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免疫酶染色法

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发表时间:2019-11-22 11:25作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

免疫酶染色法

(一) 原理免疫酶染色法亦称免疫酶标组织化学法。标本制备后,首先将

其内源酶抑制,接

着即可进行免疫酶染色检查。常规的免疫酶染色法可分为直接法和间接法两种。前者固定标

本中的抗原直接与酶标抗体结合,达到酶染色目的;后者是抗原先与其抗体(第一抗体)结合

后,再与酶标抗体(第二抗体)结合,而进行酶染色的。免疫酶染色法的酶底物产物为不溶性

物质,可沉着于抗原上,使其显色。间接法虽然多一步骤,但使用范围广。此外,酶标记第

二抗体可用酶标记SPA或生物素与亲和素系统等代替。

(二) 材料和方法(以检测空肠弯曲菌为例)

1 材料

(1) 去除内源性酶试剂:1%H2O2甲醇溶液。

(2) 空肠弯曲菌免疫血清(第一抗体):CjC37(鸡源)和CjP5(猪源)抗血清,自

制。(3) 驴抗兔IgHRP(第二抗体):自制。

(4) 稀释液与洗液(pH值74 PBS)。

(5) 底物溶液(DABH2O2):

①TrisHCl缓冲液(pH值76,005mol/L)。

②底物溶液,3,3二氨基联苯胺50mg、TrisHCl缓冲液100ml、过滤,4℃冰箱保存。用

前加H2O2,最终浓度为03%。

2 方法

(1) 标本制备:将疑似空肠弯曲菌病料或其培养物涂片,干燥,然后置除去

内源性酶试剂中处理及固定10min。

(2) 冲洗:用PBS冲洗1次,沥干。

(3) 加抗血清:用稀释液对CjC37或CjP5抗血清(针对同源菌)作1∶160稀释,

滴加在玻片上,置37℃于湿盒内孵育30min。

(4) 洗涤:3次。

(5) 加酶标记抗体:用稀释液对驴抗兔IgGHRP作1∶500稀释,滴加于玻片

上,置37℃于湿盒内孵育30min。

(6) 洗涤:3次。

(7) 滴加底物溶液:室温作用20min,用自来水冲洗,终止反应,干燥,光学

显微镜检查。

(三) 结果判定凡菌体被染成棕色或褐色,且形态弯曲者,均判为空肠弯

曲菌阳性;凡2~3个视野中,未发现被着色的弯曲形菌体或被鉴定菌不着色,均判为空肠弯

曲菌阴性。

(四) 注意事项

1 涂片后,为了防止玻片上的标本面反置和号码混乱,应用一小片橡皮膏贴于玻片一端,

并用铅笔编号。

2 滴加酶染色试剂时,玻片应沥干,并且各试剂滴加的量不宜过多,以防溢出。

3 孵育时,温箱内需放一水槽或将玻片置湿盒内孵育,防止酶染色试剂蒸发或干燥。


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