mTORC1的生长因子和营养臂的同时激活诱导氧化性肝损伤
mTORC1是一个重要的代谢和蛋白激酶是由生长因子和营养信号通路,分别由Rheb和破布gtpase。 这里我们提供第一批动物模型中两个途径调节通过并发突变GTPase-activating蛋白质,Tsc1和Depdc5。 与前模型诱导有限mTORC1 upregulation,肝删除Tsc1和Depdc5(DKO)产生强,协同mTORC1通路的激活和引发了明显和广泛的肝细胞损伤,导致外部可见肝衰竭表型,如黄疸和全面增长的缺陷。 转录组概要DKO不同于单基因敲除突变体,但类似病变的人类肝脏的挑战与重型肝炎和鼠标与氧化压力的化学物质。 此外,DKO肝细胞表现出突出的分子病理与过度内质网(ER)压力、氧化应激、DNA损伤和炎症。 尽管DKO肝脏病理被mTORC1抑制改善,ER应激抑制出人意料地加重,表明ER应激信号不是如何活跃mTORC1产生肝损伤的主要渠道。 有趣的是,超氧化物(NAC)和Tempol食腐动物防治作用,化学物质,降低氧化应激,能够恢复肝脏表型,表明mTORC1 hyperactivation诱导肝损伤主要通过氧化应激通路。 我们的研究提供了一种新的模型,不受监管的mTORC1激活通过伴随upregulation生长因子和营养信号轴和显示mTORC1 hyperactivation就能引发氧化组织损伤。
哺乳动物雷帕霉素靶复杂1 (mTORC1)是一个复杂的蛋白激酶,促进细胞合成代谢反应/胰岛素生长因子刺激和营养丰富1,2,3.,4。 监管mTORC1被认为是由两个小G蛋白,Rheb和破布4,5。 的结节性硬化症(TSC)和活动的差距对破布1复杂(GATOR1) GTPase-activating蛋白质(差距),调节Rheb和抹布,分别4,5。 TSC, TSC1和TSC2组成的蛋白质,mTORC1介导生长因子和能量信号6,7组成的,而GATOR1 DEPDC5, NPRL2 NPRL3蛋白质氨基酸传感是必不可少的8,9和压力反应10mTORC1通路。
DEPDC5是一个组件的GATOR1绑定和抑制抹布的关键8,9。 DEPDC5也涉及多种人类疾病包括大脑和肝脏疾病11,12,13,14,15。 基因变异的DEPDC5轨迹与全身的丙型肝炎病毒(HCV)相关肝细胞癌在日本人口13欧洲人口、HCV-induced纤维化进展14和乙型肝炎病毒(HBV)相关hepatocarcinogenesis中国人口15。 然而,是否DEPDC5调节肝内稳态和它如何影响肝脏疾病进展还没有进行一个完整的动物模型。
mTORC1, DEPDC5 TSC1目标,是一个重要的在肝脏代谢调节剂2,3.。 mTORC1激活对上调蛋白质很重要翻译通过磷酸化两个基板:p70核糖体蛋白S6激酶(S6K)和翻译起始因子4 e结合蛋白1 (4 e - bp1)1。 mTORC1同时上调脂质和核酸合成表达下调自噬通过抑制分解代谢unc-51-like自噬激活激酶(ULK1)1,2,3.,4。 因此,mTORC1规定被认为是维护肝脏代谢体内平衡的关键2,3.。 事实上,扰乱mTORC1通过肝脏特异性删除的猛禽,一个基本单元,自发诱导肝损伤与炎症和纤维化有关16。 这加速肝脏致癌diethylnitrosamine管理(穴),化学hepatocarcinogen16。 激活mTORC1 hepatocyte-specific删除Tsc1(Tsc1Δhep)也在老年小鼠肝脏炎症和致癌作用,但这些疾病在年轻的老鼠不明显17,18。
鉴于DEPDC5的重要性在营养和stress-dependent mTORC1监管8,9,10,DEPDC5 mTORC1在肝细胞的重要调节器。 理解遗传DEPDC5在肝脏的作用,我们生成的Depdc5Δhep老鼠,hepatocyte-specific删除的Depdc5基因。 类似于Tsc1Δhep老鼠,Depdc5Δhep老鼠轻微海拔mTORC1活动和表现出轻微的炎症和纤维化在先进的时代。 然而,当Depdc5Δhep老鼠了,Tsc1Δhep老鼠,更引人注目的表型观察。 虽然单个删除Depdc5或Tsc1在肝脏稍微调节mTORC1没有总表型,hepatocyte-specificDepdc5和Tsc1双基因敲除(DKO)小鼠健壮mTORC1激活诱导显著的肝细胞损害。 因此,严重肝功能衰竭伴有黄疸,肝肿大,皮毛变色和生长抑制观察8周的年龄。 转录组分析RNA-seq和随后的蛋白质分析表明DKO肝脏遭受过度的ER应激和氧化应激导致代谢失调,DNA损伤和炎症。 在这些输出,氧化损伤是最关键生产DKO病态,而ER应激信号保护肝细胞通过抑制mTORC1负反馈机制。
两个月大的老鼠的肝脏的免疫印迹分析表明Alb-Cre/Depdc5/ F(Depdc5Δhep)老鼠失去肝Depdc5表达和稍微调节水平的磷酸化S6 (p-S6),下游的标志mTORC1(无花果。1)。 苏木精和伊红染色(圆))肝脏部分显示,两个月Depdc5Δhep小鼠特定的中心周围的区域扩大3肝细胞(无花果。1 b和补充图。S1a),与局部高浓度的p-S6疣状(图1 c和补充图。S1a)。
两个月大一个- - - - - -c或5个月大d- - - - - -我同窝出生的Depdc5Δhep和Depdc5/ F雄性老鼠受到以下分析。一个肝脏溶菌产物受到免疫印迹和抗体(左)表示。 带强度量化(n= 3; 右)。b,c肝脏部分受到)染色b和anti-phospho-S6疣状c。 盒装insets区域放大。d,e血清ASTd和ALTe化验(n≥6)。f- - - - - -我肝脏部分受到)f,F4/80g,TUNELh和小天狼星红(母本,我)染色。 TUNEL和SiRed-positive地区量化(n= 3)。 数据显示为±SEM。 *P< 0.05(学生的t以及)。 酒吧,规模200µm
符合受损区3内稳态,Depdc5Δhep老鼠更广泛受损的高剂量对乙酰氨基酚(APAP即),引起肝细胞死亡最显著的区域3,相比同窝出生仔畜控件(补充图。印地)。 APAP-induced肝mTORC1激活19,20.,21也更强Depdc5Δhep老鼠(补充图。就是S1c)。 因此,Depdc5似乎稳态调节的关键区3肝细胞,抑制肝mTORC1激活和肝细胞肥大,从APAP即损伤和保护。
五个月Depdc5Δhep老鼠表现出轻微但显著提升血清肝损伤的标志:AST(无花果。1 d)和ALT(无花果。1 e)。 尽管这些值仍在正常临床范围,它有可能获得亚临床水平的轻微的肝脏疾病。 组织学分析确实显示偶尔肝脏炎症(图。1 f, g(图),肝细胞死亡。1 h)和纤维化(无花果。1我在五个月Depdc5Δhep老鼠。 免疫印迹分析也证实mTORC1信号upregulation(补充图。S1d在五个月)和增加纤维发生的标记表达式Depdc5Δhep老鼠(补充图。S1e)。 因此,类似于先前描述的Tsc1Δhep老鼠18,Depdc5Δhep老鼠也会表现出年龄相关性自发的肝脏疾病的发展。
尽管炎性表型,Tsc1Δhep小鼠肝脏脂肪含量表达下调通过阻断胰岛素依赖型脂肪生成的途径22。 同样的,Depdc5Δhep老鼠也会表现出降低肝脂肪含量低脂肪饮食(最晚完成日期,补充图。S1f)和高脂肪饮食(HFD补充图。S1g)条件下,在不改变身体体重增加(补充图。S1h)。 因此,由肝脏特异性表型展出Depdc5淘汰赛中通常是类似的Tsc1淘汰赛。
破布和Rheb是最重要的两个小gtpase直接调节mTORC14,5。 自Depdc5 Tsc1抑制破布和Rheb至关重要,我们假设分别在这两个基因突变可能基因(图互动。2)。 尽管这些途径在培养细胞进行了广泛的研究,基因之间的交互破布和Rheb通路尚未检查完整的动物。
控制(反对),Tsc1Δhep(Tsc1),Depdc5Δhep(Depdc5),Tsc1Δhep/Depdc5Δhep(DKO雄性小鼠生成)在两个月大的同胞和分析(n≥3)。一个示意图的Rheb和破布通路调节mTORC1。b总出现反对和DKO同窝出生的。c体重、肝重、附睾的白色脂肪组织(eWAT)和肝脏重量/体重比率。d血清肝板化验。 蓝色阴影区域表示临床正常的范围。e宏观的肝脏(宏观),他走时染色和天狼星红染色(母本)肝脏部分。 箭头表示坏死病变。 黄色框区域放大在相应的下一行。 蓝色和绿色盒装地区在右面板放大。 小天狼星Red-positive纤维化领域被量化。 数据显示为±SEM。 的影响Tsc1和Depdc5突变及其交互作用(Tsc1×Depdc5通过双向方差分析)进行了评估(#P< 0.05;##P< 0.01;# # #P< 0.001;####P< 0.0001)和之间的统计学意义反对并表示组评估通过图基的多重比较测试($ $P< 0.01;$ $ $P< 0.001;$ $ $ $P< 0.0001)。 酒吧,200µm(组织学)和1厘米(肝)
测试的基因相互作用,我们走过Depdc5Δhep老鼠Tsc1Δhep老鼠。 虽然Depdc5Δhep/Tsc1Δhep双敲除小鼠(DKO)出生在预期的孟德尔比率,其经济增长受到抑制,皮毛是灰色的,两个月大(图斑片状。2 b,c和补充图。S2a)。 这些表型没有观察到同窝出生的其他基因型,包括Depdc5Δhep和Tsc1Δhep单淘汰赛。 虽然身体和脂肪组织DKO小鼠体重急剧减少,肝脏重量是类似于控制和单基因敲除小鼠,导致大幅增加肝/体重比(无花果。2摄氏度和补充图。S2a)。
控制和DKO小鼠的体重区别不是在6天小鼠(补充图。开通),表明DKO老鼠不可能较低出生体重和减肥由于疾病进展。
从DKO小鼠血清黄色,表明胆红素堆积。 所有血清标志物显著高于正常肝损伤和功能障碍是升高的临床范围(图。二维)。 与此一致的是,他走时染色显示大量坏死病变(箭头在无花果。2 e和补充图。S2c)DKO肝脏。 DKO老鼠的肝脏非常僵硬,小天狼星红染色显示广泛pericellular整个肝纤维化(无花果。2 e,底部)。 纤维化病变更强烈的坏死区域,通常与增殖相关胆管(无花果。2 e在蓝色和绿色框),放大图像。 表型都充分渗透,突出男性(图中观察到。2)和女性(补充图。S2a c)。
进一步描述与TUNEL染色显示肝组织细胞凋亡增加DKO肝脏(图。3a)。 此外,组织学和免疫印迹分析证实,DKO肝纤维化标志物的表达增加,远远超过单淘汰赛(无花果。3 b, c)。 然后,我们分析了mTORC1信号通过监测磷酸化的底物,S6K和4 e - bp1。 虽然这些目标的磷酸化调节Depdc5Δhep和Tsc1Δhep,DKO老鼠肝脏表现出协同活化,水平远远超出水平通过单淘汰赛的同胞(无花果。3 d)。 这不是一个简单的,累加效应的协同作用是健壮和统计支持通过双向方差分析(无花果。3 d)。 因此,伴随Rheb和破布通路的激活产生了强烈的遗传相互作用和协同增加纤维化和调节mTORC1(无花果。3.)。
鼠标队列中描述的图。2受到组织学一个,b和免疫印迹c,d如下面。一个TUNEL染色肝部分。 盒装在右面板面积放大。 TUNEL-positive地区量化。b肝脏部分受到α-SMA染色。 盒装区域在右面板放大。 α-SMA染色强度量化。c从肝脏溶菌产物,纤维发生的标记表达式通过免疫印迹分析。 带强度量化(n= 3)。d从肝脏溶菌产物,通过免疫印迹mTORC1磷酸化的底物进行了分析。 带强度量化(n= 3,意味着±SEM)。 数据显示为±SEM。 * * *P< 0.001(学生的t以及)。 的影响Tsc1和Depdc5突变及其交互作用(Tsc1×Depdc5通过双向方差分析)进行了评估(#P< 0.05;##P< 0.01;# # #P< 0.001;####P< 0.0001)和之间的统计学意义反对并表示组评估通过图基的多重比较测试(美元P< 0.05;$ $ $P< 0.001;$ $ $ $P< 0.0001)。 酒吧,规模200µm
测试是否的病理协同作用Tsc1和Depdc5突变是由于只mTORC1 hyperactivation,我们注入DKO与雷帕霉素的老鼠,mTORC1化学抑制剂。 有趣的是,雷帕霉素的管理过程中,DKO老鼠恢复正常生长(图。4)。 经过10天的雷帕霉素管理、肝/体重比值(图。4 b),以及所有的血清标志物的肝损伤和功能障碍(无花果。4摄氏度),显示大幅回升,表明mTORC1 hyperactivation确实是DKO小鼠肝脏病理观察到的主要原因。 进一步证实了这些观察,肝组织学(无花果。4 d)和免疫印迹(无花果。4 d-f)表示,10天的雷帕霉素政府足以拯救所有检查肝脏疾病,包括mTORC1 hyperactivation(无花果。4 e)、肝损伤、炎症和纤维化(无花果。4 d-f)。
同窝出生仔畜群六DKO老鼠注射每日车辆(阿明费)或10毫克/公斤雷帕霉素(Rap) 10天(n≥4)。 对药物治疗实验中,小鼠与雄性和雌性的准确性。一个体重监控整个课程的实验。b肝脏/体重比实验测量的端点。c肝损伤的血清标记进行了分析。 蓝色阴影区域表示临床正常的范围。d肝脏部分分析)、扬和TUNEL染色。 盒装在较低的面板区域放大。 纤维区和TUNEL区量化(n= 3)。e,f肝脏溶菌产物受到免疫印迹(左面板)和量化(右面板)检查mTORC1信号e和纤维发生的标记f。 数据显示为±SEM。 *P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P(学生t p < 0.001)。 天雷帕霉素和治疗之间的交互(说唱×天)评估通过RM双向方差分析(####P< 0.0001),差异在个人数据点通过Sidak多重比较测试评估(美元P< 0.05;$ $P< 0.01;$ $ $ $P< 0.0001)。 免疫印迹量化,Holm-Šidak方法用于比较组($ $P< 0.01;$ $ $P< 0.001;$ $ $ $P< 0.0001)。 酒吧,规模200µm
DKO肝脏病理与PCNA染色(补充图升高有关。S2d),这反映了再生反应损伤和损伤。 雷帕霉素没有进一步提升PCNA染色强度(补充图。S2d),表明它能缓解DKO病理主要是通过恢复肝细胞内稳态,但不是通过促进肝脏再生。
调节mTORC1增加ER应激23。 与此一致的是,DKO肝脏表现出突出的ER应激激活标志(无花果。5和补充图。S2e),明显比Tsc1或Depdc5单淘汰赛(无花果。5)。 ER应激激活标志被雷帕霉素治疗(补充图强烈抑制。S2f g),这表明mTORC1 hyperactivation DKO肝脏引起的ER应激。
鼠标队列中描述的图。2受到免疫印迹一个。 六个DKO老鼠注射每日车辆(阿明费)或500毫克/公斤TUDCA 10天(b- - - - - -e;n≥9)。 对药物治疗实验中,小鼠与雄性和雌性的准确性。一个ER应激信号标志的检查表明肝脏溶菌产物通过免疫印迹(左面板)和量化(右面板)。b老鼠生存监控整个课程的实验。 的P通过生存率较值的计算。c肝脏/体重比实验测量的端点。d肝脏部分分析通过)和扬染色。e肝脏溶菌产物受到免疫印迹(左面板)和量化(右面板)检查ER应激信号(上),mTORC1信号(中间)和纤维发生的标记(底部)。 提出了数据均值±SEM (n≥3)或实际值b。 *P< 0.05(学生的t以及)。 的影响Tsc1和Depdc5突变及其交互作用(Tsc1×Depdc5通过双向方差分析)进行了评估(#P< 0.05;##P< 0.01;# # #P< 0.001;####P< 0.0001)和之间的统计学意义反对并表示组评估通过图基的多重比较测试($ $P< 0.01;$ $ $P< 0.001;$ $ $ $P< 0.0001)。 免疫印迹量化,Holm-Šidak方法用于比较组(美元P< 0.05;$ $P< 0.01;$ $ $ $P< 0.0001)。 酒吧,规模200µm
ER使用化学监护人可以减轻压力,比如tauroursodeoxycholic酸(TUDCA),促进体内新生蛋白质折叠24,25。 因此,我们DKO小鼠注射TUDCA缓解ER应激。 出乎意料的,超过一半的老鼠死于TUDCA管理局(无花果的10天。5 b)。 这是令人惊讶的,因为以前的工作表明,TUDCA注入有利于WT老鼠,不是致命的24,25。 此外,幸存的老鼠表现出更大的肝/体重比值(无花果。5度)和更严重的肝脏组织病理学与坏死和纤维化病变增加有关(无花果。5 d)。
根据这些观察,我们质疑如果TUDCA实际上解除了ER应激DKO老鼠。 免疫印迹显示,尽管加重表型,TUDCA通常减少肝ER应激(无花果。5 e,最高)。 许多ER应激标记,p-PERK、p-eIF2αATF4毕普,TUDCA治疗后均明显下调; 然而,一些标记,PDI和排骨,没有改变。 有趣的是,mTORC1信号标记都调节TUDCA治疗后(图。5 e、中),这表明存在ER应激信号有限mTORC1激活。 TUDCA治疗后纤维发生的基因的表达增加(图5 e底部),符合观察TUDCA实际上ER减压肝脏疾病恶化。 这些结果表明,ER压力并不是DKO肝损伤的一个主要渠道但可能限制mTORC1激活函数作为一个负面的反馈。
从ER应激抑制由于意想不到的结果,我们试图DKO表型方法发病的机制更加系统。 因此,我们决定从控制转录组的肝脏,Tsc1Δhep,Depdc5Δhep通过RNA序列,DKO老鼠(补充表S1)。 虽然Tsc1Δhep和Depdc5Δhep老鼠,老鼠显示适度的转录组变化控制DKO老鼠强偏离控制肝脏转录组配置文件(图。6)。 热图分析个体之间相关性的数据进一步表明,DKO肝脏有一个独特的转录组剖面最强烈相关,但与控制或单淘汰赛(补充图。S3a)。 主成分分析的实验也表明,复制反对,Tsc1Δhep和Depdc5Δhep样品表现出相对相似的转录组配置文件,而DKO样本(图显示一个高度不同的概要文件。6 b)。 同样地,尽管转录组变化引起的单删除Tsc1或Depdc5相关的相对较好,DKO-induced变化相关性较低与单knockout-induced变化(补充图。S3b)。 所有这些结果的生活会表明DKO肝脏有转录组配置文件不同于控制或单淘汰赛肝脏组织。
鼠标队列中描述的图。2受到RNA-seq分析。一个比较平均之间的基因表达控制概要文件和个人RNA-seq概要文件从肝脏组织的控制(n= 3),Tsc1Δhep(n= 2),Depdc5Δhep(n= 2)和DKO (n= 3)老鼠。 每个点代表一个信使rna物种在不同颜色的数据集。 数据集之间的相关性,看到补充图。S3a。b主成分分析(PCA)描绘个人RNA-seq概要文件之间的关系。 每个点代表整个RNA-seq概要文件从一个肝脏样本。 区别是描述空间; 类似的资料集中,而不同的配置文件都位于远离对方。c记录集群生成使用k则算法(n= 7),使用mRNA表达折叠的变化值Tsc1,Depdc5,DKO样品在反对样本。d- - - - - -我,k酒吧图表代表所有基因的分布(白色的酒吧)和ER stress-inducible基因d细胞因子/趋化因子通路的基因efibrosis-associated基因f,在晚期纤维化基因调节人类丙肝病毒感染g,基因调节人类纳什与小叶炎症h,与纤维化基因调节人类纳什我或基因诱导小鼠肝脏在12 h后杀(DQ)治疗k。 基因充实集群1和2被确切概率法检查,和P值显示在图。j,l比较基因表达的诱导褶皱变化DKO肝脏(X轴在两个面板)和丙肝病毒病理进展j或DQ注入,Sod1突变,两l。 相关性评估通过计算非参数斯皮尔曼相关(r);P< 0.0001为所有相关的观察。米列表始终代表基因调节的DQ +Sod1突变和DKO突变。 热图图代表mRNA表达褶皱变化从平均控制值(表示为日志2值)
理解的本质DKO-specific转录组差异,我们通过基因分为7个不同的类别k集群,则根据其表达的变化Tsc1Δhep,Depdc5Δhep,DKO肝脏(无花果。6摄氏度和补充表S2)。 在7集群中,只有一小部分基因是强烈和持续调节,集群1和2,或表达下调,集群6和7,在DKO老鼠(图。6摄氏度)。 与我们的免疫印迹结果(图一致。5),ER逆境应答基因,如Atf4和切/ Ddit3,最调节DKO老鼠(补充图。S3C)。 但是,当我们分析整个已知的ER stress-inducible基因26,他们没有过多的集群(图1和2。6 d),这表明ER应激激活不是主要的转录组特性描述DKO表型。 这支持了我们的药理实验表明ER应激不是DKO小鼠肝脏病理的管道的(无花果。5)。
相比之下,属于细胞因子和趋化因子基因信号通路在集群高纯度(图1和2。6 e在DKO肝脏)和显著的调节(补充图。S3d),这表明炎症通路是DKO转录组的特征。 此外,在组织纤维化基因调节,如胶原蛋白、基质金属蛋白酶(MMPs),组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)和鉴定及通路的基因,也高纯度集群(图1和2。6 f在DKO肝脏(补充图)和诱导。S3e)。 这些都是符合广泛的肝损伤和纤维化表型DKO我们观察到的老鼠。
根据这些观察,我们很好奇如果DKO老鼠的基因表达变化所诱导的肝脏有任何相似之处人类肝脏炎症和纤维化疾病。 为此,我们利用最近出版的转录组剖面数据集建立了使用纤维人类肝脏组织与丙肝病毒感染有关27或非酒精性脂肪肝炎(纳什)28。 在晚期纤维化基因调节丙肝病毒感染(无花果。6克),小叶炎症(图。6小时)和纤维化(无花果。6我在纳什在集群高纯度(图1和2。6胃肠道)。 因为集群1和2中强烈的调节基因DKO老鼠肝脏(图。6摄氏度),这些结果表明,DKO小鼠肝脏模型人类炎症和纤维化的肝脏疾病与丙肝病毒和纳什。 此外,与丙肝病毒纤维化进展相关的基因表达变化显示正相关的变化引起DKO(无花果。6 j)。 这些结果共同表明DKO老鼠经历严重的肝脏炎症和纤维化,transcriptomically类似与人类的丙肝病毒和纳什病态。
检查集群1和2发现,除了调节炎症和纤维化基因(补充图。S3d e)、氧化应激(补充图。S3f)和DNA损伤(补充图。S3g)强烈响应基因调节DKO老鼠。 Sestrins (Sesn1-3)和redd (Ddit4和Ddit4l),这是stress-inducible负反馈mTORC1通路的监管机构10,29,也调节DKO肝脏(补充图。S3h)。 诱导Sestrin2检测蛋白质水平(补充图。S2h),激活AMPK, Sestrin2下游目标,也观察到DKO肝脏(补充图。S2h)。 相比之下,主要的尿蛋白(补充图。S3i)和细胞色素p450(补充图。S3j),其在降低生长激素信号表达降低30.或在炎症和氧化应激31,32,33分别在DKO强烈表达下调小鼠肝脏(补充图。S3k l)。 虽然很多细胞色素P450基因表达下调,一些基因,如Cyp2b10这是调节在肝损伤和纤维化34,35调节(补充图。S3j),发现在集群1(补充图。S3l)。 这些转录组特性表明,DKO老鼠肝脏移植途径应对氧化应激和随后的DNA损伤。
Upregulation氧化应激反应基因涉及氧化应激的存在。 氧化损伤可以通过DNA沉淀大量的肝脏病理损伤,炎症、纤维化、肝损伤和肝细胞死亡36从DKO,所有观察到的老鼠的肝脏。 因此,我们测量肝脏氧化应激的水平dihydroethidium(她)染色可视化超氧化物自由基37。 DKO肝脏有明显的海拔她染色强度(图。7一个),削弱了雷帕霉素治疗(图。7 b)。 有趣的是,她强度变得更调节DKO TUDCA处理时(无花果。7 c),符合upregulation mTORC1和加重肝脏病理(无花果。5)。 这些结果表明,DKO肝脏遭受严重氧化应激过度超氧化物自由基的积累。
无花果中描述的鼠群。2,4和5进行了分析。 同窝出生仔畜群六DKO老鼠继续汽车饮用水(阿明费)或0.064% Tempol-containing水10天(n≥6)。 对药物治疗实验中,小鼠与雄性和雌性的准确性。一个- - - - - -dDihydroethidium(她)染色肝部分和量化。e体重监控整个课程的实验。f肝脏/体重比实验测量的端点。g肝损伤的血清标记进行了分析。 蓝色阴影区域表示临床正常的范围。h肝脏部分)染色法进行了分析。 盒装在右面板面积放大。我肝脏部分分析了扬染色。 纤维化的地区被量化。j肝脏溶菌产物受到免疫印迹(左面板)和量化(右面板)检查ER应激标记(上),mTORC1信号(中间)和纤维发生的标记(底部)。 提出了数据均值±SEM (n= 3)。 *P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P< 0.001; * * * *P< 0.0001(学生的t以及)。 Tempol之间的相互作用和治疗天(Tempol×天)评估通过RM双向方差分析(####P< 0.0001),差异在个人数据点通过Sidak多重比较测试评估($ $美元美元P< 0.0001)。 免疫印迹量化,Holm-Šidak方法用于比较组(美元P< 0.05;$ $P< 0.01)。 酒吧,规模200µm
过氧化物可以由有毒化学物质,如杀(DQ)。 内源性超氧化物歧化酶(Sod1)是重要的减少过氧化物和压制他们的毒性作用38。 DQ治疗引起的肝脏表达的基因38高纯度在集群(图1和2。6 k),这表明DKO肝脏调节DQ-induced基因。 此外,基因表达变化引起的DQ治疗,Sod1突变,或者两者都表现出正相关关系在整个转录组水平DKO-induced变化(图6 l)。 因此,大部分的DQ -Sod1DKO肝脏mutation-induced也调节基因,这些基因包括那些参与氧化应激反应,DNA损伤反应和ER应激(无花果。6米和补充图。S3)。 综上所述,我们推测,氧化应激,特别是超氧化物的积累,是最显著的特性之一DKO老鼠的肝脏。
测试是否超氧化物堆积的病理管道DKO-induced mTORC1 hyperactivation,我们对待Tempol的老鼠,一种membrane-permeable超氧化物歧化酶模拟物39,40。 正如所料,Tempol高度有效地降低染色在DKO肝脏(图。7 d)。 有趣的是,Tempol-treated DKO老鼠表现出显著的体重增加5天的治疗后(图。7 e),这表明像雷帕霉素,Tempol能够释放DKO老鼠从系统性增长抑制。 此外,10天Tempol政府足以减少肝脏/体重比(图。7 f),以及血清肝损伤(图的标记。7 g)。 Tempol也大大减少坏死(无花果。7小时),纤维(图。7我DKO)病变表现出的小鼠肝脏(图。7小时,我)。 这些观察结果支持通过免疫印迹分析,Tempol治疗强烈降低纤维化标志物表达DKO老鼠(图。7 j)。 有趣的是,ER应激标记表达式也减少了Tempol,表明超氧化物堆积也促成了mTORC1-induced ER应激(无花果。7 j)。 然而,磷酸化mTORC1下游目标不是Tempol压制的,确认Tempol特别减少过氧化物积累而不影响mTORC1信号(图。7 j)。 与观测一致,mTORC1仍hyperactivated, Tempol政府没有抑制肝细胞肥大(无花果。7小时箭头),而其他病理功能被大大抑制(图。7 e-j)。
抑制肝脏病理DKO时再次被观察到小鼠治疗防治(NAC),另一种抗氧化剂,进行清除超氧化物自由基(补充图。S4)。 总的来说,这些结果表明,活性氧的生产,如超氧化物自由基,是如何活跃的主要病理管道mTORC1 DKO小鼠诱发肝损伤和沉淀病态。
DKO老鼠经历过低血糖(图。8和补充图。S5a),可能由于肝脏功能障碍和随后的减少肝脏葡萄糖输出。 DKO小鼠的血糖水平不降低响应胰岛素(无花果。8 b和补充图。S5b c),DKO在完整的肝脏肝细胞没有AKT激活胰岛素刺激(无花果。8 c)。 一个可能的解释是由于mTORC1和ER应激hyperactivation,这两个已知引发胰岛素抵抗通过阻断胰岛素receptor-AKT通路24,41。
一个- - - - - -c禁食4 - 6小时后,两个月大的反对和DKO同窝出生的(n≥9)受到一个葡萄糖和b胰岛素耐量测试(分别GTT和ITT)。 根据基线血糖水平(数据归一化b,对吧)。c肝脏收集从反对和DKO同窝出生、禁食4 h后,在(-)或(+)注射胰岛素后5分钟,均质,通过免疫印迹分析(左)和量化(正确的;n= 6)。d肿瘤的发生率和指定的5个月大的老鼠数量(n≥3)。 所有鼠标菌株除了DKO肝肿瘤是免费的。e宏观(宏观)和圆)的组织学图像,图像的母本,网状,ki - 67和PCNA染色显示了五个月的DKO老鼠的肝脏。 箭头表明近似边界的肿瘤结节。 盒装地区在右面板放大。 数据意味着±SEM。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001,* * * *P< 0.0001,NS (P= 0.0712、0.1799和0.6796b离开了,b-正确的,c从一个学生的,分别)t以及。 酒吧,200µm(组织学)和1厘米(肝)
虽然Depdc5Δhep或Tsc1Δhep老鼠发达轻度炎症(图5 - 6个月。1)18,他们没有表现出肝癌,直到他们达到15个月17,18。 自DKO老鼠经验更明显肝损伤在更早的时候,我们假设DKO肝脏会更快地发展为肝癌。 事实上,5个月大的老鼠显示宏观上可见肝肿瘤(无花果。8 d, e宏)。 更多的肿瘤结节组织学部分(图发现的。8 e),补充图。S5d),它经常显示典型的有丝分裂特性(无花果。8 e他走时,右面板)。 结节周围纤维组织,但结节本身缺乏纤维化(无花果。8 e、生产和补充图。S5e)。 这些结节也显著降低网状染色(图显示。8 e、网状和补充图。S5f)和高频率的ki - 67和PCNA染色(图8 eki - 67和PCNA),表明他们确实是肝细胞癌。
mTORC1是一个重要的肝代谢和蛋白激酶是由两个小gtpase Rheb和破布1,2,3.,4。 Rheb介导生长因子调控,而破布调节压力和营养控制。 虽然Rheb和破布途径进行广泛研究,没有遗传的研究是否这两个通路相互作用生理mTORC1监管在一个完整的多细胞生物。
Rheb和破布是由各自的差距,TSC和GATOR14,5。 TSC1 TSC和DEPDC5是必不可少的组成部分和GATOR1,分别。Tsc1删除在小鼠肝脏产生抑制脂肪氧化等多效性的代谢表型42和酮生成43,FGF21增加生产44,降低胰岛素敏感性和脂肪生成22。 然而,Tsc1肝脏中删除(Tsc1Δhep)在年轻的老鼠没有造成严重病态,虽然促进了与年龄有关的一岁大的老鼠的肝脏炎症和致癌作用17,18。 Depdc5在肝脏的生理作用并不曾调查,直到当前的研究。 在这里,我们表明,Depdc5删除在小鼠肝脏调节肝区3 mTORC1最显著,相对稀缺的氧气和营养。 自从GATOR1对抑制mTORC1不营养条件很重要8,似是而非的GATOR1调节mTORC1区3肝细胞是至关重要的。 在葡萄酒的成熟与陈酿过程Depdc5Δhep老鼠,mTORC1 upregulation变得更加明显,导致表型相似Tsc1Δhep老鼠,如轻微的炎症和降低脂肪含量。 符合他们的温和的表型相似,Depdc5Δhep和Tsc1Δhep小鼠相似的转录组的概要文件,只有适度不同于野生型形象。
跨越Depdc5Δhep老鼠Tsc1Δhep老鼠,我们表明,突变Depdc5和Tsc1生成一个协同遗传相互作用,产生一个很强的hyperactivation mTORC1。 这提供了遗传学证据在动物模型确认Rheb确实和破布通路mTORC1监管在生理环境中进行交互。 mTORC1 hyperactivation DKO老鼠导致肝脏功能障碍与著名的肝细胞损伤和纤维化有关的两个月的年龄。 这导致了戏剧性的仰角肝损伤标志物的血清。 血清中胆红素堆积过多导致外部可观察黄疸的表型。 此外,由于肝脏胰岛素样生长因子的主要来源是必不可少的全面增长,肝功能衰竭DKO老鼠也会抑制增长。 在肝脏转录组水平,具体压力反应途径,如氧化应激、炎症、DNA损伤和细胞死亡通路被强烈的调节。 所有的这些显著的表型没有体现Tsc1Δhep或Depdc5Δhep单基因敲除菌株或任何以前mTORC1激活的模型,描述等Deptor基因敲除小鼠45。 因此,我们当前的工作提供了一个独特的模型不受监管的mTORC1激活并显示mTORC1 hyperactivation本身可以破坏肝细胞内稳态,引发肝损伤和失败。
mTORC1监管通过多种负面反馈循环。 mTORC1 hyperactivation被抑制Akt通过S6K——或者Grb10-mediated反馈抑制胰岛素的信号41,46,47。 由于Akt是mTORC1 upregulator, Akt抑制可以限制mTORC1激活。 然而,与此同时,抑制insulin-AKT信号也可以沉淀代谢胰岛素抵抗。 相应地,DKO老鼠肝脏表现出强烈的胰岛素抵抗,并从DKO小鼠肝细胞没有AKT激活胰岛素的反应。 虽然DKO肝脏遭受强烈的胰岛素抵抗、血糖水平相当强烈由于肝细胞内稳态的恶化和减少后续减少肝脏葡萄糖输出。
除了涉及胰岛素信号,反馈回路Sestrins还可以提供一个负面反馈mTORC1通路的机制。 在果蝇中,Sestrin是一个重要的反馈通过Tsc1/2 mTORC1通路的抑制剂48和Depdc549通路。 在当前的工作中,我们发现Sestrins删除Tsc1后表达水平显著升高,Depdc5或两者兼而有之。 AMPK, Sestrins抑制mTORC1下游效应器之一10在这些组织,随后激活。 Redd1 (Ddit4)和Redd2 (Ddit4l),抑制mTORC1通过Tsc1 / Tsc2 upregulation29,也在mTORC1-activated调节肝脏组织。 因此,它是可能的,在我们mTORC1激活模型,Sestrins和redd可能导致负面反馈抑制限制mTORC1活动。
很引人注目,所有的肝脏病理DKO老鼠几乎完全拯救只有10天的雷帕霉素治疗。 肝脏/体重比值恢复到正常水平,血清和肝损伤标记也临床恢复接近正常范围。 尽管雷帕霉素在历史上被认为是增长衰减器,rapamycin-mediated正常化肝内稳态实际上促进了全面增长在这个特定的DKO模型。 对雷帕霉素治疗、坏死和纤维化病变DKO老鼠消失,肝细胞ER应激、氧化应激和凋亡都松了一口气。 因此,mTORC1确实Rheb和破布的主要渠道通路pathogenetically交互产生肝损伤和失败。
mTORC1 upregulation增加蛋白质合成,蛋白质折叠机制可以负担,因此引起的蛋白质的积累,也称为ER应激23。 DKO老鼠肝脏展出upregulation ER应激信号的蛋白质含量,证实mTORC1 hyperactivation DKO老鼠确实沉淀的蛋白质积累和ER应激。 然而,ER应激反应通路中没有过多DKO转录组、提高ER应激通路是否重要的问题DKO病态。 TUDCA,化学女伴,有效地抑制肝细胞ER压力DKO小鼠肝脏,在拯救DKO肝脏病理是完全无效的。 相反,TUDCA-treated DKO老鼠增加mTORC1活化,进一步其余DKO小鼠肝脏病理的死亡。 即使在幸存的老鼠,TUDCA政府表达的增加纤维发生的标记和更广泛的肝细胞损害。 ER应激信号可能在某种程度上限制mTORC1活化,减少其对肝脏健康的负面影响。 这些数据还表明,ER应激信号不怎么活跃mTORC1破坏肝细胞内稳态的重要机制。
除了诱导ER应激,mTORC1 hyperactivation可以提高氧化应激通过改变线粒体代谢50,51消除,抑制自噬的功能失调的线粒体48,52,抑制superoxide-scavenging Sod1的行动53。 事实上,DKO肝脏经历严重的超氧化物自由基氧化应激与过度积累和表现出转录组类似于DQ-induced氧化应激和概要文件Sod1的损失。 这种高水平的氧化应激损伤细胞大分子包括DNA。 与此一致的是,DKO转录组还展出upregulation DNA损伤反应的基因。 管理化学抗氧化剂清除超氧化物自由基,如Tempol和南汽,有效减少肝脏氧化应激。 令人惊讶的是,10天的抗氧化剂政府足够的规范化几乎所有肝脏病理参数观察DKO小鼠肝脏,甚至恢复正常生长。 因为mTORC1信号本身不是由化学抑制的抗氧化剂,这些结果表明,活跃mTORC1信号引起肝功能衰竭主要通过超氧化物自由基,损伤肝细胞的诱导。
在组织层面,mTORC1 hyperactivation产生串扰与一些额外的途径。 例如,NF-kB目标基因等白细胞介素654和Cd4455,及信号的目标基因Acta2,Mmp2和Timp256和Hippo-Yap目标基因Ctgf57和Notch258,都是调节DKO老鼠。 这些信号通路参与inflammation-dependent加速致癌的先前的研究59。 一致的发现和前研究,我们发现DKO小鼠自发发展肝细胞癌在5个月,一个相对早期的年龄。
我们的观察也提供了一个解释人类基因变异DEPDC5乙型肝炎病毒基因可以加速/ HCV-associated肝肝纤维化等疾病14和致癌作用13,15。 乙肝病毒和丙肝病毒感染移植mTORC1通过激活PI3K-AKT信号和/或抑制TSC,随后这两种激活Rheb60,61。 基因变异抑制DEPDC5函数将上调抹布信号,这将与乙肝病毒和丙肝病毒感染,提高交互协同Rheb信号。 伴随upregulation破布和Rheb轴将导致mTORC1 hyperactivation沉淀氧化肝脏疾病,在这里描述的DKO小鼠观察。 此外,我们发现我们DKO肝脏转录组与人类的丙肝病毒和纳什转录组密切相关。 因此,我们DKO老鼠提供一种新颖的小鼠模型研究人类的角色DEPDC5加速肝脏病理变化与丙肝病毒和纳什。 然而,这里描述的DKO模型目前不涉及实际的病毒感染或病毒相关激活适应性免疫。 因此,进一步的研究应在实际环境中进行乙肝病毒和丙肝病毒感染获得更直接的我们的发现转化为相应的人类肝脏疾病。
总之,我们表明,破布和Rheb通路都是最大mTORC1激活所需的组织。 相应地,淘汰赛的两倍Tsc1和Depdc5基因引发著名upregulation mTORC1,破坏肝细胞内稳态,随后沉淀氧化损伤和随后的肝功能衰竭。 我们的工作提供了一个宝贵的模型检查的后果mTORC1 hyperactivation,理解人类肝脏病理与丙肝病毒有关,纳什和DEPDC5变化和发展治疗这种疾病治疗策略与mTORC1抑制剂或抗氧化化合物。
Depdc5/ F(EM: 10459)小鼠,源于HEPD0734_3_G10胚胎干细胞克隆,获得欧洲老鼠突变存档。Depdc5/ F老鼠培育白蛋白(铝青铜)cre生产hepatocyte-specific基因敲除小鼠。 DKO老鼠杂交所产生的Depdc5/ F和Tsc1/ F老鼠17,62,然后繁殖后代Alb-Cre老鼠。Depdc5单基因敲除实验C57BL / 6做背景。Tsc1老鼠最初产生于一个129 s4 / SvJae背景17,62但backcrossed C57BL / 6超过三代DKO实验。 尽量减少遗传和环境变化,同窝出生仔畜控制被用来在整个研究中,老鼠cohoused。 例如,Depdc5Δhep(Alb-Cre/Depdc5/ F),Depdc5/ F同窝出生的被用于Depdc5单基因敲除实验。Alb-Cre/Tsc1F / +/Depdc5F / +和Tsc1/ F/Depdc5/ F育种者产生控制(Alb-Cre消极的老鼠和Alb-Cre/Tsc1F / +/Depdc5F / +老鼠),Tsc1Δhep(Alb-Cre/Tsc1/ F/Depdc5F / +),Depdc5Δhep(Alb-Cre/Tsc1F / +/Depdc5/ F),Tsc1Δhep/Depdc5Δhep(DKOAlb-Cre/Tsc1/ F/Depdc5/ F)分析了同窝出生遗传相互作用分析。Alb-Cre/Tsc1/ F/Depdc5/ F男性和Tsc1/ F/Depdc5/ F女性产生DKO同窝出生仔畜军团药物干预实验。 老鼠保持filter-topped笼子结实的床上用品和免费访问热压处理过的常规食物/低脂肪饮食(最晚完成日期,实验室饮食5 l0d),高脂肪饮食(HFD, Bio-Serv S3282),和水,如前所述63。 时表示,新雷帕霉素(10毫克/公斤体重),tauroursodeoxycholic酸(TUDCA, 500毫克/公斤体重),防治(南京,250毫克/公斤体重)或车辆(PEG400渐变80 5%,5%; 或PBS)解决方案管理每天一次通过腹腔注射(i.p)。在过去的10天。 一种超氧化物歧化酶模拟物4-hydroxy-2 2 6 6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (Tempol 0.064%)是管理通过饮用水老鼠。 对乙酰氨基酚(APAP即400毫克/公斤体重)是通过一个单一的ip注射后12 h的禁食。 葡萄糖(葡萄糖1克/公斤)和胰岛素(0.65 U /公斤胰岛素)公差测试(GTT / ITT)是根据先前描述的过程25。 小鼠急性胰岛素反应研究异氟烷麻醉的手术平面。 首先,肝脏收集的一部分作为一个未经处理的控制。 然后0.8 U /公斤胰岛素,在PBS稀释,通过腔静脉注射静脉注射。 5分钟后,肝脏的其他部分作为来收集样本。 关于老鼠的数量、年龄、性别、饮食时间,药物剂量,路线和频率图和图显示在相应的传说。 所有动物程序伦理制度动物保健和使用委员会批准,由单位实验动物医学密歇根大学。
抗体产生了DEPDC5波科诺兔子农场&实验室使用细菌表达重组蛋白。 我们获得COL1A1 (sc - 293182), Pro-COL3A1 (sc - 166316), PECAM-1 (sc - 376764), MMP-2 (sc - 53630), MMP-3 (sc - 21732), MMP-9 (sc - 393859),液态氧(sc - 373995), MMP-13 (sc - 515284), CTGF (sc - 365970), S6K (sc - 230), eIF2α(sc - 11386), ATF4 (sc - 200和sc - 22800),和TIMP-3 (sc - 373839)抗体从圣克鲁斯生物技术、肌动蛋白(9 e10)抗体发育研究杂种细胞银行phospho-Thr389-S6K (9234), pThr172-AMPK (2535), pThr37/46-4E-BP (2855), 4 e-bp (9452), pSer51-eIF2α(3398),pThr980-PERK(3179),活跃(5683),PDI(3501),毕普(3177)、切(2895),pSer473-AKT(4060),一种蛋白激酶(4691),pSer236/239-S6(2211)和S6(2317)从细胞信号技术,α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA ab5694)抗体从Abcam和F4/80 (MF48000)抗体表达载体。 对乙酰氨基酚、南汽和Tempol来自σ,TUDCA从开曼群岛化学和雷帕霉素是从LC实验室。
肝组织缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡和苏木精和伊红染色和免疫组织化学染色(圆)),如前所述63。 总之,石蜡包埋肝脏部分与初级孵化抗体(1:10 0),其次是孵化与biotin-conjugated二级抗体(向量实验室,ba - 9200或ba - 9401; 1:200)和辣根过氧化物酶(合)共轭链霉亲和素(BD生物科学,554066; 施用)。 合活动与diaminobenzidine染色可视化。 苏木精复染色应用可视化细胞核。 α-SMA和ki - 67染色,Alexa面粉488或594 -共轭二次抗体(英杰公司)被用来可视化主要抗体染色。 末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)进行了化验使用原位检测细胞死亡Kit-TMR-Red(罗氏)。 Dihydroethidium(她)染色进行使用新鲜冷冻肝脏部分和她(热费希尔科学、D11347)曾描述25。 可视化胶原纤维,肝脏部分沾包含0.1%的饱和苦味酸天狼星红(母本,σ)。 油红O染色,OCT-embedded冷冻干,沾着新鲜肝脏部分0.5%油红O解15分钟然后用60%异丙醇冲洗。 网状染色进行使用装备研制出(25094),遵循制造商的建议。 epifluorescence-equipped光显微镜下组织学分析了样品从明治。
细胞和组织细胞溶解在radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(50毫米Tris-HCl, pH值7.4; 150毫米氯化钠; 1%的钠脱氧胆酸盐; NP-40 1%; 特里同x - 100 1%; 和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏))。 溶菌产物被离心澄清,和蛋白质浓度正常化使用Bio-rad蛋白质测定染料试剂。 蛋白溶解产物在SDS样品缓冲煮5分钟,通过SDS - page分离,转移到PVDF膜和接受免疫印迹过程。 阻塞成绩5%脱脂牛奶TBST Bio-Rad(170 - 6404)是用于膜阻塞和抗体孵化。 1 x西方封锁试剂(从罗氏11 921 673 001)在TBST用于phospho-specific主要抗体孵化。 圣克鲁斯生物技术和发展研究的主要抗体杂种细胞银行用于1:10 0,和所有其他主要抗体被用于1:1000。 HRP-conjugated二级抗体在1:20 00从Bio-Rad购买和使用。 化学发光检测使用LAS4000 (GE)系统。
血液通过心脏穿刺,通过离心分离血清。 血清化学标记与肝细胞毒性(ALT、丙氨酸aminotransaminase; AST、天冬氨酸转氨酶)或肝功能(高山,碱性磷酸酶; 治疗组总胆红素)是通过标准操作程序使用Liasys临床化学系统(AMS联盟)在体内动物实验动物医学的核心单元。
总共10µg DNAase我对总RNA,净化肝脏组织的控制(Tsc1/ F/Depdc5/ F;n= 3),Tsc1Δhep(Alb-Cre/Tsc1/ F;n= 2),Depdc5Δhep(Alb-Cre/Depdc5/ F;n= 2)和DKO(Alb-Cre/Tsc1/ F/Depdc5/ F;n= 3)小鼠,提交BGI mRNA浓缩,图书馆建设和测序(BGISeq 50 se),通过标准和加工实验和分析管道。 每个样本生产20多万干净的读取,被映射到参考基因组mm9使用明星64。 然后,袖扣是用于生成每千碱基片段记录每百万映射读取(FPKM)表65,提供补充表S1。 基因与> 0.5 FPKM值在每个数据集被用来执行相关k——聚类分析。 的数量加入RNA-seq GSE136684摘要报告数据。
和以前的描述66、基因富集分析来确定是否一个子集的基因在特定的基因簇明显的过多了。 炎症和纤维化调节基因列表是来自最近的转录组数据在人类肝脏样本HCV-associated纤维化27和非酒精性脂肪肝炎(纳什)28。 丙肝病毒的数据集、疾病progression-associated褶皱的变化差异表达基因(与study-wide意义最严格的设置; 均下调基因)进行了比较DKO全身的基因表达褶皱的变化。 氧化stress-upregulated基因列表是来自肝脏的老鼠敏锐地对待敌草快(DQ) 12 h38。 从相同的数据集,DQ-treated和Sod1淘汰赛诱导褶皱的变化差异表达基因(均下调的基因; 1 h DQ治疗)进行比较DKO全身的基因表达褶皱的变化。 ER stress-upregulated基因列表获得tunicamycin-treated小鼠胚胎成纤维细胞26。 细胞因子和趋化因子通路基因列表生成通过选择从列表中相关基因的基因的名字Ccl / Ccr分部,Cxcl/Cxcr,Il /劳工关系,干扰素/ Ifnr和肿瘤坏死因子/ Tnfr。 fibrosis-associated基因列表生成通过选择从列表中相关基因的基因的名字上校,Mmp的,Timp和Tgfb。 细胞色素P450和主要尿蛋白基因列表生成通过选择从列表中相关基因的基因的名字Cyp和不能,分别。
蛋白质免疫印迹图像被测密度术量化和表达式表示为相对带强度。 组织学图像分析光密度或荧光方法是合适的。 当表示,数据显示为±SEM。 两组之间的统计学意义使用学生的计算t以及(*P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P< 0.001; * * * *P< 0.0001)。 当多个参数进行评估,Holm-Šidak方法被用来比较组(美元P< 0.05;$ $P< 0.01;$ $ $P< 0.001;$ $ $ $P< 0.0001)。 一个双向方差分析是用来评估的影响Tsc1和Depdc5突变和评估它们之间的相互作用和协同作用(#P< 0.05;##P< 0.01;# # #P< 0.001;####P< 0.0001),而两个人之间的统计学意义组评估通过图基的多重比较测试($ $P< 0.01;$ $ $P< 0.001;$ $ $ $P< 0.0001)。 药物对身体的影响权重评估通过重复措施(RM)之间双向方差分析来评估交互处理和时间(####P< 0.0001)。 单个数据点的差异进行评估通过Sidak的多重比较测试(美元P< 0.05;$ $P< 0.01;$ $ $P< 0.001;$ $ $ $P< 0.0001)。 生存曲线比较生存率较。 统计学意义的基因浓缩在一个特定的集群使用确切概率法计算。 RNA-seq数据集之间的相关性评估通过计算非参数斯皮尔曼相关(r);P< 0.0001为所有相关的观察。 GraphPad棱镜用于所有统计分析,除了8k——聚类分析和基因富集分析,使用R执行。
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