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间接血凝试验(以鼻疽为例)

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发表时间:2019-11-22 11:07

间接血凝试验(以鼻疽为例)

(indirect hemagglutination test)

(一) 原理若将可溶性的鼻疽抗原吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面

上,使红细胞产生一种新的血清学性质,制成所谓的致敏红细胞,即可用以诊断鼻疽。只要

与少量相应抗体相遇,红细胞通过抗原抗体反应,即可被动地结合在一起,呈现肉眼可见

的凝集现象,阴性者红细胞由于自然沉积于孔底,则呈圆点状。这样可以明显

地提高反应的敏感性。其原理如图321。

321间接红细胞凝集试验原理示意

1红细胞2抗原3、5致敏红细胞4被检抗体6被凝集

的红细胞

间接血凝试验即间接红细胞凝集试验,它也存在一些缺点,例如不同批次制备的抗原或红细

胞,在敏感性和稳定性方面,可能不一致,它很容易受外界因素的影响,发生非特异性凝集

,所以应用的器皿等就应当清洁,不要有污物或杂质等,遇到非特异凝集时,要做间接凝集

抑制试验(indirect hemagglutination inhibition test),以排除非特异性反应。

(二) 材料和方法

1 材料

(1) 磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制:

甲液:Na2HPO4 213 g

(或Na2HPO4·12H2O 5372 g)

NaCl   85 g

乙液:KH2PO4 2042 g

NaCl   85 g

上述(1)的甲、乙液配方各加蒸馏水至1000ml,溶解后,过滤,分别保存。使用时,按表3

21丙液配制表的比例将甲、乙液混合,再加等量的蒸馏水即配成015mol/L不同pH值的PB

S,摇匀灭菌备用。

表321丙液:pH值64及pH值72 PBS的配

制表

pH值甲液:015mol/L Na2HPO4、NaCl(ml)乙液:015mol/L KH2PO

4、NaCl

642476

727228

(2) 1%兔血清缓冲盐水的配制:将新分离的兔血清56℃ 30min灭活后,取所

需量(如10ml)加约半量(如05ml)的洗过的压积绵羊红细胞,并加兔血清量4倍(如4m

l)的pH值72 PBS,置37℃水浴箱中作用10min,以吸收兔血清中的异嗜性凝集素,1500 r/

min离心10min,吸取上清,加pH值72 PBS 95ml,即为1%兔血清PBS液,置4℃冰箱中,可

保存2天。

(3) 阿氏液(Alsevers solution)的配制:按以下配方配制,调正pH值61

,过滤后分装小瓶,以113℃高压蒸气灭菌15min后,置4℃冰箱中备用。

枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O)08 g

葡萄糖205 g

枸橼酸00325 g

氯化钠042 g

蒸馏水加至100 ml

(4) 红细胞:无菌采取绵羊血液于阿氏液中,于4℃冰箱中保存,可供3周内

使用。

(5) 固定剂:25%戊二醛溶液。

(6) 鞣酸溶液:所用鞣酸必须是优质纯品,用前用双馏水配成1/200溶液(使

用时,再用pH值72 PBS配成所需浓度),放4℃冰箱中保存,可供一周内使用。

(7) 鼻疽抗原及被检马血清(56℃ 30min灭活)。

(8) 试验用器材

血清反应板:为有机玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)制成,目前常用的为96孔板,长132cm,宽

84cm,厚12cm。板孔的形状基本有两种,即尖底的(V形)和圆底的(U形),其中V形板可

供血凝试验用,它较U形板具有更典型的凝集终点;U形板用于补体结合试验较好。96孔V形

板的孔径为06cm,每孔的总容量为025ml。

用过的血清板,可以01%新洁尔灭、3%~5%次亚氯酸钠或5%甲醛溶液浸泡1~2h,或用

紫外线消毒,但不能用来苏儿,因它可使血清板变色,如为无传染性的被检材料,可直接用

清水冲洗3~4次后,晾干备用。由于血清板的硬度不够,容易擦毛,所以洗擦时,可用纱布

轻抹,不能用手指或硬布擦表面,以免发毛。清洗时,水温不能超过90℃,以免变形。

微量滴管:国内尚无定型产品,可自行加工。所用玻璃滴管长约20cm,于1/4处有一球形

膨大部,下端接针头处为磨口的,把16G号针头磨平(即将针尖适当磨钝,以调正液滴大小,

使每毫升恰为40滴),使每滴量为0025ml,上端接小乳头。加液时,要使滴管与血清板成

垂直位置,以尽量使每滴液体的量相同。

稀释棒:金属制品。全长约20cm,头部为合金钢制成,呈灰白色(氧化的金属),表面微粗糙

些,以达到有效地吸取液体和吸取液体的一致性,为了长期保持棒头的氧化层,吸取的即便

不是带菌的液体,每使用20次,棒头也应过火一次,可烧至暗红色,但不能烧至鲜红。棒头

能蘸吸、移液和混合液体,能吸取液体是由于毛细管的作用和表面的粘附作用。目前国内制

造的棒头上有8条纵沟,吸液量为0025ml。

微量血液振荡器:为特制专用其振摇血清板的,可使孔内的各要素混合的更均匀。

2 方法

(1) 红细胞的致敏方法

红细胞醛化:用新鲜红细胞作间接血凝,不但红细胞凝集的模型新鲜、典型,而

且敏感性也好,但致敏红细胞保存的时间短,而且由于不同批次或不同动物个体的细胞具有

一定的差异,可造成试验结果不一致,影响对结果的分析。为了克服这一缺点,目前多采用

醛化法(如甲醛、戊二醛或丙酮醛)固定红细胞,制备致敏红细胞。经醛化的红细胞在普通冰

箱中可保存1年以上,而且无明显的溶血现象,致敏后的红细胞敏感性,一般来说,与新鲜

红细胞没有明显的差别。

取阿氏液保存的血液,用pH值72 PBS洗3次,每次均为3000r/min 3min,最后一次

去上清,取沉积的红细胞25ml,加1%戊二醛(取25%冷戊二醛10ml和pH值72 PBS 240ml混合

制成) 250ml,于4℃冰箱中醛化50min,中间振摇4~5次,取出后仍呈深红色,极粘稠地沉

于离心管底,须强力方能搅拌起来,再以pH值72 PBS连续洗3次,每次均为3000r/min 3mi

n,最后一次去上清,加入含001%硫柳汞的pH值72 PBS 225ml,即为10%戊二醛化红细胞

液,置4℃冰箱中保存最少可用1年。

醛化红细胞鞣酸化:以10%醛化红细胞12ml,加pH值72 PBS 8ml,以3000 r/min离心3mi

n,如此洗2次,去上清,再加pH值72 PBS 4ml,即为3%红细胞悬液,加4ml 1∶20 000鞣

(1/200鞣酸用pH值72 PBS稀释),于37℃水浴中加温15min,其间不断振摇,使之充分作

用,加温完毕,以pH值72 PBS洗2次,每次均3000 r/min 3min,倾去上清,加4ml pH值7

2 PBS,即为3%鞣酸化红细胞液。

鞣酸化红细胞致敏:取鼻疽补反用抗原,以pH值64 PBS将其1∶100稀释,以4ml稀释的抗

原加往鞣酸化红细胞液4ml中,于37℃水浴中作用30min,以3000 r/min离心3min,去上清后

,再加8ml 1%兔血清缓冲盐水,即为间接血凝用15%致敏红细胞诊断液(须加001%硫柳汞

防腐),置普通冰箱中可保存05~1年。对照用红细胞诊断液,按上述方法以pH值64 PBS

处理鞣酸化红细胞即可。

322间接红细胞凝集试验的

操作方法

(2) 实施反应的操作方法:用微量滴管吸取1%正常兔血清pH值72 PBS分别

滴加

于血清板相邻两列孔中,每孔一滴即0025ml,再取2支预湿的棒头(先通过火焰烧红、冷却

,放蒸馏水或生理盐水的液面上预湿1min,注意不能将整个棒头都浸到液体中,否则会有残

留液体,造成不正确的结果,再用吸水纸吸潮、校准)分别蘸取1∶100稀释的被检血清(56℃

30min加热灭活)0025ml,各插入上下二列的第1孔稀释液中,进行捻转对倍稀释,捻转稀

释棒的速度要适当,太慢混合不均,太快易造成泡沫,使得稀释不准,通常每秒钟捻转2~3

次为适宜,稀释后血清第1~7孔的稀释度分别为1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶32

00、1∶6400、1∶12800,第8孔不加血清,为1%兔血清PBS对照。再用微量滴管吸

取鼻疽抗原致敏的红细胞诊断液往第一列的每一孔中滴加0025ml,再换另一支微量滴管吸

取对照用鞣酸化细胞液滴加于第二列的每一孔中,每孔也为0025ml。然后将血凝反应板置

于微型血液振荡器上(图322),振摇3~5min,充分混匀,取下反应板,将其放于事先

铺有湿纱布的搪瓷盘内,置37℃恒温箱中1~15h(夏季放室温下也可以),取出观察结果,

必要时放室温下过夜,再一次观察反应结果,并作终判。

(三)结果判定

判定时,应首先看对照孔,只有在各个对照孔完全正确的情况下,说明反应条件正常,方可

对被检血清列的结果作判定。红细胞凝集的强度等级(图323)为:

323间接血凝试验呈现

的不同程度凝集强度示意图

++++凝集的红细胞呈薄膜状,均匀地布满孔底,强凝集时,凝集块皱缩成团状;

+++凝集的红细胞明显地布满孔底,但似有红细胞沉积于中央;

++凝集的红细胞沉于孔底,中央有少量红细胞沉于孔底,呈小圆点状;

+红细胞沉于孔底中央,周围微有散在的凝集红细胞;

-红细胞全部沉于孔底中央,周围无散在的红细胞。

1∶800稀释度以上的被检血清呈“++”以上凝集者判为鼻疽阳性反应;1∶400以上凝集

者判为疑似反应。


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