BAS酶联免疫吸附试验

BAS酶联免疫吸附试验

生物素-亲和素(又称抗生物素)系统(biotinavidin system,BAS)标记抗体的技术是20世

纪70年代后期发展起来的一种

新的免疫检测方法。由于亲和素与生物素间的亲和力极强，结合迅速，且极其稳定，生物素

标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性，使BAS标记技术比常规酶联免疫、放射免

疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。目前生物

素和

亲和素(近年来，在BAS检测中多用链霉亲和素“streptavidin,SA”，它是链霉菌培养过程

中的分泌物，完整的链霉亲和素和从卵白中提取的亲和素一样，也由4条相同的肽链组成。

因链霉亲和素在检测应用中发生的非特异性结合远较亲和素低，因此日渐受重视，已有取代

亲和素之势)，

各种抗体或酶的标记物在国内已有商品供应，使用方便。BASELISA具有的特点：①对于所

有的抗原抗体系统，包括免疫细胞化学、ELISA、免疫印迹法等都适用，应用范围极广；

②BAS在温和条件下可与各类生物大分子如蛋白质、脂多糖等结合，并且这种结合对原生物

大分子的生物活性无影响；

③每个亲和素分子可与4个生物素分子结合，所以可以偶合更多连接生物素的酶分子，从而

大大提高了灵敏度；

④生物素和亲和素间亲和力强，故二者一旦结合，就极为稳定，不受在ELISA方法中的保温

及多次洗涤影响，而且这种结合反应时间比抗原抗体反应所需时间短；

⑤结果专一性强，非特异性显色或染色背景极低；

⑥第一抗体稀释度高，可节约抗体。

(一) 原理生物素或亲和素与抗体分子或标记物结合后，既不影响前者的

亲和力，也不改变后者的特性。亲和素分子的4个活性部位并非都和连接在抗体分子上的生

物素残基结合，剩下的游离部位尚可作为另一种生物素标记蛋白质的受体。这些特点就是BA

S免疫标记技术的基础和原理。

BAS基本检测方法可分为两大类，一类以游离亲和素居中，分别连接生物素化大分子反应体

系和标记生物素，称为BAB法或桥联亲和素生物素法(bridged avidin biotin technique,

BRAB)，其改良法称为(avidinbiotin complex,ABC)法。另一类

以标记亲和素连接生物素化大分子反应体系，称为BA法或标记亲和素和生物素法(LAB)。现

分别介绍如下：1 BA法亦称LBA法。系将特异性抗体生物素化，将酶分子标记在亲和

素分子上，生物素化

抗体与被检抗原结合后，再借BAS的高度亲和力将酶分子联结到抗原分子上，经酶促反应即

可检出抗原。

图344BASELISA的三种基本检

测法示意图

2 BAB法亦称BRAB法。系将特异性抗体生物素化，将酶分子标在生物素上，然后以游离

亲和素桥联物，使被检抗原、生物素化抗体和酶标生物素联成一体。

3 ABC法原理与BAB法基本相同，只是亲和素和酶标生物素需要先按一定比例形成ABC复

合

物，这种网络结构结合了大量的酶分子，当亲和素尚未被酶标生物素饱和时，生物素化抗体

即可与之结合。BASELISA的三种基本检测法，如图344。

上述方法中，如将第二抗体生物素化，即为间接法，见表341。由于间接法增加了一级

抗

原抗体反应，因而比直接法更敏感，应用范围更广。近年来许多学者对上述基本方法进行了

改良，有人用亲和素抗体或A蛋白作桥联物。另外还发展了BAELISA竞争法和抑制法等。

现将BAS各种基本方法的反应层次列于表341。

表341BASELISA检测

方法及其反应层次

检测方法反应层次

直接法BABABABCAg(AbB)A*Ag(AbB)A

B*Ag(AbB)ABC

间接法BABABABCAgAb1(Ab2B)A*

AgAb1(Ab2B)AB*AgAb1(Ab2B)ABB

注：AbB和Ab2B分别为生物素化抗体和生物素化第二抗体；A和A

*

分别为亲和素和酶标记亲和素；B和B*分别为生物素和酶标记生物素。

(二) 材料和方法(以筛选抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体为例)

1 材料

(1) 空肠弯曲菌共同抗原提取物，自制。

(2) 生物素化羊抗鼠IgG(BSAMG)，卫生部上海生物制品所。

(3) ABC试剂，卫生部上海生物制品所。如ABC试剂需自己配制，可按说明要求，将亲和素与

酶标生物素按一定比例混合，置37℃孵育30min后使用。

(4) 被检杂交瘤培养物上清液。

(5) 其他试剂及器材同常规ELISA法。

2 方法ABCELISA间接法程序

(1) 用包被液对空肠弯曲菌共同抗原提取物作适当稀释(1∶16)，加入反应孔中，每孔01m

l，置4℃包被过夜或37℃1～2h。

(2) 用洗涤液洗涤2次，每次1min，沥干。

(3) 加入杂交瘤培养物上清液，每孔01ml。同时作BALB/C小鼠免疫血清(阳性)及正常血清

和培养液(阴性)对照，置37℃1～2h。

(4) 洗涤3次，方法同上。

(5) 用保温液对生物素化羊抗鼠IgG作适当稀释(1∶400～1∶1000)，加入反应孔中，每孔0

1ml。置37℃孵育1h。

(6) 洗涤3次，方法同上。

(7) 用ABC稀释液或保温液对ABC试剂作适当稀释(1∶100)，加入反应孔中，每孔01ml。置

37℃孵育30min。

(8) 洗涤3次，方法同上。

(9) 加入邻苯二胺底物溶液，每孔01ml，置暗盒内室温显色适当时间(30min)。

(10) 加入2mol/L H2SO4，每孔005ml，终止反应。用酶联检测仪检测结果，并记录其

OD值。

(三) 结果判定以P/N≥2为阳性，或根据自定标准判定。

(四) 注意事项

1 ABCELISA中各要素的最佳反应条件需经筛选后确定，不能照搬常规ELISA的反应条件

。

2 ABCELISA对抗原和抗体(或免疫血清)的质量要求高，否则可造成较高的本底或背景显

色。