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斑点-酶联免疫吸附测定法

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发表时间:2019-11-22 11:23作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

斑点酶联免疫吸附测定法

斑点酶联免疫吸附测定法(DotELISA,DELISA)是以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中

用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。DELISA不仅保留了常规ELISA的优

点,而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足,所以具有敏感性高,特异性强,被检

样品用量少,节省材料,不需特殊仪器,结果判定简单易行和便于长期保存等特点。因此,

该法自问世以来,以其独特的优势,广泛应用于抗原抗体的检测和杂交瘤细胞的筛选等。

(一) 原理DELISA的基本原理与常规ELISA和免疫酶染色法基本相同,即

将抗原或抗体首

先吸附在纤维素薄膜(如硝酸纤维素膜,NC)表面,并保持其免疫活性,通过与相应的抗体或

抗原和酶标记物的一系列免疫反应,形成酶标记抗原抗体复合物,在底物的参与下,结合物

上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质,沉着于抗原抗体复合物吸附的部位,呈

现出肉眼可见的颜色斑点。试验的结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。

DELISA常用的检测方法有直接法、间接法、双抗体夹心法、双夹心法和竞争法等。

(二) 材料和方法(以快速诊断口蹄疫为例)

1 材料

(1) 载体:硝酸纤维素膜022~045μm,Schleiche & Schucll或国产;混

合硝酸纤维素膜022μm,上海医药工业研究院生产。

(2) 保温液及洗涤液:保温液为含01%BSA、005%Tween20 PBS(001mo

l/L,pH值74);洗涤液为005%Tween20 PBS。

(3) 封闭剂:含1%BSA或4%蛋清或3%白明胶的PBS。

(4) 口蹄疫单抗:口蹄疫病毒A型单克隆抗体(AFMcAb)、O型多克隆抗体(OF

PcAb,由O型标准病毒免疫BALB/c鼠制得),由新疆畜牧科学院兽医研究所提供。

(5) A、O、C、ZB型口蹄疫标准抗原:由兰州兽医研究所提供。

(6) 冻干辣根过氧化物酶标记兔抗BALB/c鼠抗体:卫生部生物制品研究所生

产。

(7) 底物溶液:3,3二氨基联苯胺50mg,005mol/L、pH值76 TrisHCl

缓冲液100ml,溶解后过滤,4℃避光保存。临用前按003%加入H2O2。

(8) 被检抗原的制备:水疱液可直接点样。水疱皮用生理盐水洗净,晾干,

称重,剪碎,加中性玻璃砂研磨,用生理盐水制成1∶5~1∶10悬液,室温浸泡2h,振摇后

1 500~2 000 r/min离心10min,上清液即可用于点样。

2 方法DELISA间接法程序

(1) 压迹:根据样品的数量剪取一片硝酸纤维素膜或混合纤维素膜。用直径3

5mm圆形打孔

(琼脂平板打孔器),在膜的光滑面按顺序压上痕迹,作为点样部位。将膜置蒸馏水中浸

泡,待完全浸湿后,取出室温自然干燥。

(2) 点样:用微量移液器分别吸取1~2μl(或用玻璃棒、毛细管蘸一滴)被检

抗原液,滴于

圆圈内,自然干燥。为增加抗原吸附量,也可在点样干燥后,再进行第二次点样。同时作阴

、阳性抗原对照。

(3) 封闭:将膜置平皿或小池内,加入封闭剂,37℃浸泡30~60min。取出稍

置片刻,用洗液漂洗2次,晾干。

(4) 与AFMcAb或OFPcAb反应:用保温液对AFMcAb或OFPcAb作适当稀

释,加入反应池中,于37℃覆盖膜2h。

(5) 洗涤:用洗涤液漂洗膜3次,每次3min,晾干。

(6) 与酶结合物反应:冻干辣根过氧化物酶标记兔抗BALB/c鼠抗体用保温液

1∶80稀释,37℃覆盖膜1h。

(7) 洗涤:3次,方法同上。

(8) 显色:将膜浸入底物溶液中,避光染色5~15min。

(9) 终止反应:用蒸馏水漂洗滤膜,晾干。

(三) 结果判定在阴、阳对照正常情况下,以在膜圆圈内出现棕色斑点为

阳性,无色为阴性。膜干燥后,可长期保存。

在应用DELISA间接法、双抗体夹心法等检测方法时,如果膜上包被的是已知的标准抗原或

抗体,而不是被检样品,为了操作方便,可将上述的“诊断膜”按压迹剪成小片,置微量反

应板的小孔中。在微孔中,“诊断膜”与相应的被检样品和诊断液发生一系列的抗原抗体反

应和酶促反应。在试验中,被检样品和诊断液的用量均为每孔50μl,其他反应条件和操作

法与常规ELISA相同。

(四) 注意事项

1 点样量不易过大,以免溢出压迹圈外,造成各样品混合,如要增加样品吸附量,可在一

次点样干燥后,再进行第2次点样。

2 膜包被后,一定要封闭确实,防止抗原或抗体的非特异性吸附,避免膜本底染色过深。

3 结果判定时,应与阴、阳性对照斑点反复比较,尽量克服肉眼观察所带来的误差。


文章分类: 蛋白技术资料
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