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协同凝集试验(以沙门氏菌为例)

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发表时间:2019-11-22 11:09作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

协同凝集试验(以沙门氏菌为例)

(Coagglutination test)

(一) 原理金黄色葡萄球菌细胞壁上的A蛋白(SPA),具有和大多数哺乳动

IgG的Fc片段发生非特异性结合的特性,而IgG的Fab片段暴露在菌体的表面,仍保持抗体的

活性,当与特异性抗原相遇时,IgG的Fab片段便与抗原结合起来,从而由抗原把已标记有Ig

G的SPA菌相互连接,而引起协同凝集反应。其特点是既保持了标记抗体的特异性,又提高了

抗体的敏感性。含A蛋白的金黄色葡萄球菌在反应中起到载体和“放大器”的作用(图32

4)。

324协同凝集试验原理示意图

(二) 材料和方法

1 菌种和培养基

(1) 菌种:目前国际上公认的含SPA丰富的菌株叫CowanⅠ,菌种编号为ATCC1

2598或NCTC8530;我国卫生部药品生物制品检定所将该菌株编号为26111。

由我国筛选确定含SPA丰富的菌株有1800株、25株、799株、HH3株等。

国际上公认不含SPA的菌株是Wood46,卫生部药品生物制品检定所将该菌株编号为26107。以

上菌种均可由卫生部药品生物制品检定所提供。

(2) 培养基:种类很多,较简单的一种为葡萄糖肉汤或琼脂,配方如下:

蛋白胨10 g

Na2HPO4·12H2O 2 g

葡萄糖1 g

氯化钠3 g

牛肉水1 000 ml

pH值至78,即为葡萄糖肉汤培养基。如在其培基中加入琼脂25 g,即为固体营养琼脂。

2 SPA菌稳定液的制备

(1) 取CowanI或Wood46菌种,接种在肉汤培养基内经37℃培养18~24h,再转种有营养琼

脂的克氏培养瓶中,每瓶3~5ml,摇匀,使菌液布满整个培养基表面,放37℃温箱培养18~

20h。

(2) 每瓶以10~20ml无菌生理盐水洗下菌苔,以3 000 r/min离心15min,弃去上清液,

再用

无菌生理盐水将沉淀悬浮后离心,如此再洗涤两次菌体,然后用含05%福尔马林的001mo

l/L pH值74的磷酸盐缓冲盐水制成10%的菌悬液(V/V),室温放置3h或过液。

(3) 将上述菌悬液放56℃水浴加热30min,迅速冷却,再用磷酸盐缓冲盐水洗离3次,最后

用含叠氮钠(NaN3)为001%~005%的磷酸盐缓冲盐水制成10%(V/V)的菌悬液。4℃冰箱

保存。

3 SPA菌诊断液的制备即将上述稳定液与已知的抗血清结合。

(1) 取10%SPA菌稳定液1ml,离心弃上清,再用磷酸盐缓冲盐水洗菌体一次,并加缓冲盐水

1ml,悬浮菌体,然后加沙门氏菌AFO多价血清01ml,(注:血清预先放56℃水浴加热30

min

,进行灭活处理)。SPA菌和血清充分摇匀,放37℃水浴中作用30min,此间应不断振摇,

以保持菌体呈悬浮状态,以利于菌体与IgG结合。

(2) 将与抗体结合后的SPA菌液以3 000 r/min的转速离心15min,弃上清,并用磷酸盐

冲盐水悬浮菌体洗离2次,以洗去未给合的剩余血清,最终加含005%~01%NaN3的缓冲

盐水10ml。这种菌悬液即为1%标记的SPA菌诊断液。

在制备稳定液、诊断液的过程中,应同时作不含A蛋白的葡萄球菌及含A蛋白葡萄球菌与正常

血清感作的对照。

4 操作方法试验时,取诊断试剂一滴和待检或已知菌苔或抗原置于玻片上,用白

金环或玻棒混匀,在数分钟内即可观察结果。一旦发生凝集,葡萄球菌凝集成清晰可见的颗

粒。

(三)结果判定结果判断的标准为:

++++液体透明,试剂凝成粗大颗粒;

+++液体透明,试剂凝成较大颗粒;

++液体稍透明,试剂凝成小颗粒;

+液体混浊,试剂凝成可见颗粒;

-液体混浊,无颗粒可见。

必要时,可用不含A蛋白的Wood46和正常兔血清标记菌体试剂作对照,以排除非特异性凝集

可能造成的假阳性结果。

(四) 注意事项

1 制备好的SPA菌稳定液,于4℃冰箱中至少可保存8个月,并不影响其与抗体结合的性能

2 免疫血清的效价及特异性是本反应中的一个关键因素。只有具备良好的免疫血清,才能

制备出敏感性高、特异性强的SPA菌诊断液。

3 所用洗液及稀释液的pH值,是影响反应敏感性的重要因素。试验前要进行优选确定。在

沙门氏菌的检测中,以应用pH值60 PBS效果较好。

4 对被检标本进行煮沸处理,是消除非特异性反应的一种有效方法。

5 反应特异性的证实,可用SPA菌特异性花结试验对凝集阳性反应物进行证实。具体方法

是:钓取阳性凝集物,涂布于玻片上,进行革兰氏染色。镜检时,如见有革兰氏阳性的葡萄

球菌和被检菌团聚在一起,则为真阳性反应,否则为假阳性反应。


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