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血管活性肠肽通过mTOR信号传导诱导人成纤维细胞中葡萄糖和中性氨基酸摄取

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发表时间：2019-11-21 13:52作者：武汉新启迪Xinqidi来源：www.qidibio.com

血管活性肠肽通过mTOR信号传导诱导人成纤维细胞中葡萄糖和中性氨基酸摄取

摘要

营养物质通过胎盘的转运涉及滋养层细胞特异性转运蛋白，该转运蛋白通过雷帕霉素（mTOR）的哺乳动物靶标进行调节。血管活性肠肽（VIP）在小鼠中具有胚胎营养作用，并调节人成纤维细胞的迁移和侵袭。在这里，我们探讨了VIP对人滋养层细胞（天鹅71和BeWo细胞系）摄取葡萄糖和系统A氨基酸的影响。VIP通过PKA，MAPK，PI3K和mTOR信号通路以浓度依赖的方式激活了单个细胞滋养层细胞中D-葡萄糖的特异性摄取。VIP敲除的细胞滋养层细胞中的葡萄糖摄取减少。此外，VIP刺激了系统A氨基酸的摄取以及GLUT1葡萄糖转运蛋白和SNAT1中性氨基酸转运蛋白的表达。VIP增加mTOR表达和mTOR / S6磷酸化，而VIP沉默降低mTOR mRNA和蛋白表达。雷帕霉素对mTOR信号的抑制作用降低了内源性VIP和VIP诱导的S6磷酸化的表达。我们的发现支持VIP在通过mTOR调节的途径在细胞滋养层细胞中的葡萄糖和中性氨基酸转运中的作用，并且它们对于了解母体-胎儿界面处的内源性VIP对营养感测的生理调节具有帮助。

介绍

葡萄糖的转运，通过胎盘氨基酸等营养成分包括滋养细胞特异性转运蛋白和其调节为胎盘功能和胎儿生长关键1，2，3，4。胎儿侧母体营养物质的缺乏或过多会影响胎儿的生长速度，并成为诸如子宫内生长受限（IUGR）的临床并发症或孕周期新生儿的较大并发症。这些病症与围产期发病率和在成年生活心血管和代谢疾病的节目相关5，6，7，8，9，10，11。同样，胎盘的结构和生理特征，在任何给定的妊娠阶段，效率都会改变，预示着许多疾病

成人结局9。葡萄糖和滋养层细胞的氨基酸摄取能力高度依赖于转运的数量，密度，分布和活动1，2，3。GLUT1和GLUT3是位于合体滋养层细胞质膜上的主要葡萄糖转运蛋白，合体滋养层细胞是绒毛2内衬的潜在滋养层细胞融合产生的连续营养交换区域。GLUT1被认为是人类的主要胎盘葡萄糖转运蛋白，从孕早期到学期3，它在滋养层细胞中高表达。。从母体循环氨基酸的摄取主要是由滋养层细胞表达系统A和系统L转运蛋白介导1。系统A 通过钠耦合中性氨基酸转运蛋白SNAT1，SNAT2和SNAT4，以Na +依赖性方式（非内向Na +梯度）转运非必需的中性氨基酸，降低浓度梯度，而系统L通过交换它们来介导必需氨基酸的吸收。由系统A 2在滋养层细胞内部驱动的非必需氨基酸。

越来越多的证据支持由滋养细胞在感测母体营养物可用性和响应胎盘和胎儿发育的要求表达的雷帕霉素的哺乳动物靶标（mTOR）中起关键作用8，12，13，14，15，16，17。滋养层的mTOR激活和信号传导是由葡萄糖，氨基酸，脂质和叶酸水平在母体循环调制8，15，18，由氧的供给19，以及通过激素和生长因子如胰岛素，IGF-1或EGF 8。

的机制和葡萄糖的效应和足月胎盘合体细胞氨基酸转运已经广泛报道2，20，21，22，23，24。然而，关于细胞滋养层细胞对它们的摄取知之甚少，而细胞滋养层细胞与早孕至足月发生的关键过程特别相关。确实，滋养层细胞的增殖和向侵袭性表型的分化，它们在血管转化过程中与血管平滑肌或内皮细胞的相互作用以及调节母体白血球形态以维持免疫稳态的细胞因子的释放都是在胎盘植入过程中所有需要能量的过程25，26，27。后来，人足月胎盘的滋养层细胞比体外合体滋养层细胞表现出更大的糖酵解和耗氧量28，这表明了滋养层细胞在胎盘代谢中的核心作用。

滋养层细胞合成通过靶向附近合体细胞，内皮产妇，基质血管细胞和免疫细胞有利于胎儿生长各种激素，生长因子和细胞因子25，26，27。血管活性肠肽（VIP）已被调节胎盘功能和基于其对免疫，血管和细胞滋养层细胞的作用胎儿生长的那些细胞外线索中的一个中提出的29，30，31，32，33。VIP是由滋养细胞合成并在结合VPAC1调节激素和生长因子的释放和VPAC2受体34，35，36，37。VIP在小鼠和大鼠妊娠embryotrophic和神经营养作用 38，39，40，41。一致地，滋养层细胞而不是母体组织中的VIP缺乏对鼠妊娠结局有不利影响，胎儿体重减轻，胎盘结构改变和免疫稳态丧失 42。到目前为止，尚不清楚VIP对细胞滋养层细胞营养转运的作用。

本研究的主要目的是探讨VIP对人滋养细胞细胞摄取葡萄糖和System A氨基酸的影响。通过在单个活细胞中的葡萄糖摄取测定系统，我们证明了VIP刺激了两种人类成纤维细胞细胞系，早孕成纤维细胞来源的Swan 71细胞系和BeWo细胞系中的葡萄糖转运。雷帕霉素对mTOR的抑制作用降低了VIP对葡萄糖摄取的影响。VIP还刺激了系统A的氨基酸转运和SNAT1表达。提出了VIP和mTOR在营养滋养层和细胞滋养层细胞转运中的相互作用。

结果

VIP诱导细胞滋养层细胞系中特定的葡萄糖摄取

我们通过将细胞与荧光D-葡萄糖类似物2-NBDG直接孵育，然后进行流式细胞仪检测，进行了用于检测单个活细胞中葡萄糖摄取的灵敏测定。荧光探针在人滋养细胞衍生细胞系Swan 71中的掺入以荧光素的百分比（图 1a）或荧光强度平均值（图1b，c）的存在/不存在荧光素的存在进行了分析，葡萄糖转运抑制剂。该测定在不同时间或以不同浓度的D-葡萄糖进行。图 1a–c显示了Swan 71滋养细胞快速饱和葡萄糖的摄取。2至10分钟之间的线性度（图 1b）提供了10分钟的合适时间来评估整个过程中不同刺激的效果。接下来，我们研究了VIP对人成纤维细胞中葡萄糖摄取的影响。如图1d所示，VIP以浓度依赖的方式诱导了妊娠早期的滋养细胞细胞中2-NBDG的摄取显着增加。实际上，VIP的有效浓度在10到100 nM之间，因此我们接下来分析了50 nM VIP或50 ng / ml白血病抑制因子（LIF），这是一种参与胎盘形成过程43的gp130家族细胞因子，可诱导小鼠骨骼肌摄取葡萄糖。44。图 2a结果表明，在天鹅71和BeWo细胞系中，与VIP短时间孵育增加了2-NBDG摄取，其程度与LIF相似。与流式细胞仪测定的结果一致，如通过荧光显微术在两种细胞系中测量的，VIP还增加了2-NBDG的掺入（图 2b）。在此基础上滋养层细胞合成VIP 29，35和VIP调节细胞滋养层细胞的功能，通过自分泌环29接下来，进行功能丧失实验，以研究内源性VIP在调节滋养层葡萄糖摄取中的相关性。我们进行撞倒天鹅71和将BeWo细胞72小时使用VIP siRNA实验，并与加扰转染的细胞作为先前确认到小于50％的VIP表达的降低后29，31，测定2-NBDG掺入通过流式细胞仪。图2c中显示的结果表明，VIP沉默在两种细胞系中均降低了2-NBDG的摄取，表明内源性VIP参与了滋养层细胞葡萄糖转运。

VIP增加细胞滋养层细胞系中GLUT1和GLUT3葡萄糖转运蛋白的表达

接下来，我们研究了VIP是否还能调节人胎盘GLUT1（SLC2A1）和GLUT3（SLC2A3）中表达的主要葡萄糖转运蛋白的mRNA和蛋白表达。在人类滋养层细胞系Swan 71和BeWo中，在不存在/存在50或100 nM VIP的情况下培养6 h，进行RT-qPCR，Western印迹和流式细胞术。如图 3a（左图和右图）所示，VIP诱导了两种细胞系中GLUT1葡萄糖转运蛋白的mRNA和蛋白表达。VIP也诱导了GLUT3 mRNA，但是，在蛋白质水平上未发现GLUT3表达的变化（未显示）。

VIP引起的葡萄糖摄取通过PKA，MAPK，PI3K和mTOR信号传导介导

为了阐明VIP调节D-葡萄糖转运所涉及的机制，我们研究了主要的信号通路，描述了其特异性受体VPAC1和VPAC2的下游VIP激活：蛋白激酶A（PKA），蛋白激酶C（ PKC）和MAP激酶（MAPK）。2-NBDG掺入试验表明，用PKA抑制剂H89（10 µM）或MEK抑制剂PD 98059（50 µM）预处理滋养层细胞可防止50 nM VIP诱导的2-NBDG摄取增加，而PKC抑制剂STP不能阻止VIP作用（图 4a）。据报道，PI3K诱导mTOR复合物活化19，45和mTOR复合物是通过cAMP的激活并且会诱导GLUT1易位到质膜46，47。基于此证据，我们分析了PI3K和mTOR激活在VIP诱导的葡萄糖摄取调节中的作用。如图 4b所示， PI3K抑制剂Ly294502和mTOR抑制剂雷帕霉素均阻止了VIP诱导的2-NBDG摄取的增加。

VIP诱导人成纤维细胞中系统A钠耦合的中性氨基酸转运蛋白（SNAT）吸收氨基酸

基于VIP对葡萄糖摄取的影响和mTOR的参与，我们接下来评估了VIP对Swan 71和BeWo细胞系中System A氨基酸转运蛋白活性的影响。在含钠和无钠（用于非特异性转运）的Tyrode's溶液中测量了系统C的特定底物14 C-MeAIB 的掺入（图 5a）。在所有接下来的实验中，通过在两种条件下减去14 C-MeAIB摄入量来计算系统A活性。如图5b所示，VIP诱导了Swan 71和BeWo细胞中System A活性的显着增加。而且，VIP增加了人胎盘中存在的两种主要的System A转运蛋白SNAT1的表达，但没有增加SNAT2 mRNA的表达（图 5c，d）。

滋养层细胞系中VIP和mTOR的交叉调控

基于VIP对葡萄糖摄取的影响涉及mTOR的活性，并且敲除VIP的滋养层细胞掺入的葡萄糖比对照争夺转染的细胞少，我们探讨了mTOR与VIP之间的联系。VIP诱导mTOR表达（图 6a）和磷酸化（图 6b）。与在细胞滋养层细胞中VIP激活的mTOR磷酸化途径有关，VIP还诱导了S6的磷酸化，即底物mTOR下游激活，雷帕霉素抑制了该作用（图 6c）。还测试了内源性VIP在与mTOR交叉调节回路中的作用。VIP沉默的细胞表现出较低的mTOR mRNA和蛋白表达水平（图 6d）），相反，雷帕霉素对mTOR活性的抑制导致VIP的表达降低（图 6e）。

讨论区

我们的研究结果表明，VIP通过涉及mTOR的机制在细胞滋养层细胞营养运输中的调节作用。以下观察结果支持该提议：首先，VIP增加了两种人成纤维细胞细胞系对特定促性腺激素敏感的葡萄糖的摄取。滋养层细胞中VIP表达的缺乏导致葡萄糖摄取减少，而VIP诱导两种细胞系中的GLUT1 mRNA和蛋白表达以及GLUT3 mRNA表达。雷帕霉素是一种mTOR抑制剂，可阻止VIP诱导的葡萄糖摄取，葡萄糖摄取也依赖于PKA，MAPK和PI3K，但不依赖PKC信号传导。二，VIP增加Na +滋养层细胞中依赖型氨基酸转运以及SNAT1 mRNA和蛋白质表达。第三，VIP诱导了mTOR表达，磷酸化以及mTOR下游底物S6的磷酸化，这被雷帕霉素所阻断。平行地，在VIP表达中沉默的细胞呈现出mTOR的mRNA和蛋白表达降低。此外，雷帕霉素降低了VIP表达，表明VIP水平和VIP激活信号的调节是滋养细胞中下游的mTOR激活。

累积证据支持VIP在早期妊娠期间作为内源性调节肽的作用。在人类妊娠中，早孕和晚期三个胎盘的滋养细胞和合体滋养细胞表达VIP 35。VIP诱导人类滋养细胞JEG-3细胞系和人类滋养细胞原代培养物中的hCG和孕酮释放35。在天鹅71和HTR8 / SVneo人类细胞滋养层细胞系中，VIP通过CRE-PKA途径促进滋养层细胞迁移和侵袭29。与内源性VIP在细胞滋养层细胞调节中的积极作用相一致，被敲除的VIP细胞呈现出较低的金属蛋白酶31表达，减少了基础和LIF介导的迁移29以及他们无法调节母体白细胞的功能表型32。关于VIP的营养作用，它在第9.5 39天对卵黄囊移植的小鼠胚胎表现出胚胎营养作用，而相比野生型小鼠48，低出生体重的幼犬出生于VIP缺乏的母亲。另外，最近在VIP缺乏的鼠模型中证实了滋养层细胞表达的VIP含量降低和胎儿生长降低的关联42。据报道，孕妇在缺乏VIP的滋养层滋养细胞的情况下，在妊娠第14.5天体重减轻，并出现了胎盘的一些结构异常42。有趣的是，观察到的胎儿体重减少与胎盘体重降低无关，这提示胎盘中多肽的代谢作用而非营养作用42。

基于细胞滋养层细胞支持合胞体的多种能量需求功能，我们在此测试了VIP可以通过调节细胞滋养层细胞对葡萄糖和氨基酸摄取的调节来促进胎盘代谢的假设。我们的结果清楚地支持了这一提议，因为VIP增加了两个人类滋养层细胞衍生细胞系（Swan 71和BeWo）中葡萄糖和氨基酸的转运，这两个细胞系具有细胞滋养层细胞的许多特征，并使BeWo细胞具有合体能力。这里显示的用于调节葡萄糖和氨基酸摄取的VIP浓度范围与最近报道的人类滋养层细胞系迁移和侵袭的浓度范围相同29以及滋养细胞在人的早孕胎盘外植体原代培养中的迁移31。因此，VIP浓度使用这里与VPAC1和VPAC2受体介导的影响是一致的，在天鹅71和表达的BeWo两种亚型细胞滋养层31，37。此外，VIP不仅诱导葡萄糖和氨基酸转运，而且还增加了GLUT1 mRNA和蛋白以及GLUT3 mRNA葡萄糖转运蛋白的表达。同样，VIP增加了SNAT1氨基酸转运蛋白亚型的表达。孕妇循环葡萄糖是胎儿和胎盘生长的主要能量底物3。过剩家庭三种亚型，GLUT1，GLUT3和GLUT4，参与滋养葡萄糖的摄取，与GLUT1和GLUT3较高的相关性，因为它们组成的滋养层膜上表达的24，49。GLUT1是妊娠早期和足月49时唯一大量表达的亚型。在另一方面，SNAT1和SNAT2活动的增加在整个动物模型和酝酿从孕早期到足月人胎盘50，51。胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF1）已经被指定为，通过增加葡萄糖的转运促进胎儿的生长的主要细胞外信号和氨基酸中的滋养层细胞8，52，53，54。VIP对葡萄糖摄取的快速作用似乎是直接的，而不是由胰岛素或IGF1释放介导的，因为VIP仅在20分钟的时间间隔内添加。但是，如此处所示，VIP诱导了细胞滋养层细胞中GLUT1和SNAT1表达的事实强烈表明，作为生长因子的VIP可以使滋养层细胞中的葡萄糖和氨基酸转运进一步持久地适应性激活。基于在孕妇血清和脐带血中以2-15 pM的浓度检测到VIP，55，VIP很可能在整个怀孕期间都靶向胎盘细胞，尽管其半衰期很短，但它可能会迅速触发受体介导的信号传导，从而维持母体-胎盘界面的代谢和营养功能。

VIP受体主要耦合到GS增加cAMP和激活PKA，串扰在涉及NOS平行或下游cAMP信号56，PKC 57，磷脂酰肌醇3-激酶58，MAPK 59，60，61，62，63，JAK / STAT和NF-kB的64，65。我们在滋养细胞细胞中的结果表明，由PI3K，MAPK，PKA，mTOR介导但不由PKC激活介导的磷酸化途径与VIP诱导的葡萄糖摄取有关。通过PI3K和mTOR介导的磷酸化在葡萄糖摄取由棕色脂肪细胞和肺腺癌细胞牵连46，47。反过来，在BeWo滋养细胞中，抵抗素诱导的葡萄糖转运涉及MAPK介导的磷酸化66。mTOR整合了涉及胎儿和胎盘生长的多种激素，压力和能量信号。葡萄糖和氨基酸转运由mTOR途径响应于像IGF1，胰岛素和瘦蛋白母体信号调节14，67，68，69，所有显示，或通过抑制等的脂联素，缺氧信号的刺激作用17，68，70。在培养的原代人滋养细胞中，胰岛素和IGF1对系统A活性的刺激依赖于mTOR信号传导8，类似于VIP对两种人滋养细胞来源的细胞系葡萄糖摄取的刺激作用。

最后，值得注意的观察是VIP和mTOR信号在滋养细胞中似乎相互调节：VIP诱导mTOR表达和mTOR / S6磷酸化。沉默VIP表达可下调mTOR mRNA和蛋白的水平，反之，用雷帕霉素抑制mTOR活性可降低VIP蛋白表达和VIP诱导的S6磷酸化，S6是下游mTOR激活的底物。这些观察结果以及VIP沉默细胞中的葡萄糖摄取减少或阻断mTOR和主要VIP信号级联反应后，强烈支持了细胞滋养层细胞中mTOR和VIP信号通路的串扰。从而，滋养细胞细胞表达的VIP的水平及其对VIP刺激的反应性似乎微调了mTOR整合受滋养细胞感测的环境的多种信号的能力。在VIP水平下降或滋养层细胞对VIP刺激反应较差的情况下，葡萄糖和氨基酸的摄取将下调，而mTOR介导的养分摄取也会受到损害，这在IUGR的几种模型中均观察到。已经提出了在视交叉上神经元中mTOR和VIP表达之间的联系在IUGR的多个模型中观察到的情况。已经提出了在视交叉上神经元中mTOR和VIP表达之间的联系在IUGR的多个模型中观察到的情况。已经提出了在视交叉上神经元中mTOR和VIP表达之间的联系71。缺乏mTOR表达的小鼠表现出较低的VIP表达和对持续光刺激的敏感性改变 71。同样，在条件性mTOR基因敲除小鼠模型中证实了VIP表达与mTOR信号转导之间的功能相关性，其中mTOR基因在VIP表达细胞中被特异性敲除 72。在这些动物中观察到昼夜节律行为不稳定，视交叉上核中细胞之间的同步性减弱以及嗅觉敏感性降低。目前尚无关于人类成纤维细胞中VIP和mTOR之间关系的报道，但确凿证据表明，mTOR抑制会损害前三个月天鹅Swan 71滋养细胞中的滋养细胞侵袭和迁移 12。迁移和侵袭的减少是被VIP击倒的Swan 71细胞滋养细胞29的特征，在当前数据中，相同的细胞显示出mTOR表达降低。综上所述，这些观察结果强烈表明VIP通过mTOR激活来调节细胞滋养层的细胞功能和营养转运。

据我们所知，这是关于VIP对细胞滋养层细胞养分吸收影响的第一个报道。考虑到细胞滋养层细胞的各种功能，这些作用在妊娠的各个阶段似乎都是相关的，而细胞滋养层细胞需要在胎盘早期及之后的快速可用能量来源，以作为合胞体的支持。此外，此处显示的VIP和mTOR信号在细胞滋养层细胞中进行葡萄糖转运的相互调节，支持细胞滋养层在整个孕期检测母体营养素的可用性和胎盘需求方面的重要作用，并且与最近报道的证据表明，细胞滋养层而不是合体滋养层细胞占主导地位人体胎盘中的糖酵解和氧化磷酸化28。虽然这是体外因此，我们无法确定这些机制是否在体内起作用，因此我们目前的观察结果有助于理解VIP作为胎盘代谢相关分子之一的作用。

方法

滋养细胞来源的细胞系培养

使用了两种人滋养细胞来源的细胞系。BeWo细胞系来源于人胎盘绒毛膜癌，吉尔·莫尔教授（耶鲁大学，纽黑文，美国）通过端粒酶介导的7周细胞滋养层分离株转化获得了Swan 71细胞系。将细胞保持在37°C，5％D 2的Dulbeco改良Eagle培养基和营养混合物F12（DMEM-F12）（Life Technologies，Grand Islands，NY，US）中并添加10％热灭活胎牛血清的培养瓶中（FBS），2mM谷氨酰胺（Sigma-Aldrich公司，密苏里州，美国）和100 U.ml -1链霉素-100μg.ml -1青霉素溶液（Life Technologies公司，大岛，NY，US）27，73。

VIP沉默

如先前所述29，用VIP siRNA（Santa Cruz Biotechnology，达拉斯，美国，德克萨斯州）转染Swan 71和BeWo细胞。简而言之，细胞在60％融合时生长，并在Optimem®中停滞3 h。在Optimem中制备100 nM VIP siRNA：Lipofectamine RNAimax（生命技术，美国纽约州格兰德岛）复合物，孵育15分钟，然后逐滴添加至细胞中。具有加扰序列的siRNA用作阴性对照（Scrb1）。

2-NBDG摄取

培养2×10 4 Swan 71或BeWo细胞直至亚汇合。用冷PBS洗涤细胞，并在无葡萄糖的DMEM-F12培养基中孵育10分钟。为了进行动力学分析，使用了100μM2-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二氮杂-4-基）氨基）-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）（Molecular Probes，Oregon，US）在37°C，5％CO 2下添加2–90分钟。敲打VIP时，在37°C，5％CO 2下添加100μM2-NBDG 10分钟与无葡萄糖的DMEM-F12培养基孵育后。当添加刺激时，在添加2-NBDG荧光探针之前，将细胞在具有刺激的无葡萄糖的DMEM-F12培养基中孵育10分钟。对于涉及信号通路抑制剂的测定，在20分钟内添加10 µM H89（PKA抑制剂），5 nM STP（PKC抑制剂），50 µM PD98059（MEK抑制剂），10 µM Ly294502（PI3K抑制剂）或100 nM雷帕霉素（mTOR抑制剂）在刺激之前。将细胞用冷PBS短暂洗涤两次，用胰蛋白酶消化，然后重悬于PBS中的2％FBS中以进行流式细胞术分析。所有测定均与1 mM葡萄糖转运抑制剂Phloretin（Sigma Aldrich，密苏里州，美国）并行进行。通过从总摄取中减去在存在荧光素的情况下的摄取来计算比葡萄糖的摄取。http://www.flowjo.com/）。对于荧光显微镜，将在有/无VIP的情况下培养的细胞与100μM2-NBDG孵育3分钟，并立即拍摄照片。

蛋白质印迹

接种细胞直至亚汇合。对于蛋白质表达，在DMEM-F12 2％FBS中添加50/100 nM VIP 6小时，并用添加有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液收获细胞，以进行蛋白质提取和定量。对于mTOR和S6磷酸化测定，在2％或0％FBS的DMEM-F12中添加50 nM VIP 20分钟。在刺激前20分钟加入100 µM雷帕霉素。用补充有蛋白酶抑制剂混合物和1 mM原钒酸钠的RIPA缓冲液收获细胞。如先前所述进行蛋白质印迹29稍作修改。将30或50 µg蛋白质提取物与含有0.05％β-巯基乙醇的Laemmli Sample Buffer 2×（美国加利福尼亚州，BioRad）混合。对样品进行SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE运行缓冲液：125 mM Tris，975 mM甘氨酸，0.25％SDS，pH 8.3），并在1:15 h内电印迹到硝酸纤维素膜（NC）上缓冲液：25 mM Tris，195 mM甘氨酸，0.05％SDS，pH 8.3和20％（v / v）甲醇）。通过在含有0.1％Tween 20和0.5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（25 mM Tris，137 mM NaCl，3 mM KCl，pH 7.4）中孵育1 h来封闭NC。然后，将NC与小鼠抗p-mTOR（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，US），小鼠抗GLUT1（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，US），兔抗p-S6（Cell信号，美国马萨诸塞州），小鼠抗β-肌动蛋白（圣克鲁斯生物技术，小鼠抗α-Tubulin（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术公司）或小鼠抗GAPDH（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术公司）单克隆抗体。用TBS-0.1％Tween 20洗涤后，将NC与抗小鼠或抗兔辣根过氧化物酶结合的抗体（ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州，美国）一起在室温下孵育1小时。洗涤后，使用增强的化学发光系统ECL Plus试剂盒和Luminescent Image Analyzer Amersham Imager 600（英国GE Healthcare）检测特异性抗体信号。为了进行剥离，将NC在Restore Western Blot剥离缓冲液（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州，美国）中于室温孵育15分钟。洗涤后，再次封闭NC，并如上所述进行操作。使用ImageJ软件（NIH，美国马里兰州）分析图像。小鼠抗α-Tubulin（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）或小鼠抗GAPDH（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）。用TBS-0.1％Tween 20洗涤后，将NC与抗小鼠或抗兔辣根过氧化物酶结合的抗体（ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州，美国）一起在室温下孵育1小时。洗涤后，使用增强的化学发光系统ECL Plus试剂盒和Luminescent Image Analyzer Amersham Imager 600（英国GE Healthcare）检测特异性抗体信号。为了进行剥离，将NC在Restore Western Blot剥离缓冲液（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州，美国）中于室温孵育15分钟。洗涤后，再次封闭NC，并如上所述进行操作。使用ImageJ软件（NIH，美国马里兰州）分析图像。小鼠抗α-Tubulin（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）或小鼠抗GAPDH（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）。用TBS-0.1％Tween 20洗涤后，将NC与抗小鼠或抗兔辣根过氧化物酶结合的抗体（ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州，美国）一起在室温下孵育1小时。洗涤后，使用增强的化学发光系统ECL Plus试剂盒和Luminescent Image Analyzer Amersham Imager 600（英国GE Healthcare）检测特异性抗体信号。为了进行剥离，将NC在Restore Western Blot剥离缓冲液（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州，美国）中于室温孵育15分钟。洗涤后，再次封闭NC，并如上所述进行操作。使用ImageJ软件（NIH，美国马里兰州）分析图像。小鼠抗α-Tubulin（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）或小鼠抗GAPDH（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）。用TBS-0.1％Tween 20洗涤后，将NC与抗小鼠或抗兔辣根过氧化物酶结合的抗体（ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州，美国）一起在室温下孵育1小时。洗涤后，使用增强的化学发光系统ECL Plus试剂盒和Luminescent Image Analyzer Amersham Imager 600（英国GE Healthcare）检测特异性抗体信号。为了进行剥离，将NC在Restore Western Blot剥离缓冲液（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州，美国）中于室温孵育15分钟。洗涤后，再次封闭NC，并如上所述进行操作。使用ImageJ软件（NIH，美国马里兰州）分析图像。小鼠抗α-Tubulin（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）或小鼠抗GAPDH（美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术）。用TBS-0.1％Tween 20洗涤后，将NC与抗小鼠或抗兔辣根过氧化物酶结合的抗体（ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州，美国）一起在室温下孵育1小时。洗涤后，使用增强的化学发光系统ECL Plus试剂盒和Luminescent Image Analyzer Amersham Imager 600（英国GE Healthcare）检测特异性抗体信号。为了进行剥离，将NC在Restore Western Blot剥离缓冲液（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州，美国）中于室温孵育15分钟。洗涤后，再次封闭NC，并如上所述进行操作。使用ImageJ软件（NIH，美国马里兰州）分析图像。

流式细胞仪

播种4×10 4 Swan 71或BeWo细胞直至亚融合。在DMEM-F12 2％FBS中分别添加50 nM VIP / 100 µM雷帕霉素6 h或24 h。对于VIP检测，通过Stop Golgi孵育4 h抑制蛋白质分泌。用Cytofix / Cytoperm TM胰蛋白酶消化，固定和透化细胞根据制造商的说明（美国加利福尼亚州圣何塞的Becton Dickinson公司）购买套件。将细胞洗涤两次，然后与小鼠抗SNAT1或兔抗VIP（Abcam，Cambridge，UK），小鼠抗GLUT3（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，US）或兔抗mTOR（Cell Signaling，Massachusetts，美国）室温下的单克隆抗体。将细胞洗涤两次，然后在室温下与抗小鼠Alexa 488 /抗兔Alexa 647（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州）的二抗孵育40分钟。用冷洗缓冲液洗涤两次并重悬于FACS溶液后，在FACS Aria IIcytometer®（Becton Dickinson，美国加利福尼亚州圣何塞）中获得了1万个事件，并使用FlowJo软件分析了数据（http：// www .flowjo.com /）。

定量PCR

通过定量逆转录聚合酶链反应如先前所描述（QRT-PCR）分析养分转运的mRNA的表达29。简而言之，4×10 4接种天鹅71或BeWo细胞直至亚汇合。在DMEM-F12 2％FBS中加入刺激6小时，然后用TriReagent（美国俄亥俄州分子研究中心）收获细胞，获得总RNA。按照制造商的说明（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），用DNAasa I处理1 µg RNA，以避免DNA污染，并使用MMLV逆转录酶，RNAse抑制剂和oligodT试剂盒（Promega Corporation，Madison，美国威斯康星州）。cDNA储存在-20°C进行批量分析。在Bio-Rad iQ5实时PCR系统中，将样品与SYBR Green PCR Master Mix（Roche，Basilea，瑞士）和正向和反向引物（表 1）一起孵育。使用阈值周期（CT）方法分析数据（2-- ΔΔCT 方法）标准化为内源GAPDH基因对照。

表1用于qRT-PCR分析的引物。

全尺寸表

系统A的氨基酸转运活性

14 C-MeAIB（[14 C] -甲基氨基异丁酸）摄取试验进行评价系统A氨基酸活动14，67。对于细胞系测定，播种8×10 4 Swan 71或BeWo细胞直至亚汇合。在DMEM-F12 2％FBS中添加刺激物20分钟，然后用含/不含Na +的 Tyrode's缓冲液（补充有胆碱，用于非特异性摄取）洗涤细胞。将14 C-MeAIB（美国马萨诸塞州PerkinElmer）在相应的Tyrode缓冲液中于37°C的5％CO 2加湿室中加入8分钟。用无Na +的冷Tyrode缓冲液洗涤细胞在室温下加入1 mL蒸馏水1 h裂解细胞。将含有14 C-MeAIB的蒸馏水与3 mL闪烁液（optiPhase HiSafe，美国Perkin Elmer，马萨诸塞州）充分混合，并在闪烁计数器（Beckman LS 6500，Fullerton，CA）中计数。使用14 C-MeAIB标准，摄取量以每毫克蛋白质每分钟皮摩尔14 C-MeAIB的量计算，从而使每种处理相对于通过Micro BCA蛋白质检测试剂盒（美国马萨诸塞州ThermoFisher Scientific）测量的蛋白质含量。通过从含Na +的缓冲液的摄取中减去无Na +的泰罗德缓冲液的摄取来确定系统A的活性。