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聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘电泳)(polyacrylamide gel elect  rophoresis,PAGE)

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发表时间:2019-11-22 10:59

聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘电泳)(polyacrylamide gel elect rophoresis,PAGE)

313圆盘电泳原理示

意图

1 原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺(acrylamide,Acr)与N,N亚甲基双丙烯

酰胺(N,Nmethylene bisacrylamide,Bis)在催化剂的作用下,聚合成大分子凝胶后,加样

,再进行电泳的一种方法。聚丙烯酰胺凝胶是一种网状的立体结构,其孔径大小可以控制,

用这种凝胶进行电泳,同时具有电泳和分子筛的双重作用。当样品通过凝胶进行电泳时,便

可依据样品中各种分子的电荷不同与分子量大小或构型的差异而将各成分分开(图31

3)。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质稳定,很少带有侧基,吸附作用与电渗作用均小,所以具

有很高的分辨率与敏感性。

2 材料与方法

(1) 材料

20%的单体母液:

[HJ*4]

丙烯酰胺 196 g

N,N亚甲基双丙烯酰胺04 g

加蒸馏水至 100 ml[HJ]

TrisEDTA缓冲液(pH值68):

[HJ*4]

05mol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)6057 g

004mol/L EDTA (乙二胺四乙酸) 117 g

加蒸馏水稀释至 100 ml[HJ]

β二甲基胺基丙腈(DMPN)液:

[HJ*4]

取原液(4℃保存)或用前稀释至50%浓度[HJ]

10%过硫酸铵溶液:

[HJ*4]

过硫酸铵 05 g

加蒸馏水 5 ml

注:需在使用时配制。配制后保存于4℃。[HJ]

0025mol/L pH值90硼酸缓冲液(电泳槽用):

[HJ*4]

母液

硼酸 4948 g

硼砂 30512 g

加蒸馏水至 1 000 ml[HJ]

使用液:取母液90ml加蒸馏水至1 440ml即成。

(2) 方法

样品处理:取待检样品与标准品(对照)各01ml,加入05%溴酚蓝指示剂各1滴,再加入25

%蔗糖各01ml,混合均匀备用。

凝胶管制备:取20%单体母液36ml,TrisEDTA缓冲液(pH值88)12ml,加7ml蒸馏水

混匀,再加入βDMPN液005ml,10%过硫酸铵015ml,混匀,于5min内完成。将05×

75cm两端开口的小玻璃管,一端用橡皮薄膜包扎封闭,插入有孔的橡皮塞孔洞中,将上述

混合液立即装入小玻璃管内,上端留10cm空处,再加入蒸馏水至满,注意勿产生气泡。于

室温下静止30min,使之聚合成凝胶。

314实施圆盘电泳

模式图1稳压整流器2圆盘电泳槽

加样:用毛细管吸去凝胶管上端的蒸馏水,缓缓加入已处理的样品于凝胶柱面上,每种样品

1管。每管留05ml空处,再加入蒸馏水至满。操作过程不得产生气泡和冲击凝胶面。

电泳:实施方法见图314,除去凝胶玻管下端之橡皮薄膜,将凝胶玻管连同有孔橡皮塞

一起插入电泳槽的孔洞

中,并作好标记,其余未插凝胶管之孔洞以无孔胶塞填塞。于上、下电泳槽中各加入0025

mol/L pH值90硼酸缓冲液,液面应将凝胶管两端淹没。以正负极分别联接下槽与上槽的电

极插座,接通电源进行电泳。起始电流应小,用1mA/管,待示踪染料到达分离胶后,将电流

增加到2~5mA/管。在考虑到电流的同时,也要考虑到电压,开始用100~150V,待样品进入

到分离胶时,电压可升到250V。一般如用4mA/管电流,于20℃电泳约需40min。也可根据溴

酚蓝指示剂移动下降情况,掌握电泳时间。当指示剂下降到距凝胶玻管下口约05cm时,

关闭电源,停止电泳。

剥胶:电泳毕,取出凝胶玻管,以带有8~10cm长针头的注射器吸取水,将针头徐徐插

入凝胶玻管内壁与凝胶柱间,边推进,边注水,待针头快到管底时,沿原路退出针头,另换

一处重复上述操作,反复几次,凝胶柱即可与玻管剥离。此时,于管的一端稍稍加压,即可

将凝胶柱由玻管内挤出。

染色处理:将凝胶柱浸泡于05%氨基黑10B染色液中,浸染1h,取出凝胶柱,用水冲去

上沾附之染液,放于7%冰醋酸中脱色,约一天,可脱到背底无色。然后将凝胶柱浸于2%冰醋

酸之细玻管中保存。也可作电泳染色和脱色。即在电泳后不取下凝胶玻管,而将上、下槽缓

冲液换成7%冰醋酸,并于凝胶玻管内加入氨基黑10B染料(加入少许蔗糖,避免染料与醋酸混

),电泳时,染料可自动将蛋白各成分染色并经醋酸脱去背底颜色。

3 结果对电泳后的结果,可用下列方法进行判定:

(1) 定性分析:以凝胶染色的区带图样与标准品图样进行对比鉴定。

(2) 定量分析:可选用以下方法:

①进行直接光密度扫描;

②把凝胶切成等距的薄片,洗脱,用生物化学方法作洗脱液的比色测定;

③放射性同位素法,在样品中加入标记同位素,如3H、14C等,电泳后,

用计数器测量放射活性,计算结果。

4 注意事项

(1) 样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶液相同,如含大量盐时,应经透析除盐。样

品的蛋白浓度以1mg/ml为宜。

(2) 丙烯酰胺和N,N亚甲基双丙烯酰胺的贮存液,会因水解后产生丙烯酸与氨而失效,也

可因光照而变质。故应装在棕色瓶中,冰箱保存可以延缓失效期。最好每月配制一次。一般

应测定其pH值(49~59),过低则难以聚合。

(3) 过硫酸铵溶液最好当天配制,冰箱保存,最多不超过1周。

(4) 凝胶应充分聚合,室温低时,可适当延长聚胶时间,在37℃温箱中可促进凝胶聚合。凝

胶柱面应整齐,在操作过程中,不要产生气泡,否则电泳后区带不整齐。

(5) 电泳中应保持电流稳定,避免电流强度过高,而产生大量的热,使分离失败。

(6) 缓冲液可再行使用,但应注意上下槽缓冲液不能混合或互换。因下槽中混入了催化剂及

氯离子,如将下槽的缓冲液用于上槽,则影响电泳。

(7) 如凝胶浓度较高,剥胶困难时,可用10%甘油水溶液代替水注入。

(8) 丙烯酰胺和N,N亚甲基双丙烯酰胺这两种单体,可引起神经中毒与刺激皮肤粘膜的作

用,应注意自身防护。

(9) 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入适量(如01%)的十二烷基硫酸钠(SDS)为助溶剂,可以测

定生物大分子的分子量,研究复合蛋白质的单体性质,获得明晰的电泳图谱。

附:聚丙烯酰胺凝胶免疫电泳

[HJ*4]

为检查凝胶柱中的特异沉淀线可进行免疫电泳,其主要操作如下:

(1) 按常规进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳完毕取出凝胶柱。

(2) 按常规方法制备免疫电泳琼脂板。

(3) 距抗体槽4mm处,上下平行放置凝胶柱,与抗体槽中相应抗体进行双向扩散。

(4) 2448h,沉淀线出现完全后,按常规进行干燥、染色。[HJ]


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