摘要
最近，以ATP竞争性抑制剂靶向ERK已成为克服BRAF和MEK抑制剂联合治疗获得性耐药的潜在临床策略。在这项研究中，我们调查了针对ERK D招聘网站（DRS）的替代策略。DRS是一个保守区域，位于活动位点的远端，并介导ERK-蛋白质相互作用。我们证明小分子BI-78D3绑定到ERK2的DRS，并与口袋内的半胱氨酸保守残基（C159）形成共价加合物，并破坏体内信号传导。BI-78D3不共价修饰p38MAPK，JNK或ERK5。BI-78D3促进含有BRAF V600E突变的未使用BRAF抑制剂的黑色素瘤和耐药黑色素瘤细胞的凋亡。
MAPK ERK是细胞增殖和存活的关键调节剂，并通过由小G蛋白（RAS）和涉及三种蛋白激酶（RAF，MEK和ERK）的顺序级联组成的核心途径激活（补充图 1a）。1，2。ERK1和ERK2（在本文中称为ERK）使包括RSKs在内的大量胞质蛋白磷酸化，这些蛋白与激活的ERK一起位于细胞核内，以促进新的转录事件。动力学认为是ERK信号传导途径的重要成分，用证据表明，亚细胞定位和ERK活性的持续时间两者来确定细胞命运的决定，如增殖3，4，5。超过50％的黑色素瘤是皮肤癌的一种常见且致命的形式，其包含BRAF激酶（BRAF V600E）的组成型活性突变体，该突变体引起不适当的ERK信号传导，这是人类黑色素瘤的主要驱动因素6。
内的初始发现的十年中，小分子的发展BRAF激酶（例如，威罗菲尼和dabrafenib）和它们的临床验证的抑制剂发生，显示出在患者显著短期响应BRAF -mutant黑素瘤7，8，9。临床样品揭示了抗性的几种机制威罗菲尼10，11，其中大多数导致ERK的活化信号12，13，14，15，16，17。共处理与MEK抑制剂提供ERK信号传导的更耐用的抑制与在临床前模型增强的抗肿瘤效果和，直至免疫疗法的出现18，是护理的治疗BRAF突变的黑素瘤的标准19，20，21。但是，即使与MEK抑制剂联合使用，RAF抑制剂的作用也仅限于表达突变型BRAF的肿瘤，并受到耐药性ERK激活10的出现的限制。
最近的证据支持了ERK的抑制剂，例如，ATP竞争性抑制剂ulixertinib，可以表现出可接受的安全简档的可能性22，并且能够抑制耐药性的出现和克服BRAF和MEK抑制剂的获得性抗性22，23。在一系列研究中，多个临床耐药机制被建议收敛于ERK活化在BRAF V600E结肠直肠癌24，25，26。但是，几乎可以肯定对ATP竞争性ERK抑制剂的耐药性。例如，细胞长期暴露于ERK的ATP竞争性抑制剂中，SCH772984 23导致获得性抗性，对应于ERK1 26的DFG基序中的突变G186D，体外分析显示其他潜在的抗性突变，主要位于ATP结合位点27内。因此，直接抑制ERK的互补策略可以克服对ATP竞争性ERK抑制剂的抗性机制，可能会提供重大的治疗机会。
为了与MAPK信号传导途径的组分形成高度特异性的信号复合物，ERK利用了两个招聘位点，即D招聘位点（DRS）和F招聘位点（FRS），它们在空间上与催化机制不同（补充图）。 。 图1b）28，29，30，31。第一这些“对接”区域，所述DRS，位于ATP结合口袋的后面，并确认包含序列伙伴，如d-位点共有（R / K）2-3 - （X）2-6 - Φ Α - X - Φ Β（其中Φ Α/Β是疏水残基）。第二个停靠区，FRS 30，位于活化环的正下方，并结合底物，例如带有序列（FXFP）32的底物。
作为DRS是众多ERK -蛋白相互作用的关键介体33，我们推断蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）抑制剂靶向DRS可能会表现出独特的药理学活性，用电阻轮廓正交的那些ATP-竞争性抑制剂。
在这里，我们报告了一种使用1,2,4-三唑-3-酮底物BI-78D3（图1a）针对体内ERK DRS的新方法 ，该方法可破坏ERK-蛋白复合物的形成，从而影响BRAF-突变的肿瘤生长。
BI-78D3标记ERK2的C159 。BI-78D3 的化学结构。b BI-78D3通过组成型活性MKK1（MKK1G7B）抑制ERK1 / 2磷酸化，并通过激活的ERK1 / 2抑制Ets-1的磷酸化。在分别添加[γ- 32 P] ATP和MKK1G7B或Ets-1 之前，将不同浓度的BI-78D3与未磷酸化或活化的ERK1 / 2孵育30分钟（数据来自Ets-1测定的三个独立实验和两个用于MKK1G7B分析，柱线表示平均值±SD（标准偏差）。c上图显示了在15N，1中对应于C159的区域的扩展在不断增加的BI-78D3含量下，无活性ERK2（200μM）的H TROSY（600 MHz）光谱。底部面板显示了这些光谱中C159共振的相对强度随BI-78D3浓度的增加而变化。d从15 N，1 H TROSY（800 MHz）或13 C，1计算得出的显着光谱扰动的残基在ERK2的结构上显示了在存在约等摩尔量的BI-78D3的骨架酰胺（左图）或Ile（δ1），Val和Leu甲基（右图）共振的情况下，ERK2的H HMQC（800 MHz）光谱。酰胺或甲基化学位移扰动超过相应平均值加上标准偏差的两倍的残基分别为深绿色和青色。酰胺共振扩大到噪音以下的残基被染成浅绿色。C159以黄色显示（并标记为蓝色），激活环T183和Y185以红色显示。在这两种情况下，所有频谱扰动都位于ERK2的DRS内和周围。Ë荧光各向异性用于评估BI-78D3从活化的ERK2和ERK2 C159S的DRS中竞争性置换含荧光D位点的肽的能力（代表两次重复中的一项实验）。f BI-78D3对C159和C164的特异性。将ERK蛋白（5 µM）与100 µM BI-78D3孵育60分钟。使用Ellman试剂滴定游离硫醇（数据来自三个独立的实验，竖线表示平均值±SD）
Shapiro和同事发现几个小分子ERK的表现出剂量依赖性抑制信令34和在几个细胞系细胞增殖的抑制，包括黑色素瘤细胞系35，36。提出的抑制机制涉及抑制剂与ERK的D招聘位点（DRS）可逆结合，从而破坏底物（如p90RSK）的结合。这些研究提供了第一个概念证明，即ERK的D招聘位点是癌细胞系中潜在可行的治疗靶标。然而，迄今为止，还没有出现以足够高的效力结合该位点以在体内高度有效的分子。几年前，1,2,4-三唑-3-酮BI-78D3被确定为支架蛋白c-Jun N端激酶抑制蛋白1（JIP1）与c-Jun之间相互作用的弱抑制剂。 Jun N末端激酶1，JNK1 37。我们发现BI-78D3阻碍了ERK激酶MKK1（MKK1G7B）的组成性活性形式的能力38在体外磷酸化ERK1和ERK2，也阻碍了活化的ERK1和ERK2磷酸化v-ets成红细胞病病毒E26癌基因同源物1（Ets-1；一种包含残基1-138的构建体，对ERK介导是必要和充分的磷酸化，被使用39）（图 1b）。在两种情况下，BI-78D3抑制以剂量依赖性方式磷酸化反应（IC 50 〜1.0μM; 30分钟温育）。
有效抑制的合理解释是BI-78D3阻碍了MKK1G7B•ERK和ERK•Ets-1蛋白复合物的形成。为了进一步测试这种可能性，我们利用溶液NMR方法服用对于ERK2的主链和甲基共振可用分配优点40，41。基于2D 15 N，1 H TROSY的BI-78D3滴定至15 N，2 H标记的ERK2 的滴定显示了位于DRS处及其附近的明显光谱扰动。具有两组共振的慢交换行为（请参见下文），一组共振对应于游离ERK2，另一组共振与BI-78D3结合态（补充图 2）给出了两个例子，即T108和H123），因为大多数被干扰的残基都是明显的。相反，注意到C159酰胺峰逐渐衰减，直到在BI-78D3 的等摩尔（1/1）比处完全消失（图 1c）。用10 mM DTT处理可恢复C159共振（补充图 3），并消除了与其他残基对应于BI-78D3结合状态的共振。逆转扰动的能力，最明显的是通过使用还原剂还原“未结合的” C159，表明该残基被BI-78D3共价修饰（如下文进一步描述）。ERK2共振表现出明显的扰动（>2.5σ阈值；补充图 4a，c（上图）； 在图1d中，左图）对应于位于包含环11（N156），空间相邻的叶间连接子（T108，D109）和αE螺旋（D122，H123，I124）的区域中的残基。此外，利用13 C，1 H HMQC实验分析了BI-78D3对15 N，2 H-ILV标记的ERK2 的Ile（仅δ1），Leu和Val残基的甲基共振引起的扰动，发现了类似的结果总体趋势。与酰胺的情况一样，包括了明显的扰动（阈值>2.5σ）（补充图 4b，c（下图），图1d）。 ，右图）是L113（αD）和L119（环11）的δ1甲基，L155（β7）的甲基和L161（β8）的δ2甲基。综合来看，这些数据表明BI-78D3在ERK2 DRS上的特定定位。用完全缺失硝基或被甲基酯（Con-1）取代的修饰的BI-78D3配体滴定ERK2，即那些不能与C159共价键的配体，显示出化学位移扰动只有在很高的情况下才能观察到配体的浓度。这表明BI-78D3在ERK2 DRS的定位主要是由C159的共价修饰驱动的。
尽管看到的大多数ERK2共振扰动都对应于BI-78D3存在时共振频率的变化，但对应于C159的峰（图 1c）被定量衰减，大约在配体的等摩尔比时完全消失。我们认为C159共振急剧丧失的可能是因为BI-78D3与C159发生了独特的相互作用。为了测试这种情况，我们将ERK2的C159突变为Ser。与野生型ERK2相比，当针对已知需要在DRS内对接以进行周转的肽底物进行分析时，BI-78D3不会抑制ERK C159S突变体42（补充图 5））。此外，BI-78D3有效地取代了FITC标记的含有共有序列（D位点）的肽，已知该序列靶向ERK2的DRS。但是，在相同的实验条件下，BI-78D3无法从ERK2 C159S的DRS上取代该肽（图 1e）。 在此荧光各向异性竞争测定中，BI-78D3与活化的ERK2结合的表观（K i ±标准误差）估计为0.8±0.2 µM（图 1e）。）。接下来，正如上面的NMR结果所表明的，我们进一步测试了C159与BI-78D3形成共价键的可能性，并评估了ERK2与BI-78D3的预温育是否保护了C159不与5,5'-二硫代-双-（ 2-硝基苯甲酸）（Ellman试剂）。作为对照，我们还评估了位于ERK2活性位点内的C164。我们制备了四种形式的ERK2，其中既不包含半胱氨酸（其中所有七个都突变为Ser或Ala），两个半胱氨酸（C159和C164）或一个半胱氨酸（C159或C164）。当Ellman试剂对C164和C159进行定量滴定时，将蛋白质与100 µM BI-78D3预孵育60分钟，然后进行缓冲液交换，可以完全保护C159，但不能保护C164不与Ellman试剂反应（图 1f）。），进一步表明BI-78D3确实与C159形成了共价加合物。
接下来，我们开始确定ERK2与BI-78D3之间形成的加合物的结构，方法是先将其共价修饰与模型反应进行比较。与BI-78D3的UV光谱BI-78D3诱导红移和增色移位，其特征在于通过一个等吸收点几个脂族硫醇的温育是围绕λ 〜340纳米，与涉及两个光谱活性物种的转化率（图的处理是一致的。 图2a和补充图 6a，b）。值得注意的是，将BI-78D3与ERK2孵育会引起相同的时间依赖性光谱变化（图 2b）。），这与ERK2与BI-78D3发生与模型硫醇相似的化学反应的观点一致。为了鉴定乙硫醇和BI-78D3之间的反应产物，将一当量乙硫醇与BI-78D3孵育1小时，然后将反应的单个产物通过HPLC分析纯化（保留时间约60分钟）（补充图 7a））。纯化产物的解卷积高分辨率质谱显示质量为442 Da（补充图 7b），表明BI-78D3与乙硫醇形成1：1加合物。将重组His-ERK2（MW 42,318 Da）与BI-78D3一起温育20分钟，导致出现了42704 Da的新分子量物种，这对应于BI-78D3的单个分子的掺入（观察到386 Da，预期为380 Da）（图 2c），支持BI-78D3与ERK2形成相似的共价加合物的观点。LC159的研究进一步支持C159的共价修饰，该研究揭示了BI-78D3不会掺入ERK2 C159S突变体中（补充图 8）。
BI-78D3与游离硫醇的反应可提供稳定的四面体中间体。一个，b在为的反应的紫外可见光谱中观察到的变化一个 2- methoxyethanethiol（100μM）或bERK2（50μM），在50 mM磷酸盐缓冲液BI-78D3（10μM），pH 7.5和2％的二恶烷（光谱每10秒记录一次，持续1000秒）。c ERK2的反卷积质谱图显示，在将ERK2（5 µM）与BI-78D3（100 µM）孵育15–20分钟后，使用PD-10色谱柱进行缓冲液交换（计算分子量为255，约386 Da）。 BI-78D3和ERK2分别为380和42,329 Da）。d BI-78D3与ERK1 / 2之间反应的拟议机理
为了进一步了解加合物的形成机理，将甲氧基乙硫醇与等摩尔量的BI-78D3在磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中孵育约30分钟，并确定反应产物的1 H NMR光谱（详细信息可以在补充图9的图例中找到 ）。BI-78D3的质子NMR光谱的特征是在8.32 ppm处有一个唯一的低场单重态，它对应于噻唑环的C4质子。明显地，在BI-78D3与甲氧基乙硫醇之间的反应产物中，该质子在8.44ppm处可见（补充图 9a），这表明如预期的那样，噻唑环不是BI-78D3中硫醇加成的位点。相反，1 H NMR数据和产物的13 C NMR光谱（补充图 9b）表明1,2,4-三唑-3-酮的C5碳是加成位点。类似四面体加合物在文献中已知的43，44，45，46，47，48。值得注意的是，ERK2与BI-78D3之间的反应纯化产物还在8.32 ppm处保留了一个峰（补充图 10a），从而积极支持ERK2形成类似于T 0的产物的观点（图 2d）。）。值得注意的是，即使BI-78D3共价连接到ERK2（通过C5），BI-78D3的S部分也提供了很大的灵活性。预期该部分将是表面暴露的，从而允许自由旋转，并导致质子峰比通常附着于大分子的基团所期望的峰更尖。仔细检查这种共振（在补充图9中用“ *”标记 ，大约在8.32 ppm处发生），与在单独使用BI-78D3（1）（半峰全宽分别为〜2.0 和1.22 Hz）（补充图 10b）。当BI-78D3与一当量的甲氧基乙硫醇反应时，对于相同的质子观察到类似的变化（补充图 9a）。有趣的是，T 0的进一步孵育导致物种缓慢出现，对应于127 Da的损失（补充图 11），这很可能对应于加合物的水解产生T 1和5-硝基噻唑-2（ 3H）-一（图 2d）。因此，我们建议BI-78D3根据图2d所示的机制与ERK2反应 。
如上所述，尽管ERK具有七个半胱氨酸残基，但即使经过长时间孵育，BI-78D3也只能与C159反应。为了深入了解反应的动力学机理，我们使用体外动力学测定法测量了其形成速率对BI-78D3浓度的依赖性。将ERK2与不同浓度的BI-78D3孵育不同的时间，然后在设定的时间将等分试样稀释100倍，以确定其残留活性。图 3a显示了观察到的ERK2失活速率常数与BI-78D3浓度的关系图。通过数据的线对应于最适合方程式的线。（1）对于不可逆抑制的两步机制（图 3a），K i ＝ 2.3±0.8×10 -6 M，k inact ＝ 1.7±0.12×10 -3 s -1。因此，相当于BI-78D3与ERK2的反应的二级速率常数的k inact / K i为7.4±2.6×10 2 M -1 s -1（图 3a）。此以18 M个第二阶速率常数相比，毫不逊色-1 小号-1和7.8米-1 小号-1为羟基乙（对ķ α= 9.5）和乙硫醇（对ķa = 10.6）。因此，加合物形成的特异性似乎是由于ERK和BI-78D3之间可逆配合物的形成而引起的，该配合物促进了C159硫醇盐阴离子对1,2,4-三唑-3-环的C5的亲核攻击。
BI-78D3对ERK1 / 2具有独特的选择性。BI-78D3使ERK2失活的动力学行为。数据符合方程式。（1）如方法部分所述，并按照方案1中所示的两步激活机理（数据代表两次重复实验中的一个；两个实验均产生一致的动力学参数，K i和k的值均不存在 ±标准误差） 。b BI-78D3与ERK2（PDB 4ERK）结合的100 ns分子动力学轨迹的最后一帧。使用嵌合体UCSF软件（产生图https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）70。C涵盖D招聘位点的人类MAPK的序列比对。黑色矩形表示ERK2中C159对应的半胱氨酸（以BI-78D3为目标）。该编号对应于人ERK1序列。智人 ERK1中的C178 对应智人 ERK2中的C161 和褐家鼠ERK2中的C159。d BI-78D3抑制JNK1的可逆性，但不抑制ERK2。将每种酶（5 µM）用BI-78D3（100 µM）或DMSO（对照）处理1小时。在过度透析之前和之后评估每种酶的活性（数据来自三个独立的实验，竖线表示平均值±SD）
为了深入了解该机理，我们使用“方法”部分详细描述的计算方法将BI-78D3建模到ERK2（PDB：4ERK）表面。我们的模型支持BI-78D3与C159结合并与观察到的加合物形成后ERK2的主链化学位移变化一致的想法（图 3b）。但是，尽管与环11的相互作用（基于上述NMR扰动）对于确定BI-78D3的取向是必要的，但仍需要进一步研究以评估模型。补充说明1和补充表 1所示的突变分析 支持以下观点：在与C159反应之前，BI-78D3会靠近环11（N156）和空间相邻的叶间链接器（T108）进行绑定。
几个MAPK的结构研究和序列比对（图 3c）显示DRS是高度保守的，并且除ERK3和ERK4以外，所有MAPK中都存在与C159相对应的半胱氨酸。鉴于这种相似性，我们通过监测其吸收光谱（UV /可见光）的变化来探索BI-78D3与其他MAPK反应的可能性。如补充说明 2所述，在测试的几种蛋白质中，只有ERK2在吸收光谱中显示出特征性变化，与硫醇的添加一致。相反，每种蛋白质与DNTB的孵育揭示了一个或多个表面可及的半胱氨酸（补充图 12和补充表 2）。）。另外，我们无法使用LC-MS检测到BI-78D3对His-JNK2，p38-αMAPK或ERK5的标记（补充图 13）。最后，尽管BI-78D3在体外测定中确实抑制了JNKs（补充图 14），但是我们将其与BI-78D3（10 µM）孵育60分钟后，通过透析能够完全恢复JNK1的酶活性。 （图 3d）。
接下来，我们评估了BI-78D3共价修饰完整细胞中ERK的C159的能力。将稳定过量表达Flag-ERK2的HEK293细胞与BI-78D3（25 µM）孵育2小时。然后裂解细胞，并通过免疫沉淀纯化Flag-ERK2，快速冷冻至-80°C，直至通过LC-MS分析。从HEK293细胞纯化的瞬时转染的Flag-ERK2的去卷积质谱图显示了对应于Flag-ERK2的三个峰（图 4a），最有可能是未磷酸化，单磷酸化和双磷酸化的Flag-ERK2。用BI-78D3处理细胞会产生三个新峰（具有不同的相对比率），每个峰均显示〜380 Da的质量偏移，这与BI-78D3对ERK2的共价修饰相一致（图 4a）。）。为了评估BI-78D3的药效特性，将HEK 293细胞与10或50 µM BI-78D3孵育2小时，然后在指定的时间交换培养基并添加EGF（30分钟）（图 4b）。）。通过Western印迹判断，EGF处理可导致ERK强烈磷酸化。在洗出BI-78D3后长达8小时，用50 µM BI-78D3进行的单次处理抑制了EGF激活ERK途径的能力。这表明BI-78D3有潜力在细胞中修饰ERK至少8小时以抑制其活化。与这些观察结果一致，孵育了ERK2·BI-78D3加合物（紫外光谱显示在补充图 15a中。）用5 mM谷胱甘肽处理30分钟无法挽救ERK2的活性，这是使用体外激酶测定法确定的（补充图 15c）。另外，在室温下在pH 7.5的缓冲液中将另一种纯化的加合物（由带有单个半胱氨酸（C159）的ERK2与BI-78D3反应形成）孵育16小时（补充图 15b）无法诱导与埃尔曼试剂的反应性，表明C159仍受保护。
BI-78D3在细胞中标记ERK2。一个 BI-78D3标签旗ERK2以共价键HEK-293细胞。b通过将HEK细胞与BI-78D3孵育2小时，然后冲洗，从而持续抑制EGF刺激的ERK磷酸化。使用泛肌动蛋白作为对照，一式两份进行免疫印迹。图像已被裁剪以进行呈现，未裁剪的图像显示在补充图 25中。c BI-78D3在BRAF-中抑制EGF刺激的ERK激活，但不抑制JNK激活。突变的A375黑色素瘤细胞。将150万个细胞接种在60毫米的培养皿中，血清饥饿过夜，在无血清培养基中用BI-78D3处理1小时，然后在相同培养基中冲洗抑制剂2小时。然后在完全培养基中用EGF刺激细胞30分钟。该实验进行了三次。在每个实验中，将泛肌动蛋白用作对照。图像已被裁剪以进行呈现，未裁剪的图像显示在补充图 25中。补充图25b中显示了另外两个副本 。d用BI-78D3在完全培养基中处理A375细胞1小时，然后冲洗，以剂量依赖性方式抑制它们汇合的方法（IncuCyte成像。误差线：SEM（n = 3），代表至少3次重复的一项实验。Ë BI-78D3抑制A375细胞以剂量依赖性方式的贴壁依赖型和贴壁依赖性生长（实验以一式三份进行的）。比例尺代表600 µm。f，gBI-78D3通过膜联蛋白V或Caspase-3 / 7分析（IncuCyte成像。误差线：SEM（n = 3））确定，以剂量依赖性方式诱导A375细胞凋亡。
A375人黑素瘤细胞系表达突变型V600E BRAF，并且对ERK抑制敏感49。为了严格评估BI-78D3共价抑制这些细胞中ERK信号的能力，我们采用以下方案：将A375细胞血清饥饿过夜，然后与BI-78D3孵育1 h，然后洗净2 h，然后用EGF刺激（30分钟）。使用该协议，我们发现BI-78D3在激活环（ERK2中的T183 / Y185）内表现出剂量依赖性的ERK磷酸化抑制。此外，还抑制了位于N端和C端激酶结构域之间的接头上的S359 / S363下游底物p90RSK的磷酸化，以及位于C端激酶结构域的激活环上的T573的磷酸化。激活环内MKK1的磷酸化略有增加，这与ERK介导的反馈抑制有所缓解一致50（图 4c，三个不同实验的定量示于补充图 16a）。
有趣的是，高剂量的BI-78D3（25 µM）引发了明显的细胞圆化和ERK磷酸化，而没有进一步显着激活MKK1 / 2。然而，值得注意的是，维持了对磷酸-RSK T359 / S363的抑制作用（补充图 25和26a显示了三个不同实验的未切割的免疫印迹），表明尽管其磷酸化，ERK仍然被抑制。使用荧光肽传感器（ERK-sensor-D1）51证实了这一点，以估计细胞裂解物中ERK的活性（补充图 26b）。这表明更高剂量的BI-78D3可能导致直接或间接抑制磷酸化ERK的磷酸酶功能。
显着地，在A375细胞中JNK，c-Jun（图 4c），p38MAPK（补充图 16b）和在MEL-1617细胞15（另一种BRAF-突变黑素瘤细胞系）中出现ERK5（补充图 16c）的磷酸化出现。即使细胞接受高浓度的BI-78D3处理，也不会受到影响。因此，在黑素瘤细胞系中，BI-78D3似乎抑制ERK激活及其下游信号传导，而不会显着影响其他MAPK。
由于ERK通路调节细胞的存活和增殖1，我们通过监控BI-78D3的融合方法，测量了BI-78D3孵育后细胞的增殖潜力，并进行了药物洗脱。细胞生长的剂量依赖性抑制（IC 50 当在90h中测量〜3.5μM）指出（图 4D）。相似的治疗消除了依赖于贴壁和不依赖贴壁的菌落的形成（图 4e）。细胞周期分析表明，用BI-78D3（6 µM）处理，然后冲洗24和48 h会诱导G1阻滞（补充图 17）。Annexin V（图 4f）和caspase3 / 7测定（图 4g）在治疗后72小时显示出显着的剂量依赖性诱导的凋亡，这也由亚G1群体的显着诱导所证实（补充图 18）。当不冲洗BI-78D3时，观察到相似的结果。
补充说明3中显示的化学遗传学研究 证实Cys-159是黑色素瘤和HEK293细胞中对BI-78D3易感的部位。当在A375细胞中瞬时表达抗性形式的ERK2（ERK2 C159A）时，它将显着抑制BI-78D3抑制ERK信号传导的能力（补充图 19），ERK核定位（补充图 20）和形成不依赖锚定的区域（补充图 21a）和依赖锚定的菌落（补充图 21b）。在HEK 293细胞中观察到相似的结果（补充图 22）。
由于BI-78D3先前据报道具有令人鼓舞的微粒体和血浆稳定性（半衰期约为54分钟）37，并已显示可抑制具有天然PIK3R1 L370fs突变（10 mg kg -1）的OVK18异种移植物的肿瘤生长BI-78D3每周腹膜内给药4次，共3周）52，我们决定测试它是否在体内抑制ERK信号传导。因此，我们调查了其对从人黑素瘤细胞系A375建立的BRAF突变异种移植模型生长的影响。将近交无胸腺裸鼠的右胁腹注射1×10 6 A375细胞。当肿瘤达到150 mm 3的平均体积时，将小鼠随机分为两组，每组十只。每天用腹膜内注射媒介物（2.5％乙醇，5％Tween -80、1x PBS）治疗一组，另一组则用悬浮在媒介物中的15 mg kg -1 BI-78D3进行治疗。每天测量肿瘤体积，直到肿瘤达到最大直径1cm。分析这些小鼠的肿瘤测量结果以进行肿瘤生长比较（图 5a），其中BI-78D3（每天15mg kg -1）在治疗10天后引起有效的肿瘤生长抑制。通过发病率，致死率和体重减轻来测量，BI-78D3被小鼠耐受（补充图 23）。
BI-78D3在人BRAF突变体A375异种移植模型中抑制ERK 。一个雌性无胸腺裸鼠A375细胞皮下注射。一旦肿瘤体积达到150 mm 3， 就将小鼠随机分为两组（n = 10），并每天给予媒介物或BI-78D3（腹膜内给药15 mg kg -1），持续10天。每天通过卡尺测量肿瘤体积，并将值绘制为平均值±SEM。*** P <0.001；**** P <0.0001; 使用Bonferroni后测方法（GraphPad Prism 7软件），通过两次重复测量ANOVA分析数据。b为了确认BI-78D3的靶标参与，将每组五只小鼠的肿瘤溶解产物进行western印迹分析，并分析pp-ERK1 / 2，ERK，pp-JNK和β-肌动蛋白（上样对照）。裁剪图像以进行演示；未裁剪的图像显示在补充图 25中。c对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤切片进行免疫组织化学。显示了用pp-ERK染色的肿瘤切片的代表性图像。归一化为肿瘤面积mm 2的染色细胞的比较显示，在治疗的小鼠中pp-ERK受到显着抑制（数值绘制为平均值±SD， 每组n = 5）。d使用基于肽的生物传感器和使用Zamora-Olivares等人所述的校准回归模型进行化学计量学建模获得的每组五只小鼠的肿瘤裂解物中活性ERK的估计量。53（将值绘制为平均值±SEM， 每种裂解物的n = 4）
为了测试目标参与BI-78D3治疗的肿瘤，在第16天用媒介物或BI-78D3治疗小鼠，并在3小时后处死。来自新鲜，冷冻组织的裂解物的蛋白质印迹显示，肿瘤生长抑制伴随着肿瘤组织中ERK磷酸化的强烈抑制，而不是JNK磷酸化的抑制（图 5b）。其次，与载体对照小鼠相比，用BI-78D3治疗的小鼠的肿瘤切片的磷酸化-ERK的免疫组织化学染色证实了ERK磷酸化的抑制（图 5c）。第三，使用基于肽的生物传感器和化学计量学模型53，我们能够量化肿瘤裂解液中ERK的酶促活性，并证实了治疗小鼠中ERK活性的抑制作用（图。 5d）。
为了评估BI-78D3对ERK的共价靶向能否克服BRAF抑制剂耐药细胞的获得性耐药，我们使用了两种先前报道的表现出敏感性（451 Lu-S和MEL 1617-S）和获得性耐药（451 Lu- R和MEL 1617-R）和SB-590885，以及其他BRAF抑制剂，例如PLX4720 15。如所预期的，PLX4720 对两种抗性细胞系的细胞活力具有降低的影响（图 6a，c）。相反，BI-78D3抑制所有四个细胞系的细胞活力（图 6b，d）和锚定依赖性生长（图 6e，f）。当在451个细胞系中评估时，观察到BI-78D3诱导的凋亡，这由caspase3 / 7活性的诱导来判断（图 6g，h）。尽管在生存力测定中451 Lu细胞系显示出与BI-78D3大致相似的敏感性，但MEL1617-R细胞系比MEL1617-S细胞系对BI-78D3的抵抗力略高（图 6b，d）。然而，在菌落形成测定中几乎没有明显差异（图 6f）。有趣的是，在药物冲洗和EGF刺激后，与亲代细胞相比，抑制MEL1617-R细胞中ERK途径所需的BI-78D3大约多十倍（图 6i）），表明耐药细胞可能具有明显更强的ERK信号传导，这可能有助于观察到的耐药性。这与以前的报道一致，即MEL1617-R细胞对MEK抑制剂GSK1120212的抑制作用比对MEL1617-S细胞具有更高的抵抗力，在MEL1617-S细胞中，需要抑制ERK磷酸化，细胞活力和G0 / G1细胞周期的剂量高十倍的GSK1120212逮捕15。
BI-78D3克服了黑色素瘤细胞系对BRAF抑制的获得性抗性。a – d BI-78D3在PLX4032敏感（-S）或-耐药（-R）BRAF突变黑素瘤细胞系中同样有效。如图所示，用PLX4032或BI-78D3处理细胞并孵育72小时，然后使用MTS分析进行分析（误差线：±SD（n = 3））。e，f BI-78D3抑制PLX4032敏感和耐药的黑色素瘤细胞系的锚定依赖性生长（实验重复至少两次）。克，ħBI-78D3在451 Lu-S和451 Lu-R细胞系中诱导caspase-3 / 7活性。在指定的时间点使用IncuCyte caspase-3 / 7试剂和ZOOM分析细胞。（IncuCyte成像。误差线：SEM（n = 3））。我 Western印迹分析，以评估EGF刺激的细胞信号传导在通过BI-78D3黑素瘤细胞系的抑制。将细胞血清饥饿过夜，然后在无血清培养基中用BI-78D3处理1小时，然后在相同培养基中将抑制剂洗净2小时。然后在完全培养基中用EGF刺激细胞30分钟。已裁剪图像以进行演示；未裁剪的图像显示在补充图 27中
在此报告中，我们将BI-78D3确定为与ERK的C159共价连接的小分子，并描述了其添加机理。令人惊讶地，我们发现C159与BI-78D3的1,2,4-三唑-3-酮环的C5碳形成共价键，从而形成相对稳定的四面体加合物。我们假设添加是通过BI-78D3的质子化形成的BI-78D3的弱酸性甲ami离子部分促进的，C159的硫醇根阴离子对C5碳的亲核攻击进行的（图 2d）。p K a的计算机预测（Marvinview，ChemAxon）BI-78D3的质子化N2的N值表明该值小于零，这表明向这种甲ami离子中间体中添加C159的速率可能非常快，这一观点得到了我们先前有关亲核试剂与A-D的反应性的支持。氟甲ami离子54。
该加合物对于C159的可逆消除或4-硝基-3 H-吡咯-2-硫代硫酸根阴离子的排出都是稳定的，大概是由于1,2,4-两个氮原子的弱碱性三唑-3-环。但是，加合物T 0确实会在数小时内反应缓慢，通过LC-MS可以检测到大约127 Da的损失，这很可能与水解反应和5-硝基噻唑-2（3H）-一环的损失有关叔硫醇T 1（图 2d）。值得注意的是，在不含BI-78D3的缓冲液中孵育约13小时后，ERK仍无法磷酸化Ets-1，这表明这两种加合物均能阻断Ets-1的结合。不存在13小时后，将ERK C159- BI-78D3加合物检测的游离硫醇的可能的结果Ť 1不经受与Ellman试剂显著二硫键交换，由于其空间位阻和低酸度55。
值得注意的是，ERK2中修饰的C159在除ERK3和ERK4之外的所有MAPK中都是保守的（见图 3c）。对ERK1和ERK2中这种保守的半胱氨酸选择性的一种可能的解释是，亲核试剂对C5三角碳的攻击强加了空间约束。有机化学的中心概念是著名的布尔吉-杜尼兹角（Bürgi-Dunitzangle），它描述了亲核试剂攻击三角中心的几何形状56。由于BI-78D3中的噻唑和苯并二恶英环带来了额外的空间位阻，因此这种几何限制可能会阻止许多表面半胱氨酸与C5有效反应。Loop-11，代表DRS中最明显的发散点（图 3c），也可能有助于BI-78D3表现出的辨别力，MD模拟支持这一概念，表明BI-78D3的硝基与T158（环11中ERK1 / 2特有的残基）之间可能存在相互作用。如上所述，该硝基的除去消除了加合物的形成。
我们发现，将A375细胞与1 µM BI-78D3一起孵育1小时，然后进行缓冲液交换并用EGF刺激细胞30分钟，从而导致激活环上ERK的磷酸化受到抑制，而S359 /上的p90RSK受到抑制。 S364和T573（图 4c）57。
已显示，ERK的ATP竞争性抑制剂可在许多癌细胞系中诱导G1细胞周期停滞，并且在更高的浓度下，它们可诱导细胞凋亡23。我们发现，BI-78D3（ED的一个单次剂量50 〜6μm时，1个小时）诱导显着的G1期阻滞（48小时）并抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖潜能，如使用增殖和集落形成测定在一段测量天。此外，在72小时后，通过胱天蛋白酶3/7活性和膜联蛋白V的测定，可检测到相当一部分细胞中可测量的凋亡（图 4f，g）。值得注意的是，已经获得对BRAF抑制剂SB-590885的抗性的BRAF突变细胞系仍然对BI-78D3敏感。值得注意的是，HEK和A375细胞中ERK2 C159A的过度表达使BI-78D3对菌落形成的作用减弱，从而为ERK是BI-78D3在这些细胞中的靶标提供了支持。表达野生型BRAF和KRAS以及突变型KRAS的细胞比表达突变型BRAF的细胞对BI-78D3的抗性明显更高的观察结果进一步支持了这一点（补充图 24）。
我们显示，每天腹膜内给予BI-78D3（15 mg kg -1）可强烈抑制裸鼠中A375肿瘤的生长。重要的是，如通过蛋白质印迹所判断，在BI-78D3给药后3小时，我们在肿瘤中看到ERK的强抑制，而不是JNK磷酸化，这支持了BI-78D3对ERK选择性显示并且加合物在体内稳定的观点。观察到的体内效能与报告的ERK1和ERK2的半衰期为50 h 58，ERK加合物的相对稳定性以及体外细胞实验一致，表明细胞一次暴露于BI-78D3可以抑制ERK磷酸化至少8小时（图 4b）。
总之，在ERK1和2的D招聘位点（DRS）中半胱氨酸的共价靶向代表了一种在体内抑制其信号传导的新策略。C159（位于ERK2中）位于许多ERK结合伴侣识别的关键界面内，在体内与小分子BI-78D3的am官能团形成共价四面体加合物。该加合物对于可逆的半胱氨酸消除是相对稳定的，并且在哺乳动物细胞中表现出在几个小时内阻止ERK的激活及其下游信号传导的能力。立体约束似乎赋予了BI-78D3与ERK反应的选择性，因为没有其他测试的包含该保守半胱氨酸的MAPK在体外被BI-78D3共价修饰。我们表明，BI-78D3在含有BRAF突变的BRAF / MEK幼稚和BRAF / MEK抑制剂耐药的黑色素瘤细胞中均具有抗肿瘤活性，表明其明显的潜力克服了对BRAF和MEK抑制剂的获得性耐药。C159对ERK2的Ala突变体的瞬时过表达赋予HEK293和A375细胞对BI-78D3的抗性，进一步验证了ERK1 / 2的DRS作为细胞中BI-78D3的靶标。ERK的DRS是吸引小分子的诱人位点，因为它提供了抵消ERK抑制反馈抑制作用的可能性（通过抑制MEK对ERK的作用），而ERK是对MEK和BRAF和预期会表现出不同的电阻曲线。
本研究中使用的所有缓冲液和溶液均用ARGON（Ar）气体（AirGas）脱气至少10分钟。
甲基2-（（4-（2,3-二氢苯并[b] [1,4]二恶英-6-基）-5-氧代-4,5-二氢-1H-1,2,4- 补充方法部分和补充附图中提供了三唑-3-基）硫基）噻唑-5-羧酸盐（Con-1）（4），NMR光谱和高分辨率质谱图。 30 – 32。
BI-78D3 （1）（Chemdea，目录号CD0179或Cayman Chemical公司，目录＃21183）1 1 H NMR（用50％DMSO-d 600兆赫，磷酸盐缓冲液d 6）：δ8.32（S，1H），6.80（d，J = 8.3 Hz，1H），6.60（m，2H），4.12（m，4H）。13 C NMR（125兆赫，用磷酸盐缓冲液50％恶烷d 8，布鲁克超前III）：δ 169.48，157.97，148.56，144.28，143.96，143.73，136.34，125.4，120.58，117.64，116.25，64.41，64.34。
2- Methoxyethanethiol （2） （烯胺，目录＃EN300-35885）主成分1 1 H NMR（600兆赫，磷酸，用50％DMSO-缓冲d 6）：δ 3.4（T，2H），3.18（S，3H）， 2.54（t，2H）。
1-羟基乙（西格玛奥尔德里奇，目录号M3148）1 1 H NMR（用50％DMSO-d 600兆赫，磷酸盐缓冲液d 6）：δ 3.49（T，2H），2.47（T，2H）。
乙硫醇（Acros Organics公司，目录号117865000）1 1 H NMR（用50％DMSO-d 600兆赫，磷酸盐缓冲液d 6）：δ 2.64（Q，2H），1.33（T，3H）。
加合物3在BI-78D3和2-甲氧基乙硫醇之间形成（补充图 9）。主要成分1 1 H NMR（600兆赫，用50％的磷酸恶烷缓冲d 8）：δ 8.44（S，1H），6.85（d，Ĵ = 8.6赫兹，1H），6.73（d，Ĵ = 2.3赫兹，1H ），6.68（dd，J = 2.3、8.6 Hz，1H），4.22（无水峰分辨率），3.67（t，2H），3.45（t，2H），3.27（s，3H）。13 C NMR（125兆赫，用磷酸盐缓冲液50％恶烷d8，布鲁克超前III）：δ 175.68，159.13，156.59，147.25，143.98，143.32，143.14，127.67，121.7，117.47，117.04，69.7，64.4，64.3 ，58.1、34.4。
从细菌中纯化出具有组成型活性的MKK1，全长ERK2（褐家鼠有丝分裂原激活的蛋白激酶1，GenBank登录号NM_053842）或不同的ERK2突变体，并在适用的情况下，按照我们公开的方案59进行激活。如Callaway等人所述，全长ERK1被表达，纯化和激活。57。全长人JNK1α1（GenBank登录号NM_002750），人JNK2α2（GenBank登录号NM_002752）或N末端截短的人JNK3α2（氨基酸39–422，丙氨酸插入氨基酸39和40之间，GenBank登录号NM_138982）。表达，纯化和我们描述了别的地方启动60，61。p38MAPK如先前所述62表达，纯化和激活α。人ERK5（全长）购自SignalChem，并按照GE Healthcare规程纯化GST标签的蛋白，表达和纯化GST-ERK5激酶结构域（aa 31–391，GenBank登录号NP_002740.2）。所有激酶均在不含任何还原剂的缓冲液中制备，并储存在缓冲液S [25 mM HEPES（pH 7.5），50 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA和10–20％（v / v）甘油中]在-80°C下。
GST-ATF2（1-115），GST-c-Jun（1-221）和His-Ets-1（1-138）的表达和纯化遵循我们公开的方案63。所有这些均在不含任何还原剂的缓冲液中制备，并保存在缓冲液S中。
在含有10μgml -1 BSA，10 mM MgCl 2和不同浓度BI的激酶测定缓冲液（25 mM HEPES缓冲液-pH 7.5、50 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA和5％DMSO）中进行测定-78D3。通过添加500μM放射性标记的[γ- 32 P] Mg 2+ -ATP（100–1000 cpm pmol -1）开始每个反应。对于ERK分析，使用10 µM Ets1（1–138）或10 µM D-sub肽FQRKTLQRRNRNKKNLNLNL-XXX-TGPLSPGPF（X是6-氨基己酸）分析4 nM WT-ERK1 / 2或突变体ERK2 42。对于JNK分析，用2 µM GST-c-Jun（1-221）或10 µM GST-ATF2（1-115）蛋白底物测定25 nM活性JNK1α1，JNK2α2或JNK3α2。对于MKK1分析，以1000 nM全长无活性ERK1或ERK2作为底物分析了100 nM组成型活性MKK1，在相同的激酶分析缓冲液中进行了分析，除了每个反应都是通过添加1 mM常规ATP开始的。通过确定反应的初始速率，在不同抑制剂浓度下定量激酶活性。对于除MKK1以外的所有测定，在每个时间点（0.5、1、1.5、2、4分钟）从每个反应中取出10微升等分试样，并点在2×2 cm 2正方形的P81纤维素纸上；将纸在50 mM磷酸（H 3 PO 4中洗涤3×15分钟），然后在PerkinElmer Tri-Carb液体闪烁计数器中定量与每张纸相关的cpm。对于MKK1分析，在每个时间点（0.5、1、2、4、10分钟），取出25微升等分试样，并在5×PAGE沸腾沸腾染料中淬灭10分钟。在进行蛋白质印迹之前，将淬灭的样品在10％SDS-PAGE凝胶上分级分离，以便使用Licor检测系统定量每个样品中双磷酸化ERK的量。
对于透析实验，将5 µM的每种活化酶在激酶测定缓冲液中用100 µM BI-78D3或DMSO处理1 h。反应混合物在不含DMSO的激酶测定缓冲液中透析过夜（4000倍），使用Bradford试剂（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。按照上述方案，在透析过程之后和之前评估酶对其底物的活性。
在25 mM HEPES（pH 7.5），50 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA，40 µg ml -1 BSA中进行测定，其中BSA含有40 nM FITC-Ste7肽，2 µM激活的ERK2-WT或C159S突变体，最终体积为100 µl的BI-78D3浓度。在27°C平衡后，样品在490 nm处被水平和垂直偏振光激发，并且每5 s记录一次发射，在517 nm处总共记录100 s。激发和发射的缝隙宽度以350 ms的积分时间调整为1 nm。使用GraphPad Prism 7.04 计算平均各向异性值，并将其拟合到先前报告的方程式64。
将不同浓度的BI-78D3（0、0.5、1、3、12、80和200 µM）在室温下与200 nM活性ERK2预孵育不同的时间点（0、0.5、5、15、15、30和60分钟） ）置于激酶测定缓冲液（25 mM HEPES缓冲液-pH 7.5，50 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA）中。在每个时间点，将等份试样稀释200倍至另一个装有20 µM Ets-1、500 µM [γ-32P] ATP（100–1000 cpm pmol-1）和11 mM MgCl 2（最终浓度）的试管中。确定了ERK。在每种抑制剂浓度下，将剩余活性的百分比相对于预孵育时间作图。K i和k 无效使用失活曲线的负斜率的非线性回归（残留活性的自然对数与预孵育时间）与抑制剂浓度的非线性回归，使用KaleidaGraph软件和方程式确定。（1）65。
如先前所述39，均匀表达2 H，15 N，ILV标记的失活ERK2 。所有NMR实验均在含50 mM磷酸盐，150 mM NaCl和200 µM EDTA的pH 6.8（10％D 2O）缓冲液中进行。纯化过程早期存在的DTT使用多个稀释步骤，使用了具有10 kDa截止值的离心柱进行了消除。使用先前确定的ERK2 40骨架主链分配，从在800 MHz下于116 µl包含0.4％d 6 -DMSO的样品（含和不含130 µM配体）的2D 15 N，1 H TROSY光谱中评估了化学位移扰动。66。利用同样在800 MHz下进行的 13 C， 1 H SOFAST-HMQC实验，将相同的样品用于测定甲基干扰。甲基分配是由Xiao等人转让的。41，并使用等式计算化学位移扰动。（ 2） 39。
其中，索引Ĵ识别特定残基，我标识特定核（1 H，15 N或甲基13 C），和σ IK为原子类型的标准偏差我和氨基酸型ķ从生物磁共振资料库获得（ BMRB）。
通过滴定200μM的2 H，15 N标记的ERK2 样品，并逐渐增加配体的量至终浓度为0（含2.5％d 6的游离ERK2的光谱），研究了配体对C159共振的影响-DMSO用作参考），将49、97、145、192、330 µM作为5 µl等分试样从d 6 -DMSO中的3和9 mM储备液中引入。在滴定系列结束时，通过添加DTT至最终浓度10 mM来评估仅DMSO的效果（最终浓度：〜7.7％）。DTT消除了ERK2 / BI-78D3的相互作用。在600 MHz的每个滴定点收集2D 15 N，1 H TROSY实验。
所有NMR实验都是在25°C的Bruker Avance III HD和Varian Inova仪器上收集的，这些仪器配备了能够在z轴上施加脉冲场梯度的低温探针。使用NMRPipe 67处理数据，并使用Sparky 68分析。
使用埃尔曼试剂检查BI-78D3对保护不同的ERK2巯基的作用。按照制造商的规程（Thermo Scientific-Cat编号22582），在暴露于Ellman试剂之前，将C159和/或C164上仅带有一个或两个半胱氨酸的Cysless ERK2或仅携带一个或两个半胱氨酸的Cysless ERK2孵育60分钟。将5 µM重组ERK2与100 µM BI-78D3或DMSO孵育60分钟，用PD 10脱盐柱（GE Healthcare）洗涤过量的化合物，并将蛋白质浓缩至50 µM。在100 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.中，200微升浓缩蛋白样品）将含有1 mM EDTA的0）转移到含有4μl10 mM Ellman试剂的比色杯中，并在室温下孵育15分钟后，使用Varian's Cary 50分光光度计（Agilent Technology）测量412 nm的吸光度。报告的（2-硝基-5-硫代苯甲酸）的摩尔吸光度（摩尔消光系数），Ellman试剂与任何游离巯基在412 nm反应的产物为14,150 M-1 厘米-1。
为了估计不同蛋白质中表面半胱氨酸的数量，按以下说明表达和纯化了His标记的ERK2，JNK1，JNK2，JNK3，JNK2 C163A突变体，p38-αMAPK，GST-ERK5（31-391）激酶结构域和在“方法”部分之前。通过在含有10％甘油的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中进行过度透析（1/4000稀释度的10倍）来交换存储缓冲液（p38-αMAPK和GST-ERK5在没有甘油的同一缓冲液中透析）。BSA购自Fisher生物试剂，酯酶购自Sigma Aldrich，溶菌酶购自MB Biomedicals。将这三种蛋白质重新溶解在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中，通过在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中进行过度透析（1/4000稀释液的10倍）进一步交换缓冲液。透析后，将每种蛋白质至少浓缩至60 µM。在100 µl石英比色皿中加入100 µl含50 µM每种蛋白质样品和1 mM EDTA和2 µl 10 mM Ellman试剂的微升，并在15分钟后使用Varian's Cary 50分光光度计（Agilent Technology）记录412 nm的吸光度在室温下孵育。记录的A吸光度将412 nm应用于使用不同浓度的1-半胱氨酸盐酸盐（Sigma-Aldrich）构建的校准曲线，以量化每种测试蛋白质中游离半胱氨酸的数量。
为了评估ERK·BI-78D3加合物的稳定性，将5μM仅含C159的重组半胱氨酸ERK2与DMSO（对照样品）或100μMBI-78D3在100 mM磷酸钠（pH 1为1 mM EDTA）中孵育60分钟。 。使用PD 10色谱柱（GE Healthcare）将反应混合物脱盐，并将标记的蛋白在同一缓冲液中浓缩至50 µM。将所得的加合物在室温下孵育，并在给定的时间点使用Bio-spin柱（Bio-Rad）将一部分加合物脱盐，浓缩至50 µM，然后将200 µl转移至含有4 µl 10的比色杯中mM Ellman试剂，在15分钟后记录412 nM的吸光度。
在24°C下，在50 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5和2％的Agilent 8453二极管分光光度计中，获得100 µM每种硫醇或50 µM ERK2与10 µM BI-78D3反应的UV-Vis光谱。二恶烷。通过添加BI-78D3开始反应，并在1000 s（每10 s）中获取光谱。
对于透析实验，通过在含有10％甘油，5 µM每种酶（ERK2，JNK1，JNK2）的50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中进行过度透析（1/4000稀释度的10倍）来交换每种蛋白质的存储缓冲液，JNK3，JNK2 C164A和醛缩酶A）与DMSO或100 µM BI78D3在2％pH 7.5的二恶烷/磷酸盐缓冲液，10％甘油中孵育30分钟，然后在50 mM中透析两次（过夜（每次1/4000稀释））两次。含10％甘油的磷酸盐缓冲液（pH 7.5）。在记录紫外光谱之前，将样品浓缩至50 µM。
在每个实验中，将5 µM WT-ERK2，ERK2突变体，WT-JNK1 / 2，WT-p38MAPKα或ERK5催化域蛋白在含有50 mM KCl，0.1的25 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）中以±100 µM BI-78D3孵育。 mM EDTA，0.1 mM EGTA和5％DMSO在20–120分钟内或在室温下放置过夜。然后将反应混合物脱盐，并将缓冲液更换为25 mM碳酸氢铵缓冲液。将样品快速冷冻并保存在-80°C以便以后分析，或立即注入液相色谱-质谱（LC-MS）仪器中。在Orbitrap Fusion质谱仪（Thermo-Fisher）的（LC-MS）中分析了100-200 pmol的WT-ERK2，Flag-ERK2，p38MAPKα或ERK5±BI-78D3。采集后，使用MagTran和Protein Deconvolution 4.0对数据进行反卷积。在其他一些情况下，100-200 pmol的WT-ERK2
人胚肾细胞系（HEK-293T，ATCC CRL-3216）和黑素瘤细胞系（A375，ATCC CRL-1619）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC； Manassas，VA）。451 Lu和MEL 1617黑色素瘤细胞系由美国佛罗里达州H. Lee Moffitt癌症中心和研究所的Kenneth Tsai教授提供。HEK293T细胞在添加FBS的DMEM培养基（Life Technologies）（FBS; 10％; US-Origin，热灭活，Life Technologies）中培养，而黑素瘤细胞系在RPMI-1640培养基中添加FBS（Life Technologies）培养FBS； 5％或10％； US-Origin，热灭活，Life Technologies），100 U ml -1青霉素和100μgml -1链霉素（Life Technologies），并保持在具有5％CO 2的37°C恒温箱中。将抗RAF抑制剂的细胞系保存在含有1 µM PLX4720（Selleckchem，目录号S1152）的相同培养基中。对于特异性研究，使用人胰腺导管腺癌细胞系（MIA PaCa-2，ATCC CRL-1420），人乳腺腺癌细胞系（MCF7，ATCC HTB-22）和人非小细胞肺癌细胞系（A549，ATCC） CCL-185）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC；马纳萨斯，弗吉尼亚州）。人神经胶质瘤细胞系（U87-MG，ATCC HTB-14）从美国加利福尼亚大学旧金山分校的神经外科组织银行获得。人乳腺腺癌细胞系（MDA-MB-468，ATCC HTB-132）是美国德克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学MD安德森癌症中心的Chandra Bartholomeusz博士赠予的礼物。在DMEM培养基（Life Technologies）中培养MIA PaCa-2和U87-MG细胞系，而在RPMI-1640培养基中培养人非小细胞肺癌细胞系，并在DMEM / F12中培养人乳腺癌细胞系介质。所有培养基均添加100 U ml FBS（FBS； 10％； US-Origin，热灭活，Life Technologies）-1青霉素和100μgml -1链霉素（Life Technologies），并保持在具有5％CO 2的37°C恒温箱中。从ATCC购买的细胞由ATCC使用简短的串联重复分析进行身份验证。得克萨斯大学安德森分校癌症中心研究小组提供的细胞，根据制造商的说明（Applied Biosystems，纽约州格兰德岛），使用AmpFℓSTRIdentifiler试剂盒通过STR DNA指纹验证。其余的细胞系使用人类9标记STR谱和种间污染测试（IDEXX BioResearch）进行了验证。使用MycoAlert™支原体检测试剂盒（Lonza）每月进行一次支原体检测。
对于瞬时转染，根据脂质体3000（Invitrogen，California，USA），用pcDNA3载体或含有编码WT-ERK，ERK2（C159A）或ERK2（C164A）的DNA的pcDNA3载体通过lipofectamine 3000（Invitrogen，California，USA）转染HEK293T和A375细胞系。制造商的协议。转染48小时后，按照每个实验中的说明处理细胞。对于稳定细胞系的产生，ERK2的cDNA往复输送到pLenti-C-Myc的-DDK-IRES-迪普罗（OriGene的中心，Rockville，MD，USA）质粒以下与消化后的OriGene的精密穿梭协议SGF I和MluI位I.按照生产商的说明，用慢病毒-vpak包装试剂盒（OriGene）通过慢病毒感染产生过表达ERK2的细胞。使用相同的方法制备对照细胞，但是具有空的对照质粒。用2μgml -1嘌呤霉素选择细胞以建立稳定的细胞系。
为了分析BI-78D3处理后HEK293细胞中ERK2的质量转移，将稳定表达WT Flag-ERK2的HEK293细胞血清饥饿过夜，并在无血清培养基中用DMSO或25 µM BI-78D3处理2 h。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Scientific）的裂解缓冲液（50 mM Tris HCl，pH 7.4，含150 mM NaCl，1 mM EDTA和1％TRITON X-100）中裂解细胞。将裂解物在4°C下以14,000 rpm离心15分钟。收集上清液，并按照制造商的操作规程立即与抗Flag M2亲和力凝胶（Sigma-Aldrich）孵育1小时。用3x标记肽（Sigma-Aldrich）洗脱Flag-ERK2，使用脱盐柱将缓冲液更换为25 mM碳酸氢铵，
通过含有[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-的CellTiter96®AQueous One Solution Reagent（Promega）测量细胞活力。四唑盐，内盐；MTS]和电子偶联剂（吩嗪乙醇硫酸盐； PES）。简而言之，将96孔板中的每孔2000个细胞孵育24小时以粘附，然后在无抗生素的完全培养基中以不同体积的BI-78D3或PLX4720（Selleckchem，Cat＃S1152）进行滴定，最终体积为100 µl培养基。在指定的时间点，每个孔用20 µl试剂处理，再孵育1-4小时，然后使用Victor 3测量490 nm的吸光度。PerkinElmer（马萨诸塞州沃尔瑟姆）的V 1420型读板器。测得的吸光度与培养中的活细胞数量成正比。
在96孔板的每个孔中接种2000个细胞后，将细胞在含5％CO 2的37°C恒温箱中保持18-24 h粘附。在含0.1％DMSO（100微升/孔）的完全培养基中，用不同剂量的BI-78D3处理细胞，但不使用抗生素。当指示洗脱时，在处理后1小时将含有BI-78D3的培养基更换为完全新鲜的培养基。将细胞孵育并使用Incucyte ZOOM显微镜进行分析（每1小时以×10物镜记录图像），该显微镜保持在装有5％CO 2的37°C恒温箱中。使用GraphPad Prism软件估算并绘制实时生长汇合图。
与增殖试验相似，将2000个细胞接种在96孔板的每个孔中，然后温育24小时以粘附。在无抗生素的完全培养基中使用不同剂量的BI-78D3处理细胞，所述完全培养基中含有0.1％DMSO，并按照制造商的方案恒定浓度的IncuCyte Caspase-3 / 7或Annexin V试剂。当指示洗脱时，最初用BI-78D3处理细胞1小时；然后使用含有IncuCyte Caspase-3 / 7或Annexin V试剂的新完整培养基更换培养基。在指示的时间点，将细胞在×10物镜的IncuCyte®ZOOM设备中孵育并成像。将凋亡细胞的数量标准化为最终时间点的融合百分比，以说明细胞增殖。
如先前所述确定了独立于锚地的生长69。简而言之，将A375或HEK293T细胞血清饥饿过夜，然后在胰蛋白酶消化之前在无血清培养基中用不同剂量的BI-78D3处理2小时。对于A375细胞系，将2500个细胞重新悬浮在0.35％SeaPlague GTG琼脂糖生长培养基（含5％FBS的RPMI培养基）中，然后铺板在含有固定的0.7％SeaPlague GTG琼脂糖的生长培养基中的六孔板中（RPMI培养基5％FBS）。对于HEK293T细胞系，将10,000个细胞重悬于0.3％SeaPlague GTG琼脂糖生长培养基（含10％FBS的DMEM培养基）中，然后接种于60mm TC板中，该板中含有凝固的0.7％SeaPlague GTG琼脂糖的生长培养基（含10％DMEM的DMEM培养基） FBS）。
将A375，HEK293T，MEL-1617和451 Lu细胞血清饥饿过夜，然后在胰蛋白酶消化之前在无血清培养基中用不同剂量的BI-78D3处理2小时。将细胞重新铺板（每孔2500个细胞）在含有RPMI培养基的六孔板中，其中RPMI培养基具有用于A375的5％FBS或用于MEL-1617和451 Lu细胞系的10％FBS。将HEK293T细胞重新铺板（10,000个细胞/板）在60mm TC板中，加入10％FBS的DMEM培养基。使细胞生长14天。然后将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，并用0.2％结晶紫（在20％甲醇中）染色10分钟。用蒸馏水将细胞洗涤几次，并计数形成的菌落。
在没有抗生素的完全培养基中，将A375细胞用DMSO或6 µM BI-78D3处理24、48或72 h。对于洗脱实验，在DMSO或BI-78D3处理1小时后，用1x温暖的PBS缓冲液洗涤细胞，然后在完整的新鲜培养基中孵育以进行其余的实验。收集细胞，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并在冰冷的70％乙醇中于-20°C固定过夜。第二天，将细胞用PBS洗涤2次，并在室温下重悬于丙锭（PI）/ RNase染色溶液（Cell Signaling Cat＃4087）中30分钟，并避光。使用BD LSRFortessa SORP流式细胞仪进行细胞周期分析。使用FlowJo v10（Tree Star，Inc.，Ashland，OR，USA）软件和ModFit 3.0（Verity）软件分析从细胞周期分布获得的数据。使用FlowJo v10估计G1，S和G2中的细胞百分比。使用ModFit 3.0软件确定凋亡（sub-G1）群体中细胞的百分比。
将A375细胞维持在补充有5％（v / v）FBS（Invitrogen），100U ml -1青霉素（Invitrogen）和100g ml -1链霉素（Invitrogen）的RPMI培养基（Invitrogen）中。将细胞在加湿的5％CO 2培养箱中于37°C下培养。25,000个细胞放置在聚升赖氨酸包被的盖玻片接种在24孔板中，温育粘附24小时。根据制造商的方案，使用Lipofectamine™3000（Invitrogen）试剂转染pcDNA-ERK2-WT或突变体。将细胞再孵育36小时，然后在无血清培养基中再维持一晚。用25 µM BI-78D3处理细胞2小时，并用EGF诱导15分钟，然后使用PBS洗涤并在室温下于PBS中的4％多聚甲醛中固定10分钟。细胞用0.2％Triton X-100渗透5分钟，并用10％山羊血清封闭（Cell Signaling Technology）。根据制造商的协议使用Image-iT™FX信号增强器（Invitrogen）。通过将细胞与小鼠中产生的单克隆ANTI-FLAG®M2-FITC抗体（F4049-Sigma）一起进行免疫染色。DAPI（4'，
根据得克萨斯大学奥斯汀分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案处理小鼠。在用于实验之前，让所有小鼠适应至少1周。将近交无胸腺裸鼠的右侧腹注射1×10 6 A375恶性黑色素瘤细胞。注射后3天可触摸到肿瘤。当肿瘤达到150mm 3的平均体积时，将小鼠随机分为两组，每组十只。一组接受新鲜配制的溶媒（2.5％EtoH，5％Tween-80、1×PBS）治疗，另一组接受15 mg kg -1的治疗BI-78D3溶解在同一车辆中。每天通过腹膜内注射治疗小鼠，并每日测量肿瘤体积。处理小鼠直到肿瘤达到德克萨斯大学IACUC批准的方案所规定的最大直径1.5cm。通过以下公式估算肿瘤体积：估算肿瘤体积（mm 3）= 0.5236×L1×（L2）2，其中L1和L2分别为长径和短径。对每组的五只小鼠实施安乐死，以通过western blotting和基于肽的生物传感器获得用于分子分析的肿瘤组织53。分析这些小鼠的肿瘤测量结果以进行肿瘤生长比较。
FFPE切片用MD安德森癌症中心研究组织学核心实验室（NCI CA＃16672）的pp-ERK1 / 2抗体染色（Thr202 / Tyr204-克隆20G11 /细胞信号转导）。以盲法（KYT）勾勒出肿瘤切片的区域轮廓，并使用Aperio平台上的ScanScope将染色定量为染色阳性的肿瘤细胞百分比。
为了进行蛋白质印迹，将细胞接种并温育以粘附24小时。将细胞暴露于无血清培养基中指定的时间，然后在无血清培养基中用DMSO或不同剂量的BI-78D3处理。裂解前，用100 nM EGF（Invitrogen）诱导细胞15–30分钟。对于冲洗实验，在DMSO或BI-78D3处理1–2小时后，用1x温暖的PBS缓冲液冲洗细胞，然后在无抗生素的培养基中保持指定的时间，再用100 nM EGF（Invitrogen）诱导额外的15分钟。 -30分钟。为了裂解，将细胞用1x冰冷的PBS（Invitrogen）洗涤，然后在含有1x蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Thermo-Fisher）的M-PER™哺乳动物蛋白提取试剂（Thermo-Fisher）中制备裂解液。将裂解物以13,000 rpm离心20分钟，并使用Bradford分析（Bio-Rad）估算每个上清液中的总蛋白质含量。将每种裂解物50–80 µg在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上分级分离，并转移至Hybond-P PVDF膜（GE Healthcare）或Immobilon-FL膜（Millipore）。使用1：2000抗磷酸化p44 / 42 MAPK（ERK1 / 2）（Thr202 / Tyr204）（E10）小鼠单克隆抗体（Cat＃9106，Cell Signaling Technology）在4°C下将一抗孵育过夜。1：1000抗p44 / 42 MAPK（ERK1 / 2）（137F5）兔单克隆抗体（Cat＃4695，细胞信号技术）; 1：1000抗DYKDDDDK标签（9A3）小鼠单克隆抗体（Cat＃8146，细胞信号技术）; 1：1000抗磷酸化p90RSK（Thr573）兔多克隆抗体（Cat＃9346，细胞信号技术）; 1：1000抗磷酸化p90RSK（Thr359 / Thr363）兔多克隆抗体（Cat＃9344，细胞信号技术）; 1：1000抗RSK1 / RSK2 / RSK3（32D7）兔单克隆抗体（Cat＃9355，Cell Signaling Technology）; 1：500抗磷酸Elk-1（Ser-383）兔多克隆IgG（Invitrogen）; 1：1000抗磷酸化MEK1 / 2（Ser217 / 221）兔单克隆抗体（Cat＃9154，Cell Signaling Technology）; 1：1000抗MEK1 / 2（L38C12）小鼠单克隆抗体（Cat＃4694，细胞信号技术）; 1：2000抗磷酸化SAPK / JNK（Thr183 / Tyr185）（G9）小鼠单克隆抗体（Cat＃9255，Cell Signaling Technology）; 1：2000抗JNK2（56G8）兔单克隆抗体（Cat＃9258，细胞信号技术）; 1：10,000抗磷酸c-Jun（Ser-63），克隆Y172兔单克隆抗体（Cat＃04–212，密理博）或1：1000抗磷酸c-Jun（Ser-63）II兔多克隆抗体（ Cat＃9261，Cell Signaling Technology）；1：1000抗c-Jun（60A8）兔单克隆抗体（Cat＃9165，Cell Signaling Technology）; 1：10,000抗磷酸化p38α（Thr180 / Tyr182），克隆8.78.8兔单克隆抗体（Cat＃05-1059，Millipore）或1：1000抗磷酸化p38 MAPK（Thr180 / Tyr182）（D3F9）XP兔单克隆抗体（Cat＃4511，细胞信号技术）; 1：1000抗p38 MAPK（D13E1）XP兔单克隆抗体（Cat＃8690，细胞信号技术）; 1：1000抗磷酸BMK1 / Erk5（Thr218 / Tyr220）兔多克隆抗体（Cat＃07-507，Millipore）; 1：1000抗Erk5兔多克隆抗体（Cat＃3372，细胞信号技术）; 1/2000抗纽蛋白（E1E9V）XP兔单克隆抗体（Cat＃13901，细胞信号技术）和1：5000抗肌动蛋白，克隆4小鼠单克隆抗体（Cat＃MAB1501R，Millipore）。使用第二抗兔（Bio-Rad）或抗小鼠（Bio-Rad）辣根过氧化物酶偶联的第二抗体和Western Bright ECL Western Blotting试剂（Advansta）进行印迹分析。在某些实验中，在Odyssey荧光Western系统（Li-Cor）上进行了Western blot染色。在这些情况下，二级抗体来自Li-Cor：IRDye 680RD山羊抗兔IgG和IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG。在所有实验中均使用Precision Plus Protein™双色标记（Cat＃1610374，Bio-Rad）。图例中详细提到了有关每个实验重复项的信息。
在ERK选择性传感器（名为ERK-传感器-D1或SOX-子d），即我们报道别处51中，采用一种用于在细胞裂解物中ERK活性进行荧光激酶测定。该测定是在室温下于96孔板（60 µl反应体积）中进行的。将含有25 mM HEPES，pH 7.5、50 mM KCl，2 mM DTT，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA，10 mM MgCl2的测定缓冲液与20μg细胞裂解物蛋白混合，该蛋白按照相同的裂解物制备方法进行蛋白质印迹和0.5 mM ATP。通过添加20 µM ERK-sensor-D1（Sox-Sub-D）开始反应，并使用Victor 3在10-15 s的时间内记录荧光发射（Ex：365，Em：485）30分钟PerkinElmer（马萨诸塞州沃尔瑟姆）的V型1420读板器。使用产物形成的斜率估计反应速率。
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