斑点酶联免疫吸附测定法
斑点酶联免疫吸附测定法(DotELISA,DELISA)是以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中
常
用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。DELISA不仅保留了常规ELISA的优
点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特异性强，被检
样品用量少，节省材料，不需特殊仪器，结果判定简单易行和便于长期保存等特点。因此，
该法自问世以来，以其独特的优势，广泛应用于抗原抗体的检测和杂交瘤细胞的筛选等。
(一) 原理DELISA的基本原理与常规ELISA和免疫酶染色法基本相同，即
将抗原或抗体首
先吸附在纤维素薄膜(如硝酸纤维素膜，NC)表面，并保持其免疫活性，通过与相应的抗体或
抗原和酶标记物的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，在底物的参与下，结合物
上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉着于抗原抗体复合物吸附的部位，呈
现出肉眼可见的颜色斑点。试验的结果可通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。
DELISA常用的检测方法有直接法、间接法、双抗体夹心法、双夹心法和竞争法等。
(二) 材料和方法(以快速诊断口蹄疫为例)
1 材料
(1) 载体：硝酸纤维素膜022～045μm,Schleiche & Schucll或国产；混
合硝酸纤维素膜022μm，上海医药工业研究院生产。
(2) 保温液及洗涤液：保温液为含01%BSA、005%Tween20 PBS(001mo
l/L,pH值74)；洗涤液为005%Tween20 PBS。
(3) 封闭剂：含1%BSA或4%蛋清或3%白明胶的PBS。
(4) 口蹄疫单抗：口蹄疫病毒A型单克隆抗体(AFMcAb)、O型多克隆抗体(OF
PcAb，由O型标准病毒免疫BALB/c鼠制得)，由新疆畜牧科学院兽医研究所提供。
(5) A、O、C、ZB型口蹄疫标准抗原：由兰州兽医研究所提供。
(6) 冻干辣根过氧化物酶标记兔抗BALB/c鼠抗体：卫生部生物制品研究所生
产。
(7) 底物溶液：3,3二氨基联苯胺50mg,005mol/L、pH值76 TrisHCl
缓冲液100ml，溶解后过滤，4℃避光保存。临用前按003%加入H2O2。
(8) 被检抗原的制备：水疱液可直接点样。水疱皮用生理盐水洗净，晾干，
称重，剪碎，加中性玻璃砂研磨，用生理盐水制成1∶5～1∶10悬液，室温浸泡2h，振摇后
，1 500～2 000 r/min离心10min，上清液即可用于点样。
2 方法DELISA间接法程序
(1) 压迹：根据样品的数量剪取一片硝酸纤维素膜或混合纤维素膜。用直径3
～5mm圆形打孔
器(琼脂平板打孔器)，在膜的光滑面按顺序压上痕迹，作为点样部位。将膜置蒸馏水中浸
泡，待完全浸湿后，取出室温自然干燥。
(2) 点样：用微量移液器分别吸取1～2μl(或用玻璃棒、毛细管蘸一滴)被检
抗原液，滴于
圆圈内，自然干燥。为增加抗原吸附量，也可在点样干燥后，再进行第二次点样。同时作阴
、阳性抗原对照。
(3) 封闭：将膜置平皿或小池内，加入封闭剂，37℃浸泡30～60min。取出稍
置片刻，用洗液漂洗2次，晾干。
(4) 与AFMcAb或OFPcAb反应：用保温液对AFMcAb或OFPcAb作适当稀
释，加入反应池中，于37℃覆盖膜2h。
(5) 洗涤：用洗涤液漂洗膜3次，每次3min，晾干。
(6) 与酶结合物反应：冻干辣根过氧化物酶标记兔抗BALB/c鼠抗体用保温液
作1∶80稀释，37℃覆盖膜1h。
(7) 洗涤：3次，方法同上。
(8) 显色：将膜浸入底物溶液中，避光染色5～15min。
(9) 终止反应：用蒸馏水漂洗滤膜，晾干。
(三) 结果判定在阴、阳对照正常情况下，以在膜圆圈内出现棕色斑点为
阳性，无色为阴性。膜干燥后，可长期保存。
在应用DELISA间接法、双抗体夹心法等检测方法时，如果膜上包被的是已知的标准抗原或
抗体，而不是被检样品，为了操作方便，可将上述的“诊断膜”按压迹剪成小片，置微量反
应板的小孔中。在微孔中，“诊断膜”与相应的被检样品和诊断液发生一系列的抗原抗体反
应和酶促反应。在试验中，被检样品和诊断液的用量均为每孔50μl，其他反应条件和操作
法与常规ELISA相同。
(四) 注意事项
1 点样量不易过大，以免溢出压迹圈外，造成各样品混合，如要增加样品吸附量，可在一
次点样干燥后，再进行第2次点样。
2 膜包被后，一定要封闭确实，防止抗原或抗体的非特异性吸附，避免膜本底染色过深。
3 结果判定时，应与阴、阳性对照斑点反复比较，尽量克服肉眼观察所带来的误差。
|
|
