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BAS酶联免疫吸附试验

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发表时间:2019-11-22 11:23作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

BAS酶联免疫吸附试验

生物素-亲和素(又称抗生物素)系统(biotinavidin system,BAS)标记抗体的技术是20世

70年代后期发展起来的一种

新的免疫检测方法。由于亲和素与生物素间的亲和力极强,结合迅速,且极其稳定,生物素

标记抗体和酶的标记率高,又不影响蛋白的活性,使BAS标记技术比常规酶联免疫、放射免

疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度,为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。目前生物

素和

亲和素(近年来,在BAS检测中多用链霉亲和素“streptavidin,SA”,它是链霉菌培养过程

中的分泌物,完整的链霉亲和素和从卵白中提取的亲和素一样,也由4条相同的肽链组成。

因链霉亲和素在检测应用中发生的非特异性结合远较亲和素低,因此日渐受重视,已有取代

亲和素之势),

各种抗体或酶的标记物在国内已有商品供应,使用方便。BASELISA具有的特点:①对于所

有的抗原抗体系统,包括免疫细胞化学、ELISA、免疫印迹法等都适用,应用范围极广;

②BAS在温和条件下可与各类生物大分子如蛋白质、脂多糖等结合,并且这种结合对原生物

大分子的生物活性无影响;

③每个亲和素分子可与4个生物素分子结合,所以可以偶合更多连接生物素的酶分子,从而

大大提高了灵敏度;

④生物素和亲和素间亲和力强,故二者一旦结合,就极为稳定,不受在ELISA方法中的保温

及多次洗涤影响,而且这种结合反应时间比抗原抗体反应所需时间短;

⑤结果专一性强,非特异性显色或染色背景极低;

⑥第一抗体稀释度高,可节约抗体。

(一) 原理生物素或亲和素与抗体分子或标记物结合后,既不影响前者的

亲和力,也不改变后者的特性。亲和素分子的4个活性部位并非都和连接在抗体分子上的生

物素残基结合,剩下的游离部位尚可作为另一种生物素标记蛋白质的受体。这些特点就是BA

S免疫标记技术的基础和原理。

BAS基本检测方法可分为两大类,一类以游离亲和素居中,分别连接生物素化大分子反应体

系和标记生物素,称为BAB法或桥联亲和素生物素法(bridged avidin biotin technique,

BRAB),其改良法称为(avidinbiotin complex,ABC)法。另一类

以标记亲和素连接生物素化大分子反应体系,称为BA法或标记亲和素和生物素法(LAB)。现

分别介绍如下:1 BA法亦称LBA法。系将特异性抗体生物素化,将酶分子标记在亲和

素分子上,生物素化

抗体与被检抗原结合后,再借BAS的高度亲和力将酶分子联结到抗原分子上,经酶促反应即

可检出抗原。

344BASELISA的三种基本检

测法示意图

2 BAB法亦称BRAB法。系将特异性抗体生物素化,将酶分子标在生物素上,然后以游离

亲和素桥联物,使被检抗原、生物素化抗体和酶标生物素联成一体。

3 ABC法原理与BAB法基本相同,只是亲和素和酶标生物素需要先按一定比例形成ABC复

物,这种网络结构结合了大量的酶分子,当亲和素尚未被酶标生物素饱和时,生物素化抗体

即可与之结合。BASELISA的三种基本检测法,如图344。

上述方法中,如将第二抗体生物素化,即为间接法,见表341。由于间接法增加了一级

原抗体反应,因而比直接法更敏感,应用范围更广。近年来许多学者对上述基本方法进行了

改良,有人用亲和素抗体或A蛋白作桥联物。另外还发展了BAELISA竞争法和抑制法等。

现将BAS各种基本方法的反应层次列于表341。

341BASELISA检测

方法及其反应层次

检测方法反应层次

直接法BABABABCAg(AbB)A*Ag(AbB)A

B*Ag(AbB)ABC

间接法BABABABCAgAb1(Ab2B)A*

AgAb1(Ab2B)AB*AgAb1(Ab2B)ABB

注:AbB和Ab2B分别为生物素化抗体和生物素化第二抗体;A和A

*

分别为亲和素和酶标记亲和素;B和B*分别为生物素和酶标记生物素。

(二) 材料和方法(以筛选抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体为例)

1 材料

(1) 空肠弯曲菌共同抗原提取物,自制。

(2) 生物素化羊抗鼠IgG(BSAMG),卫生部上海生物制品所。

(3) ABC试剂,卫生部上海生物制品所。如ABC试剂需自己配制,可按说明要求,将亲和素与

酶标生物素按一定比例混合,置37℃孵育30min后使用。

(4) 被检杂交瘤培养物上清液。

(5) 其他试剂及器材同常规ELISA法。

2 方法ABCELISA间接法程序

(1) 用包被液对空肠弯曲菌共同抗原提取物作适当稀释(1∶16),加入反应孔中,每孔01m

l,置4℃包被过夜或37℃1~2h。

(2) 用洗涤液洗涤2次,每次1min,沥干。

(3) 加入杂交瘤培养物上清液,每孔01ml。同时作BALB/C小鼠免疫血清(阳性)及正常血清

和培养液(阴性)对照,置37℃1~2h。

(4) 洗涤3次,方法同上。

(5) 用保温液对生物素化羊抗鼠IgG作适当稀释(1∶400~1∶1000),加入反应孔中,每孔0

1ml。置37℃孵育1h。

(6) 洗涤3次,方法同上。

(7) 用ABC稀释液或保温液对ABC试剂作适当稀释(1∶100),加入反应孔中,每孔01ml。置

37℃孵育30min。

(8) 洗涤3次,方法同上。

(9) 加入邻苯二胺底物溶液,每孔01ml,置暗盒内室温显色适当时间(30min)。

(10) 加入2mol/L H2SO4,每孔005ml,终止反应。用酶联检测仪检测结果,并记录其

OD值。

(三) 结果判定以P/N≥2为阳性,或根据自定标准判定。

(四) 注意事项

1 ABCELISA中各要素的最佳反应条件需经筛选后确定,不能照搬常规ELISA的反应条件

2 ABCELISA对抗原和抗体(或免疫血清)的质量要求高,否则可造成较高的本底或背景显

色。


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