摘要
胰腺癌是高度恶性的癌症，缺乏有效的治疗靶标。酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是糖尿病和肥胖症的有效治疗靶标，在肿瘤发生中也起着关键的积极或消极作用。但是，PTP1B在胰腺癌中的作用仍然难以捉摸。在这里，我们最初证明了PTP1B在胰腺肿瘤中高表达，并且与远处转移和肿瘤分期呈正相关，并表明生存期较差。然后，通过shRNA或特定的小分子抑制剂抑制PTP1B会显着抑制胰腺癌细胞的生长，迁移和集落形成，并在体外抑制细胞周期，并在体内抑制胰腺癌的进展。机制研究表明，PTP1B靶向PKM2 / AMPK / mTOC1信号传导途径来调节细胞生长。PTP1B抑制直接增加了PKM2 Tyr-105磷酸化，从而进一步导致AMPK显着激活，从而降低了mTOC1活性并导致对p70S6K的抑制。同时，由PKM2活性降低引起的PRAS40磷酸化降低也有助于抑制mTOC1。总的来说，这些发现支持PTP1B作为癌基因和PDAC的有希望的治疗靶点的概念。
胰腺导管腺癌（PDAC）是世界上致命性最强的癌症之一，预后最差，近年来其发病率有所增加1。迄今为止，由于晚期诊断和缺乏早期检测标记物2，胰腺癌的发生率几乎等于其死亡率。根据美国癌症协会的估计，到2030年PDAC将成为美国癌症相关死亡的第二大主要原因3。不幸的是，包括外科手术，全身化学疗法和放射疗法在内的标准疗法对患者生存的影响很小，导致5％的低生存率仅为6％4。结果，迫切需要探索潜在的治疗靶标，阐明胰腺肿瘤发生和癌症进展的生物学机制，并开发针对PDAC的新型治疗策略。
酪氨酸激酶和蛋白质-酪氨酸磷酸酶之间的异常相互作用破坏了控制细胞生长，分化和代谢5的许多信号转导途径内的信号传导程度。基于这些发现，由PTPN1编码的蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）引起了人们的极大兴趣，具有巨大的治疗潜力6。到目前为止，PTP1B已被确认为糖尿病和肥胖症7的治疗干预靶标，并且与基于树突状细胞的癌症免疫疗法有关8。此外，越来越多的证据表明PTP1B也参与了许多癌症的进展9。有趣的是，PTP1B在肿瘤发生中的作用是可变的，并且取决于肿瘤类型10。PTP1B在胃癌，前列腺癌，大肠癌，非小细胞肺癌和肝细胞癌中起肿瘤促进剂的作用，并通过放松癌基因或抑癌基因9与不良预后相关。在乳腺癌中，PTP1B在肿瘤发生中的作用已得到明确阐明，用PTP1B抑制剂治疗显着延迟了乳腺肿瘤的发展11。由于PTP1B在癌症中的重要作用，PTP1B抑制剂MSI-1436C（一种潜在的糖尿病药物）先前已在用于治疗转移性乳腺癌的I期临床试验中进行了测试12。相反，PTP1B被下调并在卵巢癌细胞13中充当BRK和IGF-1R信号的负调节剂，在B细胞淋巴瘤14中充当肿瘤抑制因子。迄今为止，尽管已经提出了肿瘤抑制因子和PTPN1的癌基因功能，但尚未有研究报道PTP1B在PDAC增殖和进展中的作用。由于PTP1B是糖尿病和肥胖症的靶标，这是PDAC 3的两个既定危险因素，因此确定PTP1B在胰腺癌中的作用非常重要。
因此，在这项研究中，我们发现PTP1B在胰腺癌组织中过表达，是维持胰腺癌细胞在体外和体内增殖和肿瘤生长所必需的。此外，我们发现PKM2 / AMPK / mTOC1信号通路对于PTP1B调节细胞生长至关重要。
在2010年10月至2016年6月之间，从第三军医大学西南医院获得了两组人体组织（组1：103个胰腺癌标本和13个正常胰腺标本，组2：15个胰腺癌标本和相应的癌旁组织）。随访一直持续到2016年6月20日，从PDAC手术日期到死亡或最后一次随访之间测量了PDAC患者的总生存期（OS）。所有人类样品收集程序均已获得第三军医大学西南医院相关伦理委员会的批准。手术前所有病例均获得知情同意。
PANC-1，MIA-PaCa-2，SW-1990，AsPC-1，PANC-28，BxPC-3细胞系获自中国科学院细胞银行（中国上海）。HPDE细胞系购自BeNa Culture Collection（中国北京）。实验中所有细胞系均通过STR DNA分析验证，支原体阴性。HPDE在RPMI 1640（Hyclone）中培养。SW-1990保留在L-15培养基（Hyclone）中。PANC-1，MIA-PaCa-2，AsPC-1，PANC-28，BxPC3在DMEM（Hyclone）中生长。所有培养基均补充有10％的胎牛血清（Gibco）和1％的青霉素/链霉素。除了SW1990在37℃下在无CO 2的培养箱中培养以外，所有细胞均在37℃下在5％CO 2的潮湿气氛下维持。
合成并鉴定了LXQ46（3,4-二溴-5-（5-（4-（4-乙氧基苯氧基）苯基）恶唑-2-基）苯-1,2-二醇（纯度98％）。本研究中使用的第一抗体：PTP1B（＃133259）从圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）获得。PARP（＃9532），Bcl-xL（＃2764），Phospho-AMPK（Thr172，＃2535），AMPK（＃2793S），Phospho-Akt（Ser473，＃4060），Akt（＃4685），Phospho-ERK（ Thr202 / Tyr204，＃4370S），ERK（＃4696S），Phospho-PRAS40（＃2640）和Ki67（＃9027）购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州丹佛市）。Bax（＃32503），Bcl-2（＃32124），CDK2（＃32147），CDK4（＃108357），CDK6（＃124821），Cyclin D1（＃134175），Phospho-Src（Tyr529，＃32078），Src （＃47405），Phospho-PI3K（＃182651），PI3K（＃86714），PRAS40（＃151719）购自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥市）。Phospho-p70 S6激酶（Thr389 / 412，＃3228）和p70 S6激酶（＃6226），Phospho-PKM2（Tyr105＃7771），PKM2（＃5234）购自Affinity Biosciences（美国俄亥俄州辛辛那提）。β-肌动蛋白抗体和所有第二抗体均来自Proteintech Group（武汉，中国）。
含有针对PTPN1的不同shRNA序列的重组载体（pGLV3-GFP＆puro-PTPN1）被称为LV3-shPTP1B（GenePharma，中国上海）。包含无意义shRNA的阴性对照载体（pGLV3-GFP＆puro-Con）被称为LV3-shCon（GenePharma，中国上海）。shRNA的序列如下：shPTP1B-1，5'-GGAAGAGACCCAGGAGGATAA-3'；shPTP1B-2，5′-GGAAATGCAGGGAGTTCTTCC-3′；shCon，5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。为了产生慢病毒，通过脂质转染胺（Invitrogen）将优化的包装质粒（pGag / Pol，pRev，pVSV-G）与LV3-shPTP1B或LV3-shCon载体一起转染293T生产细胞。72小时后，收集含有病毒的培养基，并在存在多溴的情况下用于感染靶细胞。然后，用嘌呤霉素（5μg/ mL）选择稳定的细胞。
PTP1B的全长编码序列被扩增。用NotI和NsiI消化PCR产物，并连接到pGLV-EF1a-GFP（LV-4，GenePharma，中国上海）。重组载体pGLV-GFP-PTP1B被命名为LV4-PTP1B。然后，如上所述进行慢病毒的产生和繁殖。
转染后，每孔接种2×10 3个细胞到96孔板中，并通过MTT法测定总细胞数。每48小时将MTT（Solarbio，北京，中国）添加到每个孔中，并与细胞孵育4小时。然后弃去上清液，并通过每孔添加150μLDMSO溶解MTT甲maz晶体。用酶标仪在490 nm下测量每个孔的光密度（OD）。
根据细胞系的不同，将5000–8000个细胞置于96孔板中，并在暴露于药物之前于37°C孵育过夜。然后，用LXQ46处理细胞48小时，以达到最终浓度（0、2.5、5、10、20μM）。如上所述，通过MTT测定法测定细胞活力。
消化并计数后，将感染慢病毒或用终浓度（0、5、10、15μM）的LXQ46处理过的PANC-1或MIA-PaCa-2细胞48 h接种到6孔板中的1000个细胞中/孔，并保持在含有10％FBS的培养基中。接下来，将板在标准条件下孵育10-14天。将每个孔中的菌落用4％多聚甲醛（PFA）固定，用0.5％结晶紫染色，计数并拍照。
消化细胞，然后洗涤两次，并用无血清DMEM重悬。将细胞密度调节至5×10 5细胞/ ml，并将200μl稀释的细胞接种到Costar 24-transwell分析板的上腔室中，然后将600μl的10％FBS DMEM作为化学吸引剂添加到下腔室中。孵育24小时后，将滤膜用PBS洗涤，用棉签擦拭，然后用4％多聚甲醛固定30分钟。然后，将上腔室用0.5％的结晶紫染色10分钟，并用蒸馏水冲洗。此后，使用显微镜对腔室照相。通过Image J软件对每个图像中的细胞数量进行计数。
通过DNA流式细胞仪分析细胞周期分布。通过在无血清培养基中培养细胞24小时（4×10 5个细胞/孔），然后进行指定的处理。随后，收获细胞，用PBS洗涤两次，并在-20°C的70％冷乙醇中固定过夜。然后洗涤细胞，并与含有20 µg / mL RnaseA（Sigma，圣路易斯，美国密苏里州）和50 µg / mL碘化丙啶（PI，Sigma，圣路易斯，美国密苏里州）的冷PBS孵育30分钟。在流式细胞仪（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，美国）上进行分析之前，在37°C下进行。使用ModFit LT软件（Verity Software House，Topsham，ME，美国）确定细胞周期各个阶段的细胞百分比。
用含有新鲜添加的PMSF裂解缓冲液的冰冷RIPA缓冲液裂解裸鼠的培养细胞和肿瘤组织。使用BCA蛋白质检测试剂盒（Beyotime，中国广州）对总蛋白质进行定量。通过SDS-PAGE分离细胞裂解物，并转移至PVDF膜上（Millipore，Billerica，MA，USA）。在室温下，将膜在含0.05％Tween 20（TBST）的1x Tris缓冲盐水中的5％脱脂牛奶中封闭，在室温下放置1 h，然后在4°C下与一抗孵育过夜，然后与HRP-偶联的二抗在室温下放置1小时。使用增强的化学发光（ECL）试剂（Bio-Rad，Hercules，CA）和ChemiDoc XRS成像系统（Bio-Rad，
所有涉及动物的实验程序均按照中国科学院海洋研究所动物护理和使用委员会批准的HAIFAJIZI-2013-3协议（批准日期：2013-12-09）进行，并符合所有适当的监管标准。
将感染了LV3-shPTP1B-1或LV3-shCon的5×10 6个存活的PANC-1细胞重悬于100μlPBS中，并皮下接种到5-6周龄BALB / c裸鼠的右前腋窝中（Vital River Laboratory中国北京动物科技有限公司，每组六只小鼠（三只雌性和三只雄性）。每组每两天监测一次肿瘤体积（长×宽2/2）和体重。接种24天后处死所有小鼠，切除肿瘤，称重并照相。
将总共4×10 6个 PANC-1细胞/小鼠皮下接种到裸鼠（5-6周大）的右侧腹中，以开始肿瘤生长。一周后，当肿瘤大小达到约100 mm 3时，将小鼠随机分为三组（n = 6）。阴性对照组接受媒介物治疗，其他组每天一次腹膜内注射LXQ46（50 mg / kg和100 mg / kg），持续18天。每三天测量一次肿瘤体积（长×宽2/2）和小鼠体重。实验结束时，对小鼠实施安乐死，并分离肿瘤，称重并拍照。
用福尔马林固定人体组织和肿瘤异种移植组织，并包埋在石蜡中。然后准备3–4μm厚的组织切片进行分析。对于免疫组织化学，将石蜡切片去石蜡并重新水化，并与一抗在4°C下孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将切片与二抗在室温下孵育30分钟，并用抗生蛋白链菌素-HRP处理。为了进行组织学分析，将标本用苏木精和曙红（H＆E）染色以鉴定形态学变化。使用光学显微镜（Nikon，东京，日本）观察组织切片。如先前报道的15量化蛋白质表达的染色分数。
每个实验重复三遍。除非另有说明，否则所有数据均以平均值±SEM值表示。两组的比较通过两尾学生t检验（SPSS 19.0，美国）进行。使用单向方差分析（ANOVA），然后进行Tukey 事后检验，分析三组或更多组之间的比较。Kaplan-Meier方法用于计算患者的生存概率。卡方检验用于评估PTP1B与PDAC患者特征之间的关系。GraphPad Prism 6.0软件用于统计评估。统计学上的显着差异定义为P <0.05。
为了解PDAC中PTP1B的临床相关性，我们检查了15名患者中成对的PDAC和邻近的正常胰腺组织中PTP1B的表达。如图1a，b所示，与周围的非肿瘤对应物相比，在13个肿瘤部位中PTP1B表达高度升高。通过使用组织微阵列（13个正常胰腺样品和103个PDAC组织样品），我们还观察到PTP1B在肿瘤样品中过表达，但在正常组织中很少表达（图1c，d）。总之，PTP1B在肿瘤组织中的表达明显高于非肿瘤组织。然后，我们使用免疫印迹比较了正常胰腺导管细胞系（HPDE）和一系列PDAC细胞系中PTP1B的表达。结果表明，PTP1B表达在PDAC细胞系中显着增加（图1e）。此外，我们调查了PTP1B表达水平与PDAC患者预后的相关性。结果表明，PTP1B水平低的患者的总生存时间明显高于PTP1B水平高的患者（图1f）。此外，分析了PTP1B与临床病理参数之间的关系，并在表1和补充表中列出。1。我们发现PTP1B表达与胰腺癌远处转移（p = 0.002）和肿瘤分期（p = 0.004）正相关。综上所述，这些数据证实了我们的假设，即PTP1B与PDAC的进展高度相关，并可能被认为是PDAC诊断的潜在生物标记。
a，c PTP1B在组织中的表达通过免疫组织化学（IHC）分析（比例尺，200μm和50μm）进行检测。b，d在肿瘤和非肿瘤性肿瘤组织中PTP1B的染色指数。通过蛋白质印迹法检查正常胰腺导管细胞系（HPDE）和不同胰腺细胞系中PTP1B蛋白的水平。f Kaplan–Meier分析胰腺癌患者PTP1B水平与总生存期之间的相关性（对数秩检验p = 0.001）。
接下来，为了评估是否需要PTP1B来维持胰腺癌细胞的生长，我们使用特异的shRNA敲低PANC-1和MIA-PaCa-2细胞中的PTP1B。与加扰的shRNA相比，shPTP1B-1和shPTP1B-2均显着降低了稳定细胞系中PTP1B的表达（图2a）。然后，在LV3-shRNAs转染后72小时，shPTP1B处理的细胞的细胞数显着低于对照的细胞数（补充图1）。此外，MTT分析结果表明，沉默PTP1B可以显着抑制PDAC细胞的增殖（图2b）。正如集落形成所证明的，PTP1B敲低也抑制了癌细胞的生长（图2c，d）。此外，流式细胞仪分析表明，沉默PTP1B可以显着提高G0 / G1比，并降低S期细胞的百分比（图2e，f），表明PTP1B的丢失导致G0 / G1期细胞周期停滞。因此，与对照细胞中的水平相比，PTP1B敲低细胞中G1-S过渡的几种细胞周期调节剂CDK2，CDK4和Cyclin D1被下调（图2g）。值得注意的是，沉默PTP1B时生长的减少主要是由于细胞增殖减少，而不是细胞凋亡，因为我们没有发现PTP1B缺陷细胞中裂解的PARP和Bax显着增加或Blc-2和Bcl-xL减少（补充图2a）。）。此外，鉴于上述PTP1B与PDAC远处转移之间的正相关关系（表1），我们探索了PTP1B在PDAC细胞运动中的作用。因此，进行了transwell测定，其揭示了敲低PTP1B抑制了癌细胞的迁移能力（图2h，i）。PTP1B沉默引起的所有这些效应与PTP1B敲低的效率呈正相关，表明PTP1B有助于胰腺癌细胞的致癌表型。
通过Western印迹检测shRNA在PANC-1和MIA-PaCa-2细胞中对PTP1B蛋白的显着抑制作用。LV3-shPTP1B1和LV3-PTP1B2具有不同的PTP1B靶向序列，用于这项研究。b PTP1B抑制可抑制胰腺癌细胞的生长。通过MTT测定法测量细胞生长。每个时间点有四个重复。c，d菌落形成分析表明PTP1B沉默降低了细胞增殖。代表性图像显示在（c）中。定量分析示于（d）中。e，f PTP1B敲低诱导细胞周期停滞在G0 / G1期，使用流式细胞仪通过PI染色进行分析。g通过Western印迹检测到一组与G1-S过渡有关的信号分子，发现在PTP1B敲低的PANC-1和MIA-PaCa-2细胞中这些信号分子被下调。h，i Transwell迁移分析表明，PTP1B的敲低显着降低了PDAC细胞的转移。代表性图像以（h）表示（比例尺，100μm）。定量分析显示在（i）中。所有定量数据均表示为三个独立实验的平均值±SEM， 相对于对照组，* p < 0.05 ，** p < 0.01。
由于我们的发现证明PTP1B促进了胰腺癌的进展，因此我们进一步探讨了PDAC1在PDAC细胞系中过表达的功能以支持我们的假设。为此，我们用LV4-PTP1B转染了PANC-1和MIA-PaCa-2细胞，以实现PTP1B过表达（图3a）。细胞生长和集落形成试验表明，PTP1B的过表达显着促进了胰腺癌细胞的增殖（图3b-d）。迁移分析还用于进一步评估PTP1B过表达对PDAC细胞系的影响，并显示细胞迁移由于PTP1B过表达而显着增加（图3e，f）。
一个表明PTP1B Western印迹在PANC-1和MIA-PACA-2细胞中被上调转染LV4-PTP1B之后。b – d用LV4-PTP1B转染后，通过MTT分析和集落形成分析检测了PDAC细胞系的增殖和生长。（b）中显示了PANC-1和MIA-PaCa-2的细胞生长曲线。（c，d）中显示了代表性图像和菌落形成测定的定量分析。e，f通过transwell测定法显示了胰腺癌细胞的迁移能力。代表性图像显示在（e）中（比例尺，100μm）。定量分析示于（f）。所有实验均重复三次。* p <0.05，** p <0.01与对照组。
鉴于胰腺癌细胞增殖依赖于PTP1B，我们使用药理学方法进一步研究了PTP1B在PDAC细胞中的促生存功能。因此，我们开发了一种有效的选择性PTP1B抑制剂LXQ46（图4a），并测试了其在PDAC细胞系中的功效。LXQ46是PTP1B的具有IC的特异性抑制剂50 0.190的μM 16。首先，我们使用蛋白质印迹法确定LXQ46对PTP1B表达没有抑制作用（补充图3a）。）。然后，我们分析了LXQ46对胰腺癌细胞系（包括PANC-1，MIA-PaCa-2，SW-1990，AsPC-1，PANC-28和BxPC3）增殖的影响。我们观察到，LXQ46以剂量和时间依赖性方式显着降低了PDAC细胞系的活力（图4b；补充图3b-e）。随后，我们使用克隆形成试验评估了LXQ46的长期效果。结果表明，LXQ46以剂量依赖的方式抑制了菌落的形成（图4c，d）。同样，PANC-1和MIA-PaCa-2细胞的生长抑制也归因于LXQ46处理（图4e，f）诱导的明显的G0 / G1期细胞周期停滞，而不是凋亡（补充图2b）。）。蛋白质印迹分析进一步证实，LXQ46通过降低CDK2，CDK4，CDK6和Cyclin D1的表达诱导细胞周期停滞（图4g）。此外，与未处理的细胞相比，LXQ46处理对PDAC细胞的迁移产生了显着的抑制作用（图4h，i），这与PTP1B敲低对细胞迁移的影响是一致的。总而言之，我们确定了PTP1B（胰腺癌细胞增殖和迁移的积极调节剂）作为PDAC的有希望的治疗靶标。
LXQ46 的化学结构。b细胞毒性试验显示LXQ46抑制了PANC-1和MIA-PaCa-2细胞增殖，IC 50分别为4.169μM和4.614μM。c，d通过菌落形成测定法，测量了指示浓度的LXQ46（0、5、10、15μM）处理的PANC-1和MIA-PaCa-2细胞48小时的生长。代表性图像显示在（c）中。定量分析显示在（d）中。e，f LXQ46处理后胰腺癌细胞的细胞周期分析。（克LXQ46处理48 h后，PANC-1和MIA-PaCa-2细胞中CDK2，CDK4，CDK6，Cyclin D1的蛋白质印迹分析。h，i如通过跨孔迁移测定所评估的，LXQ46对PDAC细胞系迁移的影响。代表性图像以（h）表示（比例尺，100μm）。定量分析显示在（i）中。来自三个独立实验的这些数据的定量显示为平均值±SEM。 与对照相比，* p <0.05和** p <0.01。
基于上述体外发现，我们建立了异种移植小鼠模型，以进一步检查PTP1B对体内肿瘤生长的影响。为此，我们将被LV3-shPTP1B-1或LV3-shCon感染的PANC-1细胞皮下接种到裸鼠中以形成肿瘤。肿瘤形成后一周，我们用薄板卡尺监测了移植肿瘤的生长，并观察到PTP1B敲除的肿瘤生长几乎停滞并且比对照肿瘤的生长慢得多，这表明PTP1B的丧失极大地抑制了肿瘤的生长（图5a）。与肿瘤体积一致，源自shPTP1B-1细胞的肿瘤的平均重量显着低于相应的对照肿瘤的重量（图5b，c）。而且，如图5d所示，用LV3-shPTP1B-1治疗的肿瘤在Ki67表达上明显降低，这表明shPTP1B-1组的肿瘤增殖减少。然后，通过蛋白质印迹法和IHC检测这些肿瘤组织中PTP1B的表达，以确定其在肿瘤发生后仍然表达不足（图5e）。
a – e体内PTP1B的丢失抑制了PANC-1细胞的肿瘤发生。a肿瘤体积的变化。b，cPTP1B丢失组与对照组之间的肿瘤大小和重量的比较。d H＆E染色和Ki67在肿瘤中的表达（比例尺，200μm和50μm）。e通过蛋白质印迹和免疫组织化学分析（比例尺，200μm和50μm）检测到PTP1B在肿瘤组织中的表达。f–i LXQ46在小鼠异种移植模型中显示出对胰腺癌的良好治疗效果。将BALB / c裸鼠分为三组，单独用赋形剂或与LXQ46（50 mg / kg或100 mg / kg）一起腹膜内治疗。F在杀死小鼠之前，每三天测量一次肿瘤体积，持续18天。g，h肿瘤大小图像和肿瘤重量定量分析。（i）肿瘤的H＆E染色和肿瘤中PTP1B和Ki67的免疫组织化学染色（比例尺，200μm和50μm）。* p <0.05，** p <0.01与对照组。
同样，PTP1B的药理抑制作用也导致体内肿瘤生长的抑制，如图5f–i所示。对照组中的肿瘤生长迅速，而LXQ46处理（50 mg / kg和100 mg / kg）显着阻断了肿瘤的生长（图5f，g）。LXQ46治疗组的肿瘤重量也低于对照组（图5h）。此外，我们揭示了通过抑制PTP1B表达不能通过LXQ46抑制肿瘤组织中的细胞增殖（图5i）。总之，所有这些数据表明，PTP1B是体内肿瘤生长所必需的，这与体外观察相伴。
为了阐明PTP1B调控PDAC细胞增殖和生长的分子机制，我们首先关注建立的PTP1B靶向分子途径，该途径可能有助于肿瘤发展，例如Src / ERK和PI3K / Akt途径9。有趣的是，结果表明在PTP1B敲低的PDAC细胞中这两个信号通路均未受到显着抑制（补充图4），这表明PTP1B抑制对PDAC细胞生长的抑制作用与另一种分子途径相关。鉴于AMPK激活在细胞周期控制和增殖抑制中起着至关重要的作用，以及我们的发现p-AMPK在胰腺癌中被下调（补充图5）。），接下来我们研究PTP1B与AMPK之间的关系。在过表达的PTP1B中评估AMPK的磷酸化。如图6a所示，当PTP1B过表达时，AMPK的磷酸化降低，表明PTP1B负调节AMPK的活化。另外，在胰腺癌组织中证实了PTP1B和p-AMPK之间的负相关性（图6b，c）。然后，我们证明了PTP1B的底物PKM2介导了PTP1B和AMPK之间的相互作用。如图6d所示，在PTP1B缺乏的PDAC细胞中，PKM2的Tyr-105磷酸化抑制了其活性。一致地，PTP1B抑制剂以剂量依赖性方式显着增加了PKM2 Tyr-105的磷酸化并降低了PKM2的活性（图6d）。随后，通过PTP1B敲低或LXQ46处理对PKM2的抑制激活了胰腺癌细胞中的AMPK（图6e，f）。另外，PRAS40的磷酸化水平也降低，伴随着PKM2活性降低（图6e，f）。然后，我们检测了p-p70S6K的水平，这是mTOC1的主要下游目标，因为PRAS40的去磷酸化和AMPK激活都可以间接抑制mTOC1的活性，从而对蛋白质的合成产生负调控17，18，19。结果表明，响应于由PTP1B抑制引起的p-AMPK的增加和p-PRAS40的减少，p70S6K的磷酸化受到强烈抑制（图 6e，f）。在异种移植肿瘤组织中获得了相同的结果（图 6g）。综上所述，这些数据表明，PTP1B抑制导致PKM2的Tyr105过度磷酸化，并削弱PKM2的活性，从而导致AMPK的磷酸化增加而PRAS40的磷酸化减少。这些变化之后是mTOC1抑制和减少的p70S6K磷酸化。所有这些结果最终导致蛋白质合成抑制和增殖停滞（图 7）。
一个 PTP1B过表达导致降低的对AMPK（阿尔法）。b，c在胰腺癌患者组织样本中显示PTP1B与p-AMPKα呈负相关（p <0.001，p值通过Pearsonχ2检验获得；比例尺为200μm和50μm）。d shRNA或LXQ46对PTP1B的抑制作用会增加PKM2的磷酸化。e，f失活的PKM2导致AMPKα的磷酸化增加，而PRAS40的磷酸化降低，从而导致mTOC1活性受到抑制。g PTP1B抑制导致体内AMPK激活并降低p-p70S6K（比例尺，200和50μm）。
拟议的机制由PTP1B抑制引起的胰腺癌细胞增殖停滞。
PTP1B是PTP家族的成员，它是众多信号级联6的完善的调节器。除了胰岛素和瘦素介导的信号外，越来越多的报道表明，PTP1B在肿瘤发生中起双重作用，具体取决于癌症类型9。相比之下，人们对PTP1B在胰腺癌中的作用知之甚少。在本研究中，我们首次证明了PTP1B的敲低或药理学抑制作用在体外和体内均可降低胰腺癌的进展。一方面，PTP1B在胰腺癌标本中显着过表达，与远处转移和肿瘤分期有关，并表明生存期较差（图1和表1）。），这表明PTP1B可能在促进PDAC的发展中发挥了作用。在另一方面，PTP1B敲低导致肿瘤细胞，其与在异种移植小鼠模型中的肿瘤生长抑制到一起（图迁移的增殖停滞和抑制2，5），表明PTP1B起着胰腺癌的致癌作用。PTP1B过表达的结果也与PTP1B的促癌活性一致（图3）。此外，当PTP1B被一种特异性抑制剂抑制时，胰腺癌细胞的增殖和肿瘤的生长会大大降低，这支持了PTP1B作为PDAC的有希望的治疗靶点的观念（图4和5）。）。这些结果与其在其他癌症（例如乳腺癌，结肠癌和非小细胞肺癌）中的作用一致。因此，考虑到PTP1B在胰腺癌发展中的重要作用，需要阐明其调控胰腺癌细胞增殖的机制。从历史上看，PTP1B一直认为通过与若干致癌基材如p62DOK，SRC，PITX1和IRβ相互作用以促进肿瘤发生，生长，存活和转移，在各种人类癌症中20，21，22，23，24。在这些底物中，Src，PITX1和p62DOK均通过调节ERK来控制细胞增殖。IRβ激活PI3K / Akt信号传导途径，从而促进增殖。但是，在我们的研究中，我们无法证明PTP1B的缺失导致ERK和Akt激活减弱（补充图4）。因此，这个有趣的结果使我们假设可能存在与PTP1B间接相关并参与胰腺癌发展的增殖调节剂。
新兴证据表明，PTP1B调节参与能量平衡的关键调制器。然后，我们发现AMPK是能量稳态的关键调节剂，它被PTP1B负调节（图6a）。尽管有证据表明，AMPK可能会帮助癌细胞在某些情况下存活25，有文献更多的支持，以便AMPK通过导致细胞生长抑制和细胞周期阻滞作为一种肿瘤抑制基因的概念26，27，28，29。特别是，AMPK的活化已被证明是抑制胰腺癌细胞生长的有效策略30，31，32。如图6b，c所示，免疫组织化学分析显示PTP1B与人胰腺癌组织中AMPK的磷酸化水平呈负相关，这与在PDAC细胞系（图6e，f）和异种移植物中观察到的现象一致。肿瘤（图6g）。此外，在图1至图4中，图4示出了图1的结构。在图2e和图4e中，PTP1B的敲低和药理学抑制均诱导了PDAC细胞系中的G0 / G1期细胞周期停滞，这是AMPK激活的明显表现。先前的研究表明，PTP1B的丢失可通过激活AMPK 33来抵抗代谢性疾病，例如心肌异常，动脉粥样硬化斑块形成和糖尿病，34，35，这进一步证实PTP1B和AMPK之间的相关性和相互作用。随后，我们发现AMPK激活似乎在体外（图 6e，f）和体内（图 6g）通过抑制p70S6K发挥其抗肿瘤作用。这是因为AMPK激活通过使TSC2 36磷酸化或直接破坏mTORC1和Raptor 37之间的组合来抑制mTORC1信号传导。因此，p70S6K的-介导的mTORC1信号阻止的抑制嘌呤和嘧啶的合成，并因此控制细胞增殖 18，38。
但是，值得注意的是，AMPK的激活取决于Thr-172处AMPKα的磷酸化。因此，AMPK不是PTP1B的直接下游底物。接下来，我们发现PKM2介导了PTP1B-AMPK相互作用。由于PTP1B缺乏和药理学抑制作用导致PKM2总酪氨酸增加，而Tyr105磷酸化抑制了PKM2丙酮酸激酶的体外和体内活性39，PKM2被确定为PTP1B的底物。此外，研究报告称，PKM2的稳定敲低可以响应ATP稳态40激活AMPK 。如图6d所示当抑制PTP1B时，确实抑制了PKM2的活性，然后激活AMPK。同时，当PKM2失活时，PRAS40的磷酸化显着降低，这加剧了对mTOC1的抑制（图6e，f）。这是因为PKM2对PRAS40的磷酸化作用从mTOC1释放PRAS40，从而导致mTOC1信号激活致癌生长41。因此，我们得出结论，PTP1B通过同时通过PKM2调节AMPK和PRAS40来控制胰腺癌的进展。
综上所述，在本研究中，我们的结果首次证明了PTP1B在PDAC中的关键作用。PTP1B充当致癌基因，其抑制作用通过抑制PKM2激活AMPK并降低PRAS40磷酸化水平，从而导致mTOC1受到抑制。抑制mTOC1从而抑制p70S6K会导致胰腺癌细胞的增殖停滞。这些结果强烈暗示了PTP1B作为PDAC中的治疗靶标的潜力以及PTP1B抑制剂在胰腺癌治疗中的研究价值。
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