phospho–Akt Ab(Ser473；#4060)，anti–phospho–Gab2 Ab(Tyr452；#3882)，anti–phospho–Syk Ab(Tyr525/526；#2710)，anti–phospho–p70S6K Ab(Tyr389；抗磷脂-AMPKAb(Thr 172；#2535)，抗β-actin抗体(#4970)，细胞信号技术(细胞信号技术，美国丹佛斯)。

小鼠

雄性6-8周龄C57BL/6小鼠从日本SLC(日本东京)购买，在12小时光照/12小时黑暗条件下饲养。以10 mg/kg白藜芦醇或2%环糊精在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中作为对照组。2小时后，用重组小鼠白细胞介素-33(IL-33)进行24小时的鼻内攻击。qPCR法检测肺组织IL-6和IL-13 mRNA水平。所有的动物实验都由山梨大学的机构评审委员会批准，并按照指导方针进行。

小鼠BMMCs和胎儿皮肤源性肥大细胞(FSMCs)的产生

从雄性C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞悬液中制备BMMCs，如前所述。8...以含10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、10 mm非必需氨基酸、青霉素/链霉素、10 mM丙酮酸钠和50μM2-ME(10 ng/ml重组小鼠IL-3)的RPMI 1640为载体，培养粗骨髓细胞。漂浮细胞每周更新两次，在新鲜完整的RPMI 1640中进一步扩增2-4周。最后，细胞(>95%FCεR1)+C-试剂盒+)作为BMMCs，无需进一步纯化。FSMC于第14天从C57BL/6小鼠胎皮中产生，如前所述。9...在37°C条件下，用限制性胰蛋白酶在完整的RPMI 1640中培养20 min，在10 ng/ml rmIL-3和10 ng/ml重组小鼠SCF存在下，在完整的RPMI 1640中培养单细胞悬液。培养2周后收集非贴壁细胞和松散贴壁细胞，经Percoll密度梯度离心富集肥大细胞。最后，细胞(>95%FceR 1)+C-试剂盒+)作为FSMC。

人外周血单个核细胞嗜碱性粒细胞的分离

来自健康捐献者的布菲大衣的使用得到了山桥大学道德委员会的批准，并按照指导方针进行，并根据“赫尔辛基宣言”提供了书面知情同意。PBMC是用Ficoll-Paque从布菲大衣中分离出来的(GE Healthcare，Little Chalfonn，U.K.)。人嗜碱性粒细胞用MACS磁性细胞分离系统分离(碱性粒细胞分离试剂盒II，人；Miltenyi Biotec)。分离的人嗜碱性粒细胞在10 ng/ml重组人IL-3+10 ng/ml重组人IL-3培养液中培养18h，在25μM白藜芦醇存在或不存在的情况下，用100 ng/ml重组人IL-33培养6h。

流式细胞术分析

在抗CD 16/32的大鼠抗鼠抗体存在下，分别用抗PE-共轭小鼠c-kit、APC-共轭小鼠FCεRI、APC-共轭小鼠ST2或APC-共轭小鼠CD 63的抗体对BMMCs进行染色。用PBS洗涤后，用BD Accuri C6流式细胞仪(BD生物科学)对染色细胞进行分析。为检测凋亡细胞，将BMMCs分别与5μl PE结合蛋白V和5μ1 7-AAD在1×结合缓冲液10 0μ1中孵育15 min。加入1×结合缓冲液400μ后，用流式细胞仪对染色细胞进行分析。流式细胞术数据用CellQuest软件(BD生物科学)进行分析。

细胞增殖试验

用细胞计数试剂盒-8监测细胞增殖(日本熊本Dojindo实验室)。

定量实时PCR

用RNeaseMini试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA，USA)从BMMCs和小鼠肺中提取总RNA。RNA在纳米滴ND-1000分光光度计上定量。利用PrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara，Ootsu，Japan)合成了互补DNA(CDNA).在7300快速实时PCR系统(应用生物系统，Carlsbad，CA，USA)上，采用特定引物和探针对小鼠IL-6、IL-13、TNF和GAPDH(应用生物系统)进行了定量实时PCR(QPCR)。根据相应的GAPDH mRNA水平对qPCR数据进行归一化处理。

染色质免疫沉淀(芯片)法

芯片分析采用酶促染色质ip试剂盒(琼脂糖珠)(细胞信号技术；#9002)。BMMCs在切屑前以1%甲醛交联。采用芯片级抗小鼠p65抗体(细胞信号技术)和纯化的兔IgG进行免疫沉淀。用引物和TaqMan探针分析α启动子区的免疫沉淀DNA和输入。Primers used were as follows：mouse TNF-ακB2 promoter：sense，5′-GCTCATGATCAGAGTGAAAGGAGAA-3′，antisense，5′-GGAATGAACTCAGCCCTGGG-3′，TaqMan probe，5′-FAM-CTTGTGAGGTCCGTGAATT-NFQ-3′；mouse TNF-ακB3 promoter：sense，5′-CCTTCAGCCACTTCCTCCAA-3′，antisense，5′-TCTGAAAGCTGGGTGCATAAGG-3′，TaqMan probe，5′-FAM-AAGCCCCCTGTTTGAGTTC-NFQ-3′(Applied Biosystems).

酶联免疫吸附试验(ELISA)

用ELISA法测定细胞培养上清液中IL-6、IL-13、TNF-α和组胺的浓度.获得小鼠IL-6和TNF-α(EBioscience)、小鼠组胺(牛津生物医学研究、罗切斯特山、MI)、小鼠IL-13和人IL-13(研发系统)的试剂盒。

离体p38和MK2激酶分析

离体用CycLex p38激酶/抑制剂筛选试剂盒和CycLex MK2激酶/抑制剂筛选试剂盒(CycLex，长野，日本)对p38和MK 2进行激酶分析。在p38和MK2阳性对照(CycLex)中直接加入白藜芦醇，观察白藜芦醇对p38和MK2活性的抑制作用。

β-六胺酶释放试验

BMMCs与1μg/ml抗DNP小鼠IgE单抗在4℃下孵育1h，用1μg/ml抗小鼠IgE抗体刺激40 min，37°C时，加入1%Triton缓冲液40 min。上清液从每口井中收集，并与p-硝基苯-N-乙酰-β-D-葡糖胺类化合物，测定释放的β-己糖胺酶的酶活性.在37°C下反应90 min后，加入0.2M甘氨酸溶液停止反应，在405 nm处用吸收分光光度计测定。计算了β-氨基己糖酶释放率如下：

释放%=(未刺激上清液OD)×100/(Triton裂解细胞上清OD-未刺激上清液OD)

westernblot分析

BMMC在RIPA缓冲液(25 mm Tris-HCl，pH7.6，150 mm NaCl，1%Triton X 100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS)中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Merck Milli孔隙，Burlington，MA)和香草酸(Fujifilm Wako Pure Corporation，日本大阪)进行裂解。细胞裂解液溶于含50 mm二硫苏糖醇和溴酚蓝的样品缓冲液中，煮5 min。在纳米滴头ND-1000(热费舍尔科学)上测定了蛋白质浓度。蛋白质通过SDS-PAGE凝胶转移到聚偏氟乙烯膜上.在室温(RT)条件下，用5%乳堵液浸泡1小时，用4°C的一次抗体溶液孵育隔膜，用TBS/T洗涤3次，RT用二次抗体溶液孵育2h。免疫反应蛋白用ECL Prime(GE Healthcare)显示。

记者分析

采用小鼠巨噬细胞核心试剂盒(VPA-1009；Lonza，巴塞尔，瑞士)，瞬时转染pNFκB-Luc报告质粒，以PRL-CMV为内对照。48小时后，在白藜芦醇不存在或有白藜芦醇存在的情况下，用IL-33刺激转染的BMMCs。NF-κB荧光素酶相对活性与转染效率成正相关.

钙的测定2+动员

胞内钙2+利用日本熊本市Dojindo的Fluo-3AM进行动员分析.经IgE致敏的BMMCs在37°C下负载4μM Fluo-3AM 30 min，再悬浮于新鲜培养基中，用抗原刺激细胞。抗原刺激后立即用流式细胞仪检测BMMCs中染料荧光的变化。按数字计算，Ca2+动员表现为相对荧光强度。

被动皮肤过敏

皮下注射小鼠抗TNP IgE(100 Ng)。24小时后，在含0.2%伊文思蓝染料的PBS中静脉注射50μg的DNP-BSA。血管通透性在40分钟后显示为皮肤内注射区的蓝色染色。用高分辨率彩色摄像机对这些染色位点进行数字化处理，并用ImageJ 1.43(NIH，Bethesda，MD，USA)对图像进行分析。简单地说，将彩色图像(上面板)转换为色调/饱和度/亮度叠加型图像，然后将色调/饱和度/亮度叠加图像分别分解为色调、饱和度和亮度图像。使用阈值工具，只从彩色图像中选择蓝色染色。然后将这些图像与饱和图像相结合，并使用分析工具测量蓝色染色区域的密度值。10.

统计分析

统计分析使用未配对学生的t-两组测试-比较。对于多组比较，我们采用单因素方差分析和后自组织测试，采用Tukey-Kramer多重比较法.价值p < 0.05 was considered to be significant.

白藜芦醇抑制IL-33诱导的肥大细胞活化

首先，我们评估了白藜芦醇在肥大细胞中的细胞毒性。用白藜芦醇处理小鼠骨髓源性肥大细胞(BMMCs)6h，浓度为10-100μM时，AnnexinV染色判断不影响细胞活力。S1a而50和100μM，而不是10μM和25μM对细胞增殖有明显的抑制作用(图1)。S1B)。这些在wst分析中的发现与之前的研究结果是一致的。11...因此，在1-25μM的浓度下，白藜芦醇被用于后续离体学习。

如先前报告所述12，BMMC产生IL-6，IL-13和TNF-α对IL-33的反应(图3).1A)。白藜芦醇预处理在IL-33刺激前1h，以剂量依赖性的方式抑制这些反应(如图1所示)。1A)。这种抑制发生在转录水平(如图所示)。S1C)。胎儿皮肤源性肥大细胞(FSMCs)是小鼠结缔组织型皮肤源性肥大细胞。S1D)，并在FSMCs中观察到类似的结果(如图所示)。1B)。此外，白藜芦醇还能抑制IL-33诱导的嗜碱细胞产生IL-13(图1)。1C).

白藜芦醇抑制IL-33诱导的肥大细胞活化。(A，BIL-6、IL-13、TNF-α在BMMCs培养上清液中的ELISA检测A)及快管会(B)用白藜芦醇处理，1ng/ml rmIL-33作用6h(n=3)。(C白藜芦醇处理人外周血嗜碱性粒细胞，在rhIL-33存在下作用6h(n=3)。(D)小鼠口服白藜芦醇2 h，鼻内注射1μg IL-33 2 4h，qPCR检测气道IL-6和IL-13的表达(n=4-6)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

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小鼠鼻内注射IL-33可增加肺组织中IL-6和IL-13的表达，这种反应依赖于肥大细胞。13,14...口服白藜芦醇可明显抑制IL-33诱导的小鼠肺IL-6和IL-13mRNA的表达。1D)。因此，白藜芦醇可以抑制IL-33介导的肥大细胞的激活。离体和体内.

白藜芦醇不影响IL-33介导的BMMC NF-κB通路的激活

在肥大细胞上，IL-33/st2相互作用激活TAK 1，激活NF-κB和p38通路，导致细胞因子IL-6、IL-13和α的产生。15...我们发现白藜芦醇不影响BMMCs中ST2或IL-33诱导的TAK 1磷酸化的表面表达水平。2A，B)。因此，我们首先研究了白藜芦醇对IL-33诱导的NF-κB通路激活的影响.

白藜芦醇对IL-33介导的BMMC NF-κB通路激活的影响。(A)用白藜芦醇或不加白藜芦醇作用6h的BMMCs中ST2的流式细胞仪分析(n=3)。左边)，并显示了具有代表性的直方图(正确的). (B、C)磷酸化-TAK 1(B)，膦-IKkα/β和膦-p65的westernblot分析C)在25μM白藜芦醇存在或不存在的情况下，用1ng/mlIL-33刺激BMMC 10 min。(D在白藜芦醇存在或不存在的情况下，IL-33或1μg/ml LPS处理BMMCs中，p65与肿瘤坏死因子-α启动子的κB2和αB3区结合的芯片分析(n=3)。(E荧光素酶测定白藜芦醇存在或不存在时，IL-33作用于BMMC中NF-κB的活性(n=3)。*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001.

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Westernblot分析表明，白藜芦醇对IL-33诱导的BMMC中NF-κB亚基p65和磷酸化IKK的表达无明显影响。2C)。与此相一致，芯片分析表明白藜芦醇并不抑制而是增强IL-33诱导的NF-κB与肿瘤坏死因子-α启动子区的结合(TNF-κB2：p65-p65高二聚体识别的序列；TNF-κB3：NF-κB-共识序列，由p50-p65异二聚体识别)。此外，报告分析还显示，白藜芦醇并不抑制，而是增强了NF-κB在BMMC中的转录激活(如图所示)。2D，E).

白藜芦醇通过发挥雌激素受体激动剂的作用，通过抑制NF-κB通路，调节炎症反应。16...雌激素受体拮抗剂ICI 182，780并不能逆转白藜芦醇对IL-33诱导的IL-13和TNF-αmRNA表达的抑制作用。S2)，提示白藜芦醇不触发雌激素受体介导的对骨髓基质细胞NF-κB的抑制作用。

提示NF-κB通路不参与白藜芦醇对IL-33介导的BMMC活化的抑制作用。

白藜芦醇抑制IL-33诱导的BMMC MK2-PI3K-Akt通路的激活

鉴于白藜芦醇不抑制白藜芦醇诱导的bmc中TAK 1和NF-κB通路的激活，我们接下来研究白藜芦醇对MAPK p38通路的影响，特别是p38-mk2/3-pi3k/akt通路，而p38-mk2/3-pi3k/akt通路对IL-33介导的IL-6、IL-13和TNF-α在肥大细胞中的产生起着至关重要的作用。7.

白藜芦醇不影响IL-33诱导的p38和MK 2磷酸化，但对Akt激活(磷酸化)有明显抑制作用。3A)。为了检测白藜芦醇是否抑制mk2的激酶活性，mk2是Akt的上游激酶，在IL-33介导的肥大细胞活化中，我们进行了。离体用重组MK 2蛋白进行激酶分析。离体激酶分析显示，白藜芦醇对MK2激酶活性的抑制作用与p38相比具有剂量依赖性和有效性。3B)，提示MK 2活性可能是白藜芦醇的主要和直接靶点。重要的是，MK 2/3特异性抑制剂PF-3644022对白藜芦醇抑制IL-33诱导的肥大细胞活化有抑制作用：该药物抑制IL-33诱导的Akt磷酸化，抑制BMMC中IL-6、IL-13和TNF-α的产生。3C，D)。如先前所示7PI3K抑制剂LY 294002和Wortmannin抑制IL-33诱导的BMMC产生IL-6、IL-13和TNF-α。3E).

白藜芦醇阻断MK2−PI3K−Akt通路抑制IL-33诱导的肥大细胞活化。(A在25μM白藜芦醇或TAK 1抑制剂5Z-7-Ox存在或不存在时，用1ng/ml IL-33刺激BMMCs中的磷酸化-TAK 1、磷-p38、磷酸-MK2和磷脂-Akt的Westernblot分析。β-肌动蛋白的水平显示在底部作为一个负荷控制.(B) 离体p38和MK2蛋白激酶检测采用p38和MK2阳性对照(n=3)。SB：10μM SB 203580，PF：10μM PF-3644022.(C在白藜芦醇、SB或PF存在或不存在时，IL-33刺激的BMMCs中磷脂-Akt的Westernblot分析长达20 min。β-肌动蛋白的水平显示在底部作为一个负荷控制.(DIL-6、IL-13、TNF-α在白藜芦醇、10 MSB或10μM PF存在或不存在的情况下作用6h。(EIL-6、IL-13和TNF-α在白藜芦醇、5μM LY 294002(LY)或100 NM Wortmannin(WM)存在或无白藜芦醇的情况下作用6h(n=3)。*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001; N.D., not detected.

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值得注意的是，白藜芦醇和PF-3644022联合应用可抑制IL-33诱导的IL-13的表达，而不能抑制IL-6的表达。S3白藜芦醇可能通过靶向MK 2/3以外的其他分子而抑制IL-33诱导的BMMC中IL-13的产生。

弗罗杰多等人...报道了白藜芦醇与PI3K催化亚基p 110α和p 110β的直接结合，并抑制了它们的活性。离体17...为了排除白藜芦醇直接抑制bmc中PI3K活性的可能性，在白藜芦醇存在或不存在时，用干细胞因子(Scf)刺激bmc细胞；scf通过其受体c-kit激活PI3K-Akt通路。18...白藜芦醇不影响SCF诱导的Akt磷酸化。S4)，提示白藜芦醇不直接抑制BMMC中PI3K的活性。

这些结果表明，白藜芦醇抑制MK2(也可能是MK3)的活性，并随后激活PI3K/Akt通路，从而降低BMMC中IL-6、IL-13和TNF-α的产生，尽管白藜芦醇还可能针对MK 2/3以外的其他分子。

白藜芦醇还通过阻断MK2-PI3K-Akt轴来抑制IgE介导的肥大细胞活化。

因为PI3K/Akt通路是IgE介导的肥大细胞激活的关键。19MK 2/3在肥大细胞IgE介导的信号转导中的作用尚不清楚，我们观察了白藜芦醇对BMMC IgE依赖性激活的影响。

如先前报告所述19,20、IgE介导的肥大细胞活化诱导Syk、Gab2、p65、p38和Akt磷酸化。此外，IgE介导的BMMCs激活可诱导MK 2/3磷酸化(图2/3)。4A)，以前没有报告过。白藜芦醇轻度抑制IgE介导的Syk磷酸化，但不影响IgE依赖的Gab2、p65、p38或MK2的磷酸化。4A)。相反，白藜芦醇明显抑制IgE依赖的Akt磷酸化。4A)。与p38抑制剂SB 203580一样，MK2/3抑制剂PF-3644022明显抑制IgE介导的Akt磷酸化。4BMK2/3可能是IgE介导的BMMCs激活中Akt的上游激酶之一。SB 203580和PF-3644022还能阻断骨髓基质细胞中IgE介导的脱颗粒(如表面标记CD 63的水平)以及IL-6、IL-13和TNF-α的产生(如图所示)。4C，D)。我们还证实PI3K抑制剂LY 294002和Wortmannin抑制了BMMCs中IgE介导的脱颗粒和细胞因子的产生。4E、F).

白藜芦醇通过抑制MK2−PI3K−Akt轴抑制IgE介导的肥大细胞活化。(A在25μM白藜芦醇存在或不存在的情况下，对BMMCs中磷Syk、膦-Gab2、磷-p65、磷-p38、磷酸-MK2和磷脂-Akt的Westernblot分析，结果表明，在25 M白藜芦醇存在或不存在的情况下，经抗原刺激20 min。β-肌动蛋白的水平显示在底部作为一个负荷控制.(B在白藜芦醇、锑或PF存在或不存在时，用抗原刺激BMMCs中磷脂-Akt的Westernblot分析可达20 min。β-肌动蛋白的水平显示在底部作为一个负荷控制.(C)在白藜芦醇、10μM SB或10μM PF存在或不存在时，抗原作用40 min的BMMC CD 63的流式细胞术分析(n=3)。(DIL-6、IL-13、TNF-α在白藜芦醇、SB或PF存在或不存在时，抗原作用6h。(E)流式细胞仪分析在白藜芦醇、5μM LY或100 nm WM(n=3)存在或无白藜芦醇的情况下，抗原刺激BMMC中CD 63的作用40 min。(FIL-6、IL-13、TNF-α在白藜芦醇、白藜芦醇、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

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与我们的调查结果一致4，白藜芦醇明显抑制IgE依赖的肥大细胞的激活，这是通过钙内流、脱颗粒和细胞因子的产生来判断的。S5A-D)和小鼠的PCA反应(图一)。S5E，F).

这些结果提示白藜芦醇对IgE介导的BMMCs激活的抑制至少部分归因于抑制MK2/3-PI3K/Akt通路，与抑制IL-33介导的BMMCs激活有关(图一)。5).

白藜芦醇抑制IL-33和IgE介导的肥大细胞活化的机制。白藜芦醇抑制MK 2，在IgE-抗原和IL-33诱导的肥大细胞活化中起重要作用。白藜芦醇还能轻微抑制IgE触发的Syk磷酸化，这有助于白藜芦醇抑制IgE介导的BMMCs活化。

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最近的研究表明，IL-33/ST2相互作用在变态反应性疾病的发生发展中起着重要作用。因此，在免疫细胞中鉴定干扰IL-33/ST2信号转导的化合物具有重要的临床应用价值。白藜芦醇抑制IL-33/ST2介导的肥大细胞活化，以及IgE介导的激活。此外，我们还发现MK 2/3可能是白藜芦醇介导的抑制肥大细胞活化的靶点。这些发现表明，白藜芦醇在预防和治疗广泛的过敏性疾病方面具有潜在的实用价值。

白藜芦醇明显抑制IL-33依赖的IL-6、IL-13和TNF-α的产生。BMMCs是一种不成熟的肥大细胞，FSMC是一种成熟的连接型肥大细胞。这一发现也与从人外周血中分离出的嗜碱性细胞有关，也与小鼠IL-33/肥大细胞依赖的肺炎症有关(图一)。1)。因此，白藜芦醇可以抑制IL-33依赖的肥大细胞(可能也可以抑制嗜碱性细胞活化)。离体和体内.

白藜芦醇不抑制ST2的表达或TAK 1的活化。此外，IL-33介导的IL-6、IL-13和TNF-α的产生也在转录水平受到抑制.因此，白藜芦醇可能通过干扰TAK 1下游和转录机制上游的细胞内信号通路来抑制BMMCs的激活。

IL-33介导的肥大细胞产生细胞因子需要激活NF-κB通路和p38-MK2/3-PI3K/Akt通路。出乎意料的是，白藜芦醇对IL-33诱导的NF-κB通路的激活没有影响，而是增强了.这一结论是基于三个不同的结果：IKK和p65丝氨酸磷酸化，IL-33诱导NF-κB与肿瘤坏死因子-α启动子区结合，以及报告法测定NF-κB转录激活程度。这些发现有些令人惊讶，因为以前的大多数报告都证明白藜芦醇通过多种刺激物，如肿瘤坏死因子-α和脂多糖，明显抑制NF-αB通路的激活。21,22,23,24,25,26,27...另一方面，一些研究报告说，白藜芦醇能刺激多种细胞类型的NF-κB信号传导。28,29,30...因此，白藜芦醇对NF-κB活性的调节可能取决于细胞类型和细胞环境。白藜芦醇如何增强BMMCs中TAK1-NF-κB通路的机制尚不清楚。雅科等人...最近有报道说，活化的mk 2抑制了tk 1上游分子受体相互作用激酶1(Ripk 1)的激酶活性，从而整合细胞存活和细胞因子的产生。31...RIPK 1不仅参与了TNFR信号的调控，而且参与了IL-1R信号的调控。32...因此，MK2介导的RIPK 1负反馈环可能被白藜芦醇阻断，从而进一步激活BMMC中的TAK1-NF-κB通路。

相反，白藜芦醇能明显抑制IL-33诱导的MK2/3-PI3K/Akt通路的激活，而不影响BMMC中p38的激活。MK2/3-PI3K-Akt-p70核糖体蛋白S6激酶通路对IL-33诱导bmMCs和bdc中IL-6和IL-13的表达至关重要。7,33...鉴于白藜芦醇能抑制MK 2的激酶活性，而MK 2/3抑制剂则能抑制白藜芦醇对IL-33诱导的BMMCs活化的抑制作用，白藜芦醇主要通过靶向BMMC的MK 2/3-PI3K/Akt途径抑制IL-6、IL-13和TNF-α的产生。白藜芦醇如何抑制MK 2/3的激酶活性仍有待确定。

请注意，我们使用无细胞系统来研究白藜芦醇对MK 2激酶活性的影响。由于该系统中MK2的浓度可能高于完整细胞中的MK2浓度，因此与使用完整细胞的实验相比，可能需要更大剂量的白藜芦醇。

我们的数据表明，白藜芦醇轻微地抑制IgE介导的Syk磷酸化，正如以前报道的那样(图)。4A)4...因为Syk在肥大细胞中是PI3K的上游34，Syk的去磷酸化也可能参与白藜芦醇抑制IgE介导的Akt磷酸化、脱颗粒和细胞因子的产生。白藜芦醇的广泛作用可能有助于强烈抑制BMMCs的IgE依赖性激活.

有研究表明，白藜芦醇可以抑制IgE介导的脱颗粒和细胞因子的产生，并与抑制或激活多种途径有关，包括γ1、ERK/jnk/p38、Syk、NF-κB和/或ampk/sirt 1。4,5...然而，我们的结果表明，白藜芦醇并不抑制p38的磷酸化或NF-κB通路的激活。2和3)。我们还发现，白藜芦醇(亚细胞毒性剂量)不影响AMPK磷酸化，无论是否有IgE刺激BMMCs，AICAR，AMPK激活剂，不影响IgE介导的Akt磷酸化在BMMCs。这些结果提示白藜芦醇并不通过靶向AMPK而阻断IL-33或IgE介导的BMMCs活化。S6)。此外，我们的结果表明，白藜芦醇能明显阻断bmc中IL-33和IgE介导的Akt磷酸化，而Shirley则明显地阻断了白藜芦醇介导的Akt磷酸化。等人...报道白藜芦醇即使抑制过敏性炎症介质的释放，也不抑制人皮肤肥大细胞中IgE依赖性的Akt磷酸化。35...前两者之间的差异4,5,35目前的发现还不清楚。同样，白藜芦醇对肥大细胞中IgE介导的信号传递的调节可能取决于细胞类型(如原肥大细胞与肥大细胞株、物种差异[小鼠、大鼠和人类])、细胞背景(如分化或激活状态)以及刺激和分析方法(如抗原与FCεRI交联、治疗时间、分析时间等)。

白细胞介素33对肥大细胞的急性暴露促进细胞因子的表达和fcεRI触发的脱颗粒。36,37...由于其对肥大细胞(和2型先天淋巴样细胞)的急性作用，IL-33被认为在变态反应性疾病的发病机制中起着至关重要的作用。相反，长期接触IL-33可减少抗原触发的肥大细胞活化，作为对慢性alarmin暴露的反馈。38,39,40,41提示IL-33可能在慢性条件下对肥大细胞的激活具有保护作用。本研究显示白藜芦醇对IL-33对肥大细胞急性激活的抑制作用。白藜芦醇是否不仅影响肥大细胞的急性反应，而且影响其对IL-33的慢性反应，仍有待确定。