间接血凝试验(以鼻疽为例)

间接血凝试验(以鼻疽为例)

(indirect hemagglutination test)

(一) 原理若将可溶性的鼻疽抗原吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面

上，使红细胞产生一种新的血清学性质，制成所谓的致敏红细胞，即可用以诊断鼻疽。只要

与少量相应抗体相遇，红细胞通过抗原抗体反应，即可被动地结合在一起，呈现肉眼可见

的凝集现象，阴性者红细胞由于自然沉积于孔底，则呈圆点状。这样可以明显

地提高反应的敏感性。其原理如图321。

图321间接红细胞凝集试验原理示意

图1红细胞2抗原3、5致敏红细胞4被检抗体6被凝集

的红细胞

间接血凝试验即间接红细胞凝集试验，它也存在一些缺点，例如不同批次制备的抗原或红细

胞，在敏感性和稳定性方面，可能不一致，它很容易受外界因素的影响，发生非特异性凝集

，所以应用的器皿等就应当清洁，不要有污物或杂质等，遇到非特异凝集时，要做间接凝集

抑制试验(indirect hemagglutination inhibition test)，以排除非特异性反应。

(二) 材料和方法

1 材料

(1) 磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制：

甲液：Na2HPO4 213 g

(或Na2HPO4·12H2O 5372 g)

NaCl   85 g

乙液：KH2PO4 2042 g

NaCl   85 g

上述(1)的甲、乙液配方各加蒸馏水至1000ml，溶解后，过滤，分别保存。使用时，按表3

21丙液配制表的比例将甲、乙液混合，再加等量的蒸馏水即配成015mol/L不同pH值的PB

S，摇匀灭菌备用。

表321丙液：pH值64及pH值72 PBS的配

制表

pH值甲液：015mol/L Na2HPO4、NaCl(ml)乙液：015mol/L KH2PO

4、NaCl

642476

727228

(2) 1%兔血清缓冲盐水的配制：将新分离的兔血清56℃ 30min灭活后，取所

需量(如10ml)加约半量(如05ml)的洗过的压积绵羊红细胞，并加兔血清量4倍(如4m

l)的pH值72 PBS，置37℃水浴箱中作用10min，以吸收兔血清中的异嗜性凝集素，1500 r/

min离心10min，吸取上清，加pH值72 PBS 95ml，即为1%兔血清PBS液，置4℃冰箱中，可

保存2天。

(3) 阿氏液(Alsevers solution)的配制：按以下配方配制，调正pH值61

，过滤后分装小瓶，以113℃高压蒸气灭菌15min后，置4℃冰箱中备用。

枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O)08 g

葡萄糖205 g

枸橼酸00325 g

氯化钠042 g

蒸馏水加至100 ml

(4) 红细胞：无菌采取绵羊血液于阿氏液中，于4℃冰箱中保存，可供3周内

使用。

(5) 固定剂：25%戊二醛溶液。

(6) 鞣酸溶液：所用鞣酸必须是优质纯品，用前用双馏水配成1/200溶液(使

用时，再用pH值72 PBS配成所需浓度)，放4℃冰箱中保存，可供一周内使用。

(7) 鼻疽抗原及被检马血清(56℃ 30min灭活)。

(8) 试验用器材

血清反应板：为有机玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)制成，目前常用的为96孔板，长132cm，宽

84cm，厚12cm。板孔的形状基本有两种，即尖底的(V形)和圆底的(U形)，其中V形板可

供血凝试验用，它较U形板具有更典型的凝集终点；U形板用于补体结合试验较好。96孔V形

板的孔径为06cm，每孔的总容量为025ml。

用过的血清板，可以01%新洁尔灭、3%～5%次亚氯酸钠或5%甲醛溶液浸泡1～2h，或用

紫外线消毒，但不能用来苏儿，因它可使血清板变色，如为无传染性的被检材料，可直接用

清水冲洗3～4次后，晾干备用。由于血清板的硬度不够，容易擦毛，所以洗擦时，可用纱布

轻抹，不能用手指或硬布擦表面，以免发毛。清洗时，水温不能超过90℃，以免变形。

微量滴管：国内尚无定型产品，可自行加工。所用玻璃滴管长约20cm，于1/4处有一球形

膨大部，下端接针头处为磨口的，把16G号针头磨平(即将针尖适当磨钝，以调正液滴大小，

使每毫升恰为40滴)，使每滴量为0025ml，上端接小乳头。加液时，要使滴管与血清板成

垂直位置，以尽量使每滴液体的量相同。

稀释棒：金属制品。全长约20cm，头部为合金钢制成，呈灰白色(氧化的金属)，表面微粗糙

些，以达到有效地吸取液体和吸取液体的一致性，为了长期保持棒头的氧化层，吸取的即便

不是带菌的液体，每使用20次，棒头也应过火一次，可烧至暗红色，但不能烧至鲜红。棒头

能蘸吸、移液和混合液体，能吸取液体是由于毛细管的作用和表面的粘附作用。目前国内制

造的棒头上有8条纵沟，吸液量为0025ml。

微量血液振荡器：为特制专用其振摇血清板的，可使孔内的各要素混合的更均匀。

2 方法

(1) 红细胞的致敏方法

红细胞醛化：用新鲜红细胞作间接血凝，不但红细胞凝集的模型新鲜、典型，而

且敏感性也好，但致敏红细胞保存的时间短，而且由于不同批次或不同动物个体的细胞具有

一定的差异，可造成试验结果不一致，影响对结果的分析。为了克服这一缺点，目前多采用

醛化法(如甲醛、戊二醛或丙酮醛)固定红细胞，制备致敏红细胞。经醛化的红细胞在普通冰

箱中可保存1年以上，而且无明显的溶血现象，致敏后的红细胞敏感性，一般来说，与新鲜

红细胞没有明显的差别。

取阿氏液保存的血液，用pH值72 PBS洗3次，每次均为3000r/min 3min，最后一次

去上清，取沉积的红细胞25ml，加1%戊二醛(取25%冷戊二醛10ml和pH值72 PBS 240ml混合

制成) 250ml，于4℃冰箱中醛化50min，中间振摇4~5次，取出后仍呈深红色，极粘稠地沉

积

于离心管底，须强力方能搅拌起来，再以pH值72 PBS连续洗3次，每次均为3000r/min 3mi

n，最后一次去上清，加入含001%硫柳汞的pH值72 PBS 225ml，即为10%戊二醛化红细胞

液，置4℃冰箱中保存最少可用1年。

醛化红细胞鞣酸化：以10%醛化红细胞12ml，加pH值72 PBS 8ml，以3000 r/min离心3mi

n，如此洗2次，去上清，再加pH值72 PBS 4ml，即为3%红细胞悬液，加4ml 1∶20 000鞣

酸(1/200鞣酸用pH值72 PBS稀释)，于37℃水浴中加温15min，其间不断振摇，使之充分作

用，加温完毕，以pH值72 PBS洗2次，每次均3000 r/min 3min，倾去上清，加4ml pH值7

2 PBS，即为3%鞣酸化红细胞液。

鞣酸化红细胞致敏：取鼻疽补反用抗原，以pH值64 PBS将其1∶100稀释，以4ml稀释的抗

原加往鞣酸化红细胞液4ml中，于37℃水浴中作用30min，以3000 r/min离心3min，去上清后

，再加8ml 1%兔血清缓冲盐水，即为间接血凝用15%致敏红细胞诊断液(须加001%硫柳汞

防腐)，置普通冰箱中可保存05～1年。对照用红细胞诊断液，按上述方法以pH值64 PBS

处理鞣酸化红细胞即可。

图322间接红细胞凝集试验的

操作方法

(2) 实施反应的操作方法：用微量滴管吸取1%正常兔血清pH值72 PBS分别

滴加

于血清板相邻两列孔中，每孔一滴即0025ml，再取2支预湿的棒头(先通过火焰烧红、冷却

，放蒸馏水或生理盐水的液面上预湿1min，注意不能将整个棒头都浸到液体中，否则会有残

留液体，造成不正确的结果，再用吸水纸吸潮、校准)分别蘸取1∶100稀释的被检血清(56℃

30min加热灭活)0025ml，各插入上下二列的第1孔稀释液中，进行捻转对倍稀释，捻转稀

释棒的速度要适当，太慢混合不均，太快易造成泡沫，使得稀释不准，通常每秒钟捻转2～3

次为适宜，稀释后血清第1～7孔的稀释度分别为1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶32

00、1∶6400、1∶12800，第8孔不加血清，为1%兔血清PBS对照。再用微量滴管吸

取鼻疽抗原致敏的红细胞诊断液往第一列的每一孔中滴加0025ml，再换另一支微量滴管吸

取对照用鞣酸化细胞液滴加于第二列的每一孔中，每孔也为0025ml。然后将血凝反应板置

于微型血液振荡器上(图322)，振摇3～5min，充分混匀，取下反应板，将其放于事先

铺有湿纱布的搪瓷盘内，置37℃恒温箱中1～15h(夏季放室温下也可以)，取出观察结果，

必要时放室温下过夜，再一次观察反应结果，并作终判。

(三)结果判定

判定时，应首先看对照孔，只有在各个对照孔完全正确的情况下，说明反应条件正常，方可

对被检血清列的结果作判定。红细胞凝集的强度等级(图323)为：

图323间接血凝试验呈现

的不同程度凝集强度示意图

++++凝集的红细胞呈薄膜状，均匀地布满孔底，强凝集时，凝集块皱缩成团状；

+++凝集的红细胞明显地布满孔底，但似有红细胞沉积于中央；

++凝集的红细胞沉于孔底，中央有少量红细胞沉于孔底，呈小圆点状；

+红细胞沉于孔底中央，周围微有散在的凝集红细胞；

-红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。

凡1∶800稀释度以上的被检血清呈“++”以上凝集者判为鼻疽阳性反应；1∶400以上凝集

者判为疑似反应。