免疫印迹法(immunoblotting)
1 原理
首先将抗原样品加在凝胶板上，进行单向或双向电泳，使抗原分离成各种单一成分；然后取
固定化基质膜(如硝酸纤维膜，NC)与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其他
外力作用下，使凝胶中的各种单一抗原组分转移到印迹纸上，并且固相化。最后再应用免疫
复盖液技术，如免疫同位素探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。该
法实质上是将凝胶电泳、固定化技术和免疫检定技术融为一体而创立的一种实验检测技术。
免疫印迹法是近几年发展起来的一项分析抗原、抗体的新技术。目前，免疫印迹法已成功应
用于生物医学各个领域，如细菌蛋白质、细菌脂多糖、病毒、寄生虫、变应原、自身抗原、
免疫复合物、补体及细胞表面蛋白等抗原的分析、单特异抗体的纯化、免疫球蛋白快速分析
及单克隆抗体筛选等。
免疫印迹法具有以下优点：①湿的固定化基质膜柔韧，易于操作；②固定化的生物大分子
可均一的与各种免疫探针接近，不会象凝胶那样受孔径阻隔；③免疫印迹分析只需少量试
剂；④孵育、洗涤的时间明显缩短；⑤可同时制作多个拷贝，用于多种分析和鉴定；⑥
结果以图谱形式出现可长期保存；⑦免疫探针可通过降低pH值等方法，象抹去录音磁带一
样将探针抹掉，再换用第二探针进行分析检测；⑧不仅可鉴定抗原样品中各成分的免疫原
性，还可测出分子量。
2 材料和方法
材料：
(1) 凝胶贮液，见表311。[HJ1]
表311Tris甘氨酸(laemmli)变性(SDS)不连续电泳贮液
[HJ*8]
溶液配制
1AcrBis375∶10或375∶05A
cr. 375g,Bis. 1或05g加水至100ml，20℃贮存
2下层胶(分离胶)缓冲液15mol/L TrisHCl,pH值88Tris 36
6g, 1mol/L HCl 48ml, 加水至100ml，4℃贮存
3上层胶(浓缩胶)缓冲液05mol/L TrisHCl,pH值68Tris 605g, 1m
ol/L HCl 48ml, 加水至100ml，4℃贮存
4TEMED，05%(V/V)TEMED 05ml，加水至100ml，避光4℃贮存
5SDS，20%(W/V)SDS 20g,加水至100ml，20℃贮存
6过硫酸铵，15%过硫酸铵15g，加水至100ml,新鲜配制
7分离胶上层覆盖液SDS 01g， 加水至100ml，溶于喷雾瓶中
8样品处理液05mol/L TrisHCl(pH值68)625ml，2巯基乙
醇5ml，甘油10ml， SDS 23g，01%溴酚蓝1ml，加水至100ml,用该溶液对抗原作适当稀
释，煮沸1～2min
9电极缓冲液Tris 6g，甘氨酸288g，20%SDS 5ml加水至100ml
10固定液磺基水杨酸173g，三氯醋酸575g，加水至500ml
11染色液冰乙酸100ml，甲醇500ml，蒸馏水400ml，考马斯亮蓝1～2g
于20℃染色45～60min或加温染色10min
12脱色液10%(V/V)乙酸。换液数次，至无色
注：配制15%～20%凝胶，Acr∶Bis为375∶05或375∶025
(2) 垂直板电泳槽，普通稳流稳压电泳仪。
(3) 硝酸纤维素滤膜(NC)或硝酸纤维素混合素酯膜(上海医药工业研究所研制)。
(4) 转移电泳槽，转移电泳仪(高电流)。
(5) 25mmol/L Tris192mmol/L甘氨酸转移电泳缓冲液(pH值83)：Tris6g，甘氨酸288g
，甲醇或异丙醇400ml(或不含)，加水至2000ml。
(6) 免疫覆盖液试剂
①兔免疫血清(第一抗体)，羊(或驴)抗兔IgGHRP结合物(第二抗体)；
②33二氨基联苯胺底物溶液，以TrisHCl(pH值76)缓冲液配制，含003%H2O2
；
③洗涤液为含005%Tween20的PBS(pH值74)；稀释液为含01%BSA、005%Tween20
的PBS；封闭液为含3%BSA的PBS。
方法：
(1) 抗原分离：采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原，其方法为稍加修改
的
Laemmli不连续电泳缓冲系统。电泳贮液及凝胶制备详见表311和表312。
表312Tris甘氨酸
(laemmli)变性(SDS)不连续电泳凝胶制备
凝胶贮液(ml)
下层胶(分离胶)Acr最终浓度
72%90%120%150%200%
上层胶(浓缩胶)
1AcrBis溶液575729
612016008
2下层胶或上层胶缓冲液75757575752
5
3SDS，20%溶液015015015015015005
4TEMED，05%242424242408
5蒸馏水1345120967232515
6过硫酸铵，15%07507507507507507
注：将凝胶贮液1～5混匀，抽气2min，加入凝胶贮液6。分离胶顶部滴
入01%SDS溶液，使分离胶液面保持水平，置37℃聚胶30～60min；吸出分离胶覆盖液，加
入上层胶，置37℃聚合60min。电泳时间为3～4h，电流强度为30～40mA。
图315“凝胶三明治”示意
图
1多孔塑料板2海棉垫3滤纸4NC膜5凝胶
(2) 抗原印迹：切取抗原分离胶，置转移电泳缓冲液中平衡10～20min。将固
定化基质膜(以NC为例)、滤纸、海棉垫预先用转移电泳液浸湿，按图315术式装配成“
凝胶三明治”，
然后插入转移电泳槽中。“三明治”各层间要求无气泡存在，并且NC的暗面侧贴于凝胶。将
电泳槽中注满电泳液，使之完全浸没凝胶夹板。位于凝胶侧的电极接负极，NC侧的电极接正
极。电流强度为200～300mA。电泳时间随洗脱抗原的分子量大小而不同。小分子量抗原洗脱
需电泳1～2h；大分子量抗原洗脱，需电泳6h或更长时间。
(3) 抗原检定：切取供“对照”用的一条抗原固定化NC，用考马斯亮蓝染色1
～5min，脱色
，作抗原定位检查和各抗原带的分子量测定；NC的剩余部分用于免疫学分析，操作程序(以
酶染色法为例)：①抗原印迹后，取出NC，用PBS(pH值74)漂洗2min；
②将NC放入封闭液内，置37℃淬灭1～2h，用稀释液对兔免疫血清(第一抗体)作适当稀释
(1∶100)，覆盖NC，37℃孵育1～2h，用洗涤液洗涤3次，每次10min；
③对羊(或驴)抗兔IgGHRP结合物(第二抗体)作适当稀释(1∶2000)，覆盖NC，置37℃孵育1
～2h，洗涤同前；
④用3，3二氨基联苯胺底物溶液覆盖NC，室温显色20～30min，蒸馏水漂洗，中止反应；
⑤结果分析，混合抗原经免疫印迹分析后，在NC上呈现数条棕红色的抗原带。根据抗原的含
量或免疫原性的差异，抗原带的颜色深浅也有所不同。免疫酶染色的结果与考马斯亮蓝染色
结果对照，比较其各自呈现的染色带，确定出抗原的分子量。
3 注意事项
(1) 凝胶贮液不宜存放过久。
(2) 在向分离胶表面加入01%SDS覆盖液时，应沿玻璃壁缓慢流下；切忌成坠滴入，以免破
坏分离胶液面及造成顶部凝胶浓度降低，影响样品的迁移与分离。
(3) 在装配“凝胶三明治”时，NC一经与凝胶接触，就不能再行移动。
(4) 长时间电转移时，电泳槽需设有散热装置或在冰箱内进行。
(5) 影响免疫酶染色法的诸因素可参照有关章节。
二、影响电泳的因素
带电质点之所以能在电场中移动，以及具有一定的移动速度，这是受其本身所带的电荷、电
场强度、溶液的pH值、离子强度以及电渗等因素影响的。
(一) 带电质粒的性质即颗粒所带电荷的量、颗粒大小及形状等。带电荷
越多、分子越小，泳动速度越快。
(二) 电场强度电场强度是单位厘米的电位差。电场强度越大，带电质点
游动速度越快，反之则越慢。
(三) 电泳缓冲溶液的pH值溶液的pH值决定于带电质点的解离程度，也决
定了带电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值离等电点越远，颗粒所带的
电荷越多，泳动速度也越快，反之则越慢。
蛋白质在酸性溶液中易变性，而在偏碱性溶液中比较稳定，所以蛋白质电泳大多用pH值82
～88的巴比妥或硼酸缓冲液，在这种pH值的溶液中，血清蛋白一般都带负电荷。
(四) 电泳缓冲溶液的离子强度溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越
慢，反之则越快。血清蛋白质电泳时，一般最适的离子强度在0025～0075mol/L之间。
离子强度太低，缓冲液的电泳能力下降，扩散现象严重，使分辨力明显降低；离子强度太高
，将有大量的电流通过琼脂板，由此而产生的热量使板中水分大量蒸发，严重时，可使琼脂
板断裂而致电泳失败。
(五) 电渗作用电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼
脂中含有SO4-
，带负电荷，造成静电感应，致使附近的水带正电荷，而向负极移动。所以电泳时有两种力
，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更
快，如果物质向正极移动，所带电荷少，则电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中
的γ球蛋白就是如此。所以在做电泳时，要选择电渗作用小的物质(如琼脂糖)作为支撑物
，以减少电渗作用对电泳的影响。但是有的电泳技术(如对流免疫电泳)也正是利用了电渗
作用而进行设计的。
(六) 吸附作用即介质对样品的滞留作用。它导致了样品的拖尾现象，而
降低了分辨率。纸的吸附作用最大，硝酸纤维膜(NC)的作用较小或无，故NC是电泳的良好支
撑物。
(七)电泳时间电泳时间与迁移率成正比。
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