帮助赋予CD8 + 具有内禀记忆能力的T细胞 来确定CD4 + T细胞在启动过程中提供的帮助对CD8的影响 + T细胞记忆，采用小鼠治疗性免疫模型。用两种编码人乳头瘤病毒(Hpv)e7蛋白的质粒(P)dna疫苗建立了一个比较环境，该疫苗要么带有免疫显性的mhcⅠ类限制性表位E7。 48-57 单独(无帮助)，或与外源性HPV-无关的MHCⅡ类-限制性辅助表位(帮助) 21 ...如前所述 20 , 21 , 22 ，在疫苗中加入辅助表位显着地增加了原h2d的数量。 b /E7 48-57 (E7)-特异性CD8 + T细胞反应(图1. 1A ，补充图。 1A，B )。HELP还显著增加了e7特异性CD8的总数。 + 具有SLEC表型的T细胞(CD 127) - KLRG 1 + )，以及那些具有MPEC表型的人(CD 127) + KLRG 1 − )(附图。 1C ).
图1 CD4 + T细胞帮助将内在的回忆能力注入到CD8中。 + T细胞 a – f 在第0、3、6天，用编码HPV-E7基因的DNA结构(HPV-E7)和(无帮助)MHCⅡ类限制性表位对小鼠进行表皮内免疫。第50天，小鼠再接种无帮助疫苗和免疫球蛋白(I.P.)。脂多糖(LPS)注射液。(A)H-2D的百分比 b /E7 49-57 四聚体 + CD8细胞总数 + 第一次接种疫苗后第一天血液中的T细胞( n =每组7人)。 b , c 在另一个实验中，在重新挑战后的第10天，颗粒酶B(GZMB)的频率。 + 细胞(B)与干扰素γ + 肿瘤坏死因子α + CD8中的细胞(C) + 流式细胞仪检测组织中T细胞的表达。 n =3-4)。 d , e 在另一个实验中，老鼠( n =3)第10天腹腔注射E7负载1：1的脾细胞。 49-57 肽(CTL靶)或非(对照)，分别用低剂量或高剂量羧荧光素琥珀酰酯(CFSE)标记。以单纯受体小鼠为对照。15h后，用脾细胞流式细胞仪测定特异性靶细胞杀伤率。 d CFSE代表直方图 + 细胞。 e 条形图定量描述所有结果。 f 在另一个实验中，E7特异性CD8 + 在再刺激后第10天从脾脏中分离T细胞。 n =3)。T细胞与E7的比例为1：1。 49-57 -肽负载脾细胞和非负载脾细胞，12h后对靶细胞进行特异性杀伤分析。 g – i CD45.1 + 供体小鼠接受帮助或无帮助疫苗。第100天，E7特异性(记忆)CD8 + 将T细胞从脾脏中分离出来，注射静脉注射。等号改为CD45.2 + 接受者小鼠( n =每组4人)。一天后，受体小鼠再次受到挑战。 g 实验装置。 h 显示CD45.1频率的有代表性的流式细胞术图 + E7-特异性CD8 + 再刺激后第11天血T细胞。 i CD45.1频率 + E7-特异性CD8 + 免疫后第一天血T细胞。图中的数据来自至少两个实验的一个实验。错误条指示SD，* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 (unpaired two-tailed Student’s t 测试)。源数据作为源数据文件提供。
探讨启动过程中给予帮助对记忆CD8的影响 + T细胞反应，小鼠接种帮助疫苗或无帮助疫苗，与I.P.联合使用无帮助疫苗。注射脂多糖(LPS) 22 ...用帮助疫苗启动的小鼠对H-2D的回忆反应明显增强。 b /E7 48-57 比用无帮助疫苗注射的老鼠要好(见图)。 1A )。在第二反应的高峰期，CD8的频率。 + 表达颗粒酶B的T细胞。 1B )、干扰素γ和肿瘤坏死因子α(图1)。 1C 在血液中，引流淋巴结(DLN)和脾脏与无帮助疫苗相比有显着性差异(P<0.05)。因此，体内细胞毒性试验显示-在第二反应的高峰期-注射了E7。 49-57 肽负载的目标细胞在用帮助疫苗启动的小鼠中比用无帮助疫苗启动的小鼠中更有效地被杀死(如图所示)。 1D，e )。因此，CD4 + 启动过程中提供的T细胞帮助改善第二次CD8 + T细胞对MHCⅠ类限制性抗原的反应。
次级CD8 + T细胞的反应可能会得到改善，因为帮助信号会导致E7的数量增加。 48-57 -特异性记忆CD8 + T细胞和/或改善其细胞内禀能力进行二次反应.在体外，在启动过程中获得帮助的二级应答者CTL比相同数量的辅助应答者CTL能更有效地杀死靶细胞(图1)。 1F )，认为帮助信号改善了每个单元的记忆ctl功能。为了进一步验证这一点，我们进行了一个过继转移实验。记忆CD8 + 从接种了帮助疫苗或无帮助疫苗的小鼠中分离出的T细胞被同样数量地转移到天真的受体小鼠身上，这些小鼠随后受到无帮助疫苗的攻击(图一)。 1g )。记忆CD8 + 从接种帮助疫苗的小鼠中分离出的T细胞比无帮助疫苗的小鼠扩增得更多(见图)。 1H，I )。因此，CD4 + T细胞在启动过程中传递到记忆中的帮助 + T细胞-CD4的内在能力 + T细胞辅助-独立的二次扩张和细胞毒性效应功能的显示。
帮助支持CD8 + T 埃姆 和T 厘米 形成与维护 接下来我们在相同的疫苗接种条件下测试 + T细胞帮助影响CD8的建立和维持 + T 埃姆 和T 厘米 次级淋巴组织和血液中的亚群体。E7特异性CD8的频率 + T细胞 埃姆 表型(CD 44) + CD62L − )和一个T 厘米 表型(CD 44) + CD62L + )流式细胞仪检测。在第50天，E7特异性T的频率 埃姆 CD8细胞总数 + DLN中的T细胞在无帮助疫苗接种后明显低于接种帮助疫苗后(见图)。 2A，b )。在同一时间点，E7特异性T的频率无显着性差异。 厘米 两种疫苗接种环境中的细胞(如图所示)。 2A，b )。然而，在第120天，两种E7特异性T的频率 埃姆 细胞与T 厘米 无帮助疫苗接种后细胞数显著低于接种后细胞数(见图)。 2B )。同样地，在脾脏中，只有T 埃姆 无帮助疫苗接种后的细胞池明显小于第50天帮助接种后的细胞池(图一)。 2C，d )，而在第120天，两者都是T 埃姆 和T 厘米 无帮助接种后的池明显小于接种后的帮助(图1)。 二维空间 ).
图2 CD4 + T细胞帮助支持CD8的形成 + T 厘米 和T 埃姆 细胞。 a – f 老鼠( n (每组4例)分别于第0、3、6天接受帮助或无帮助疫苗，并于第50或120天进行分析。 a , c , e 有代表性的流式细胞仪图显示在H-2D中 b /E7 49-57 四聚体 + CD8 + 具有效应记忆T(T)的细胞的总体频率 埃姆 )表型(CD 44) + CD62L − )或中央存储器T(T) 厘米 )表型(CD 44) + CD62L + )，在引流淋巴结(DLN)( a )、脾脏( c )和血( e ). b , d , f E7特异性CD 44频率的定量研究 + CD 62 - T 埃姆 和CD 44 + CD 62 + T 厘米 表型CD8 + DLN中的T细胞( b )、脾脏( d )和血( f ). g , h 流式细胞术检测E7特异性CD8细胞表面IL_2RB(CD 122)的表达 + T 厘米 和T 埃姆 第50天脾脏细胞亚群。 g 主要数据。填充灰色：没有帮助；打开黑线：帮助。虚线：未染色的控制。 h 平均荧光强度(MFI)的量化 n =3。 i 实验装置。CD45.1 + OT-I T细胞过继转入CD 45.2 + 接受者小鼠( n =每组5例)1天后接受OVA编码的帮助或无帮助疫苗。从第20天起，每5天用一次同工型控制抗体或中和αIL-15抗体，至第50天。 j , k CD45.1频率 + T 厘米 细胞( j )和T 埃姆 细胞( k )于第100天测定DLN和脾脏。图中的数据来自两个实验中的一个实验。错误条指示SD，* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 (unpaired two-tailed Student’s t 测试)。源数据作为源数据文件提供。
T 埃姆 细胞通过血液和次级淋巴器官循环。 4 , 5 相应地，帮助对T大小的有益影响 埃姆 血液中的细胞池在第50天和第120天都是明显的(如图所示)。 2E，f )。在这两个时间点，T的频率 厘米 血液中的细胞数量很低，这与它们对次级淋巴器官的优先定位是一致的。 4 , 5 (无花果) 2E，f )。在骨髓中，T 埃姆 与第50天的帮助人群相比，无助人群的频率有所降低，这种差异在第120天更为显著(补充图1)。 2A，B )。接下来我们研究了CD4的作用。 + T细胞有助于记忆CD8的生成 + T细胞亚群在一个明显的炎症模型。小鼠感染急性淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)阿姆斯特朗株，并耗尽CD4。 + T单元格(不帮助)或不帮助(帮助)。在感染后第50天，我们分析了GP 33-和NP 396特异性T的频率。 埃姆 和T 厘米 脾脏中的细胞。类似于疫苗接种模型，HELP导致两种病毒特异性记忆子集的频率增加(补充图)。 2C )。因此，CD4 + T细胞启动过程中的帮助改善CD8的生成 + T 埃姆 人口与长期维持两种CD8 + T 埃姆 和T 厘米 人口。
记忆CD8 + 已知T细胞经历由IL-15驱动的不依赖抗原的稳态增殖。 23 ...免疫后第50天，IL-2和IL-15受体的共同β链IL2RB(CD 122)在HELP细胞表面的表达水平明显高于无助的E7特异性T。 厘米 细胞，在DLN和脾脏中(见图)。 2G，h )。在T 埃姆 然而，“帮助”并不影响IL2RB的细胞表面表达。 2G，h )。这些数据表明IL-15受体信号在维持T中起着重要作用。 厘米 帮助免疫后的DLN和脾脏细胞。为了验证这一点，我们用抗IL-15的中和抗体进行了干预实验.卵子 257-264 /H-2K b -特异性OT-I T细胞转入CD 45.2。 + 接受治疗的老鼠接受或没有帮助疫苗编码OVA 257-264 表位初步反应显示帮助对OT-I T细胞反应的影响(补充图)。 二维空间 )。接下来，从第20天到第50天，用控制抗体或抗IL-15中和抗体治疗小鼠(如图所示)。 2I )。在第100天，T的大小 厘米 和T 埃姆 测定DLN和脾脏细胞池。IL-15中和大大减少了T的大小。 厘米 帮助接种后的细胞池，但不影响T。 厘米 无帮助接种后的细胞池(见图)。 2J )。T 埃姆 DLN和脾脏中的细胞群在接种疫苗后不受IL-15中和的影响(图1)。 2K )。这些数据表明，启动过程中传递的帮助信号导致CD8上IL2RB的上调。 + T 厘米 细胞，这很可能增加他们的能力，以IL-15驱动的长期生存在体内。同样的帮助信号明显促进CD8的长期存活。 + T 埃姆 细胞由IL-15独立的机制。
帮助主要影响T的转录组 埃姆 细胞 了解CD4的分子机制 + T细胞有助于改变稳态CD8的细胞固有功能。 + T 埃姆 和T 厘米 我们对细胞进行了基因表达谱分析。E7-特异性记忆CD8 + T 埃姆 和T 厘米 流式细胞术在第100天从接受帮助或无帮助疫苗的小鼠脾脏中分离出mRNA，并进行测序(RNAseq)。这个无偏见的全基因组分析揭示了CD4 + T细胞帮助影响T细胞 厘米 细胞比T小得多 埃姆 细胞(图1. 3A，b )。在T 厘米 细胞，我们发现只有193个基因具有显着的差异表达之间的比较组(图)。 3A ；补充数据 1 )，但在T中 埃姆 细胞，我们发现了2522个差异表达的基因。 3B ；补充数据 2 )。重要的是，在后一种情况下，影响的大小也更大。这一点得到了层次聚类和结果热图的检查的证实，表明T 埃姆 由于CD4的作用，细胞的基因表达谱发生了很大的变化。 + T细胞帮助，而T细胞 厘米 细胞这样做的程度要小得多(如图所示)。 3C ).
图3 CD4 + T细胞主要帮助改变T的稳态转录组 埃姆 CD8 + T细胞 a , b 描述稳态E7特异性CD8比较转录组分析结果的火山图 + T 厘米 细胞( a )和T 埃姆 细胞( b )第100天从脾脏中分离出来，用帮助疫苗或无帮助疫苗进行一次免疫接种( n =每组3只)。蓝色和黄色点表示有显著差异表达的转录本( p < 0.01). See also Supplementary Data 1 和 2 . c 稳态T中差异表达基因的层次聚类和热图 埃姆 和T 厘米 从“帮助”和“无帮助”疫苗设置中提取的单元。 d 分子在稳态T中的差分表达 埃姆 帮助后的细胞与无帮助的疫苗接种后的细胞，被指定为指定的功能类别，并由IPA注释以进行亚细胞定位。 e 已发表基因集的基因集富集分析(GSEA)列出效应细胞CD8 T细胞前200个上调或下调基因(LCMV-Armstrong感染后第8天) 30 帮助与无助T的基因表达谱 埃姆 细胞处于稳定状态。ES，富集评分；NES，标准化富集评分。 f 稳态T中差异表达基因的层次聚类和热图 埃姆 用帮助或无帮助疫苗在第100天提取的细胞，如此处所确定的，以及在第10天从相同环境中获得的基因差异表达的基因，如先前所确定的那样 20 ...数字和相邻的方框(右面板)表示簇1，表示分子在帮助和无助的T中的差异表达。 埃姆 细胞和原代CTL及簇2，仅表示分子在HELP和无助T中的差异表达 埃姆 细胞，指定为指定的功能类别，并由iPA注释以进行亚细胞定位。
独创性路径分析(IPA)提供了许多分子的洞察力，这些分子在“帮助”和“无助的T”中有不同的表达 埃姆 细胞(图1. 三维空间 )。表达增加的基因包括编码转录因子Tbet( Tbx 21 )，Blimp-1( Prdm 1 )，RUNX 1和Id2，已知参与CD8 + T细胞效应功能 6 ...此外，转录因子Tcf-1( Tcf7 )和TOX( 毒理 )，与CD8减少有关。 + T细胞效应功能与耗竭表型 24 , 25 , 26 ，在T中被下调。 埃姆 CD4细胞 + T细胞帮助。编码细胞毒性效应分子颗粒酶A，颗粒酶B的转录本 格兹马湾 )、穿孔素( Prf 1 )、干扰素γ、Fas配体( 法斯格 )和Trail( Tnfsf 10 )被上调，表明细胞毒性潜力增加。编码IL-2受体α链的转录本( 伊利拉 )，IL-12受体β链( IL12Rb1，2 )和IL-18受体α链( IL18r1 )与记忆T细胞的存活和功能相适应。 2 , 27 , 28 ...几种趋化因子受体转录本被上调，包括 CX3CR1 我们以前发现的CD4 + T细胞在效应CTL中的帮助 21 ...其他有趣的特性包括PyCard(ASC)、Caspase-1( 卡斯普-1 )和Nod样受体( Nlrc 3，5 )可以一起创建“炎症体”结构，从而导致亲IL1β处理。 29 ，这意味着一种天生的帮助T型警报状态。 埃姆 细胞。
这些发现表明T 埃姆 细胞比没有帮助的细胞有更多的效应器样表型。为了检验这一点，我们用基因集富集分析(GSEA)的帮助和无帮助T进行了比较。 埃姆 效应因子CD8基因表达谱对已发表基因表达谱特征的影响 + T细胞 30 ...该基因集由效应因子(第8天)和记忆(>30天)病毒特异性CD8中的前200个上调和下调基因组成。 + 急性LCMV-Armstrong感染后分离的T细胞。效应细胞CD8 + T细胞基因集确实在帮助稳定状态T的表达谱中得到丰富。 埃姆 细胞(图1. 3E )，表明在这个种群中具有更多的效应器样表型。
检查是否对T有帮助 埃姆 细胞在稳态记忆阶段分离，类似于帮助ctl，在主效应阶段分离，我们对由于帮助在初级ctl或T中的差异表达的所有基因进行了分层聚类。 埃姆 细胞。这些基因中有许多在帮助初级CTL和帮助T中都有差异表达。 埃姆 细胞(图1. 3F ，第1和第4组)，表明在主效应器中看到的部分帮助签名保持在稳态T中。 阿姆。 其他因帮助引起的基因表达差异在T中更为明显。 埃姆 细胞比原代CTL中的细胞(图1)。 3F ，第2组和第3组)。这包括上调各种杀伤细胞凝集素样受体(趋化因子受体cx)的转录本。 3 CR1和细胞因子受体：IL2R，IL12R和IL18R。 3F )。综合起来，这些结果表明，除了增加T的大小 埃姆 池，CD4 + 在启动过程中提供的T单元帮助也会创建一个T。 埃姆 具有独特的，更有效应器性质的种群。
帮助促进CD8的先天记忆功能 + T细胞 T的转录组数据 埃姆 细胞暗示，帮助记忆细胞提高了对IL-12和IL-18的敏感性，因为这些细胞因子的受体被上调了(如图所示)。 3F )。据报道，联合白细胞介素-12和白细胞介素-18联合刺激可恢复记忆的CD8。 + T细胞以非特异性抗原的方式，使其发挥效应作用。 2 , 27 , 28 ...因此，我们测试帮助是否创造了这种类型的先天记忆。为此，我们生成了OVA特异性CD8。 + 记忆T细胞通过过继转移的OT-I T细胞和接种OVA编码的帮助或无帮助疫苗(图)。 4A )。第100天，IL-18Rα链的细胞表面表达(如图所示)。 4B )和IL-12Rβ链。 4C 在DLN、脾脏和血液中，帮助组的OT-I T细胞明显高于无助记忆组(P<0.05)。为了检测固有的回忆功能，在体外用IL-12和IL-18刺激DLN和脾脏的稳态记忆OT-I细胞。记忆细胞产生干扰素γ的频率(图)。 4D，e )或颗粒酶B。 4F )与无助人群相比，被救助群体的数量显著增加。这一特征是记忆OT-I细胞的特征，而不是幼稚的细胞.在同源抗原(SIINFEKL)的体外刺激下，在帮助记忆群体中，IFNγ产生OT-I细胞的频率高于无助或幼稚群体(图1)。 4G ).
图4 CD4 + T细胞帮助促进记忆CD8的先天回忆功能 + T细胞 a 实验装置。CD45.1 + OT-I T细胞过继转入CD 45.2 + 接受者小鼠( n (每组5例)1天后接受OVA编码的帮助或无帮助的PDNA疫苗。免疫后第100天，血液和CD 45.1进行流式细胞术检测。 + 流式细胞术从DLN和脾脏中分离OT-I T细胞，与IL-12、IL-18或OVA肽直接分析或孵育5h。未接种疫苗的小鼠被用于分离幼稚的OT-I T细胞. b 具有代表性的流式细胞仪(左面板)及CD 45.1内IL18-Rα表达率 + 指指器官中的OT-I细胞(右面板)。 c 在CD 45.1上表达的IL-12Rβ的代表流式细胞图(左面板)和MFI + 靶器官中的OT-I T细胞(右面板)。 d – g 主要流式细胞仪数据( d )和产生干扰素γ的频率( e , g )或颗粒酶B(GZMB)产生( f IL 12+IL-18(D-F)或OVA肽(SIINFEKL)体外刺激DLN和脾脏的OT-ⅠT细胞。 g ). h 实验装置。CD45.1 + OT-I T细胞过继转入CD 45.2 + 接受者小鼠( n (每组5例)1天后接受OVA编码的帮助或无帮助的PDNA疫苗。第50天，用编码E7基因的帮助疫苗再次攻击小鼠，每3天注射一次同类型对照或中和抗IL-12单克隆抗体4次。免疫后第10天，用GolgiPlug(不添加细胞因子或抗原)孵育总DLN和脾细胞5h。 i 干扰素γ产生CD45.1的频率 + 从指示器官分离的T-I T细胞。 j 脾分离细胞的典型流式细胞术分析。数据来自一个实验，代表两个实验。错误条指示SD，* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 (unpaired two-tailed Student’s t 测试)。源数据作为源数据文件提供。
我们还在体内测试了是否帮助信号优化记忆c88。 + T细胞对抗原无关，先天反应。为此目的，将OT-I T细胞转移到受体小鼠，然后接种OVA编码的帮助疫苗或无帮助疫苗。50天后，这些小鼠接种HPV-E7编码的帮助疫苗。 4H )。在这种情况下，CD4 + T细胞反应是抗原特异性的记忆反应，因为在编码DNA疫苗的OVA和E7中存在相同的辅助表位。记忆CD8 + 疫苗接种后形成的t细胞可被CD4生成的细胞因子(如IL-12和IL-18)以不依赖抗原的方式召回。 + T细胞激活DC。为了检测IL-12的作用，在回忆时注射中和抗IL-12mAb.在二次免疫后第10天，非同源回忆时产生干扰素γ的记忆OT-I T细胞的频率在帮助组显著高于无助组(图1)。 4i，j )。此外，中和αIL-12抗体可显著降低OT-ⅠT细胞对干扰素γ的产生，但不影响无助细胞的应答(图一)。 4i，j )。最后，CD4的传递 + 启动过程中T细胞的帮助产生记忆CD8 + T细胞具有与生俱来的回忆能力，在没有同源抗原的情况下，能在细胞因子的刺激下产生颗粒酶B和干扰素γ。
帮助记忆CD8 + t细胞在被召回时是不起帮助作用的。 我们之前已经确认了分子程序通过cd4注入初级ctl效应。 + T细胞帮助 20 ...在这里，我们检查了哪些转录程序在记忆CD8中展开。 + T细胞在抗原再次攻击后，在启动过程中提供帮助。曾接种过帮助疫苗或无帮助疫苗的小鼠再次受到无帮助疫苗的攻击。重充后第10天，E7特异性CD8 + 从脾脏中分离T细胞，进行转录分析。标准化转录读计数的统计分析显示1315个基因的差异表达(图一)。 5A ，补充数据 3 )。在这些基因中，391个基因的差异表达也是由于在初级CTL反应中的帮助(补充数据)。 4 )。我们以前描述过许多这些转录本是帮助型CTL的特征的一部分，并就其中的一些说明了它们在决定CTL在肿瘤模型中的细胞毒性和迁移潜能方面的重要性。 20 ...部分特征是编码细胞毒性效应分子的转录本( IFNG，Gzma，Gzmb )，效应器标记KLRG 1( Klrg 1 )，转录因子Tbet( Tbx 21 )，IL-2、IL-12和IL-18的受体( Il2ra，Il12 rb，Il18r )和趋化因子受体CX3CR1( CX3CR1 )那些都是由于帮助而被抬高的(如图所示。 5B )。此外，编码共抑制受体PD-1、LAG 3、BTLA、CD 200(R)的转录本 Pdcd 1，LAG 3，BTLA，Cd 200，Cd200r )和转录因子Eomes，ID3Tcf7，TOX( Eomes，ID3，Tcf 7，Tox )都与CTL功能障碍有关 31 在初级和次级反应中，“帮助”CTL也同样被下调(图1)。 5C )。在二级反应中，HELP和NOHELP条件下的基因表达差异更为明显(图2)。 c. )。因此，CD8 + 在启动过程中接受帮助的T细胞在回忆后获得了采用辅助基因表达程序的内在能力。
图5 帮助记忆CD8 + T细胞仅在MHCⅠ类限制性肽回忆后表达帮助标志基因.如图所示，小鼠接受了一次帮助疫苗或无帮助疫苗接种，并在第50天用无帮助疫苗+LPS被召回。 1A ...在二级反应的第10天，E7特异性CD8。 + T细胞以流式细胞术从脾脏分离( n (3)对样品进行RNAseq处理。 a 火山图描述了帮助和无助的次级效应的比较转录组分析的结果。蓝色和黄色点表示两组之间有显著差异表达的转录本( p < 0.01) See also Supplementary Data 3 . b , c 在主应答的帮助和无帮助设置中差异表达的多个标记基因mRNA表达的折叠变化(1) o )，如以前所确定 20 或辅助反应(2) o )，如这里所确定的。 d 在稳态T中差异表达的基因与无帮助组的分层聚类 埃姆 (无花果) 3 )，小学(1 o )CTL 20 或中学(2 o )CTL( a )。某些已知或怀疑功能相关或诊断相关的基因被注释。 e 对数相关性 2 帮助与无助T中差异表达基因mRNA表达的双重变化 埃姆 细胞和原代细胞(1 o )CTL(左面板)或次(2) o )CTL(右面板)。错误条指示SD，* p < 0.05 (unpaired two-tailed Student’s t 测试)。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们比较了Help T的基因表达谱。 埃姆 辅助原代和次级效应细胞。差异表达基因的递阶聚类结果表明，Help次级效应基因的表达谱与T相似。 埃姆 在启动过程中得到帮助的细胞(图)。 5D )。在帮助和无帮助环境中差异表达基因的折叠变化在T之间是相关的。 埃姆 种群和主要效应因子之间的相关性更强 埃姆 细胞和次级效应物(图1. 5E )。这些发现表明，助力的次级效应主要来自于助力T。 埃姆 细胞。
总之，这些数据表明CD4的传递 + T细胞在启动过程中的帮助有利于T的形成 埃姆 保持帮助印记的单元格 20 并且仅能用MHCⅠ类限制性肽表达帮助、更强的初级效应的程序特征。
帮助记忆细胞显示表观遗传印记 上面概述的数据表明，记忆CTL“记住”，它们在启动过程中得到了帮助，因此在回忆之后是独立的。我们描述了帮助和无助的稳态记忆CTL的表观遗传状态，以检验这一潜在的表观遗传基础。以CD8和H-2D为基础，从脾脏中分离出细胞。 b /E7 48-57 -免疫后第100天四聚体染色。鉴于回收的细胞数量较少，我们使用超低输入协议进行天然染色质免疫沉淀(ULI-nchip)。 32 ，抗H3K4me3和H3K27me3抗体。这两个组蛋白标记表征了允许和抑制的染色质状态，分别有利于和不利于基因转录。 33 ...H3K4me3和H3K27me3分别为H3K4me3和104758个H3K27me3峰(FDR<0.0 1)。主成分分析(PCA)表明，这些CTL群体对两个表观遗传标记都有不同的图谱(见图)。 6A ).
图6 启动过程中提供的帮助在稳态记忆细胞中留下了表观遗传印记。老鼠( n =每组3人)在第0、第3和第6天接受帮助或无帮助疫苗。在第100天，E7特异性记忆CD8。 + 从脾脏分离T细胞，用抗H3K4me3和H3K27me3抗体进行ChIPseq分析。 a 描述ChIPseq分析结果的PCA图。 b , c 描述H3K4me3所指定的差异修改区(DMRs)的火山图( b )或H3K27me3( c )标记。蓝点和红点表示DMR有显著差异(FDR<0.05)。 d H3K4me3在帮助记忆E7特异性CD8中的差异修饰 + T细胞，按功能分类，用iPA标注亚细胞定位。 e , f 助力T型与非辅助型T细胞mRNA表达差异的相关性研究 埃姆 ( e )和T 厘米 ( f )TSS上游基因体和区域的细胞和组蛋白甲基化最大为1kb。H3K4me3和H3K27me3的归一化标记相对于平均标准化mRNA表达值显示在HID和非帮助T中。 埃姆 ( e )和T 厘米 ( f )细胞(如图所示。 5 ).
我们发现了H3K4me3和H3K27me3沉积量显著不同的H3K4me3和H3K27me3沉积量显著不同的帮助或无助记忆CTL染色质的一致峰(FDR<0.05)。 6B，c ，补充数据 5 , 6 )。这些差异修饰区(DMRs)被注释到最近的转录起始点(Tsss)。在帮助记忆CTL的H3K4me3标记中显著富集的基因被IPA指定为顶级功能类别(z-评分>2)“刺激T淋巴细胞”、“细胞毒性”和“淋巴细胞激活”(图)。 6d )。表观遗传标记与先前定义的Help基因表达程序一致。 20 在帮助记忆单元中打开，如 IFNG，Gzma Gzmb，Prf 1 编码细胞毒性效应分子和转录因子的基因 Tbx 21和Prdm 1 (无花果) 6d )。H3K4me3沉积与H3K4me3在帮助与无助稳态T中的差异mRNA表达正相关 埃姆 和T 厘米 H3K27me3沉积与这些群体的差异mRNA表达呈负相关(图一)。 6E，f )。这些数据表明CD4 + T细胞帮助导致表观遗传改变，使记忆CTL在没有帮助信号的情况下在稳态和回忆后显示出帮助表型。
