您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!
本企业通过iso9001质量体系认证

免疫电泳(immunoelectrophoresis,IE)

 二维码
发表时间:2019-11-22 10:49

免疫电泳(immunoelectrophoresis,IE)

1原理免疫电泳是指利用凝胶电泳,结合免疫扩散,以提高对混合组分分辨率的一种免疫化学分析技术。相应的抗原、抗体相遇后,比例恰当时,即出沉淀线。由于样品的游动图型呈放射状向外扩散,相应血清呈直线状扩散,于是二者相遇形成的沉淀线呈弧状。该方法可用来研究:抗原和抗体的相对应性;测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率;根据蛋白质的电泳迁移率、免疫特异性及其他特性,可以确定该复合物中含有某种蛋白质;鉴定抗原或抗体的纯度。

2材料和方法

(1)电泳仪:一般要求电泳仪的电压能为0~500V,而电流从0~100mA即可。

(2)电泳槽:电泳槽宜用闭合式,防止由于电泳过程中产热,而使其琼脂凝

胶中水份过度蒸发。作为电泳板的白金丝,必须与电泳槽等长,而槽中的缓冲液必须充分盖过电极,量要足够。

(3)电泳缓冲液:常用pH值86、离子强度为0075mol/L的巴比妥缓冲液。

其配法如下:

巴比妥276g

巴比妥钠1545g

蒸馏水加至1000ml

先将巴比妥放于已盛有300ml蒸馏水的三角烧瓶中加热熔化,再加入700ml蒸镏水,并加入巴比妥钠,溶后即可使用。也可先将巴比妥溶于1000ml蒸馏水中,然后再加入巴比妥。

(4)15%缓冲琼脂:称取琼脂粉15g放入100ml巴比妥缓冲液中,高压或煮沸溶化。

(5)操作方法:①取玻片一张,做好标记,然后按下图式样放上细玻璃棒(70×2mm)1根;

②把已溶化的15%巴比妥缓冲琼脂浇注在玻片上,每张25ml~30ml。注意勿使玻棒全部埋入琼脂中,应露1/3,浇注时不要使玻棒移动;

③打孔加样,按图形(图311)打孔(孔径1~2mm),孔离玻棒不宜太远或太近,以4mm为宜,用毛细滴管把抗原滴入孔中,然后进行电泳;

④电泳,把琼脂板放入电泳槽的支架上,两端分别贴上用2~4层已浸透缓冲液的滤纸或滤布,同槽内的缓冲液架桥相连。滤纸的宽度要同琼脂板的宽度一致,不宜过窄或过宽。加样的一端接负极,另一端接正极。电压按玻片长度3~6V/cm为准(也可按电流计算,即玻片宽度2~4mA/cm),一块26×76cm的玻片,用42~45V的端电压,端电压是用万用电表测量琼脂板两端所得的实际工作电表压,并不是电泳仪表指针所示的电压。电泳时间为1~2h;⑤加入抗体,电泳完毕,用柳叶刀沿玻璃棒两侧划开琼脂,取出玻棒(用小镊子取出),即成为抗体槽,用毛细管滴加抗体,注意勿使抗体溢出;

⑥加毕抗体后,将琼脂板放入有盖浸有湿纱布的搪瓷盘中,置37℃恒温箱中扩散24h之后,取出,观察结果;

⑦染色,将琼脂板放生理水中浸泡24h,中间换液数次,取出后,用005%氨基黑10B染色5~10min,然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止;

⑧保存标本的染色方法,取出琼脂板,浸泡于生理盐水中1~2天,以除去未起反应的蛋白质,再放置蒸馏水中脱盐4~5h,放固定液(60%酒精98ml、冰醋酸2ml)中2h,然后用绸布或滤纸打湿后,覆盖于琼脂板上,置37℃24h干燥后,再以蒸馏水打湿绸布,揭去。再放在氨基黑10B染色液(氨基黑10B05g,1mol/L醋酸500ml、01mol/L醋酸钠500ml)或偶氮胭脂红染色液中染色10~30min,取出以5%~10%冰醋酸脱色,至背景无色为止,用水冲几次,吸干水分,保存备用。

3结果

(1)常见的沉淀弧形:

由于经电泳后,分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散,而相应的抗体呈直线扩散,因此形成的沉淀线一般多呈弧形,常见的弧形如下:

①交叉弧,表示两个抗原成分的迁移率相近,但抗原性不同;

②平行弧,表示两个不同的抗原成分,它们的迁移率相同,但扩散率不同;

③加宽弧,一般是由于抗原过量所致;

④分枝弧,一般是由于抗体过量所致;

⑤沉淀线中间逐渐加宽,并接近抗体槽,一般由于抗原过量,在白蛋白位置处形成;

⑥其他还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。

(2)沉淀弧的曲度:匀质性的物质具有明确的迁移率,能生成曲度较大的沉淀弧。反之有较宽迁移范围的物质,其沉淀弧曲度较小。

(3)沉淀线的清晰度:沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关,也与抗体的来源有关。抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗血清的特点是形成沉淀线宽而淡,抗体过量对沉淀线影响较小,而抗原过量时,沉淀线发生部分溶解。马抗血清所形成的沉淀线致密,清晰,抗原或抗体过量时,沉淀线易溶解、消失,而且易产生继发性的非特异性沉淀线,因此,使用的抗原和抗体的比例要适当。

(4)沉淀弧的位置:高分子量的物质扩散慢,所形成的沉淀线离抗原孔较近,而分子量较小的物质,扩散速度快,沉淀弧离抗体槽近一些。抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽。反之,抗体浓度高,沉淀弧偏近抗原孔。

4注意事项

(1)免疫电泳法较他它电泳的优点在于具有特异性沉淀弧,即使电泳迁移率相同的组分也能检出,因此抗原数目可用独立弧来断定,缺点是免疫血清不能包括所有组分的抗体,其实这也是免疫化学方法的共性。

(2)在加入抗原时,为了观察方便起见,可于样品中加一滴电泳指示剂(聚蔗糖025ml,巴比妥缓冲液10ml,偶氮胭脂红005g),这样便于随时掌握电泳的位置而决定结束电泳的时间。

(3)在观察免疫电泳结果时要注意,有些沉淀出现较早,消失很快。

(4)由于琼脂的质量与规格不同,将影响标定各抗原的位置。为此,最好用标准抗原或国际通用琼脂定位,作为鉴定时的参考指标。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司电话咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297
本公司提供的试剂为实验研究试剂,仅供科研使用!不得用于临床诊断!
鄂ICP备18027482号  ©2019 武汉新启迪生物科技有限公司 版权所有