非酒精脂肪肝(NAFLD)会导致肝细胞癌(HCC)。 然而,这种现象的潜在机制基本上仍不清楚。 在这里,我们调查的作用肿瘤抑制锌手指和同源框2 (ZHX2)在非酒精性脂肪肝,肝细胞癌的进展。 ZHX2表达显著减少脂肪肝组织,特别是在肝脏NAFLD-HCC。 ZHX2过度打扰体外培养的肝癌细胞内脂质稳态,并抑制脂质沉积在肝细胞在体外和体内。 此外,ZHX2抑制吸收外源性脂质通过转录抑制脂质脂肪酶(LPL),导致推迟肝癌细胞的增殖。 重要的是,LPL超表达显著逆转ZHX2-mediated抑制肝癌细胞增殖,异种移植肿瘤的生长、脂质沉积,自发的肝肿瘤的形成。 一致,包含IHC染色表现出负相关与LPL ZHX2 HCC队列。 ZHX2共同保护肝细胞免受异常脂质沉积在非酒精性脂肪肝LPL的转录镇压,后来阻碍细胞生长和NAFLD-HCC进展。 这些发现说明小说的非酒精性脂肪肝进展为肝癌机制。
肝细胞癌(HCC)是全世界癌症死亡的第三大主因。 大量研究表明非酒精脂肪肝(NAFLD)作为肝癌的重要触发,底层的机制仍然是难以捉摸的1,2]。 在过去的几十年中,非酒精性脂肪肝的发病率已大大增加,由于代谢综合症的明显增加,如肥胖和糖尿病3.]。 因此,迫切需要明确机制NAFLD-HCC进展对肝癌发展新的治疗策略。
在过去的几十年里,已经有稳定的分子机制研究进展的了解NAFLD-NASH-HCC进展(1,4]。 它已经建立了脂质代谢紊乱在NAFLD-HCC进展中起着重要作用[5]。 越来越多的证据表明,肿瘤抑制基因(次数)紧密调节细胞增殖和分化,以及脂质新陈代谢和非酒精性脂肪肝。 TP53次数和最频繁的一个突变基因在肝细胞癌,抑制细胞调节基因的表达来防止肿瘤发展(6]。 PTEN的肝脏特异性的缺乏,另一个著名的次数,促进肝adipocyte-specific基因的表达和脂肪生成和beta-oxidation-related基因(7),导致性脂肪肝和肝细胞癌(8]。 所有的证据强烈表明,次数是重要的非酒精性脂肪肝和肝细胞癌之间的联系。 因此,识别次数参与脂质代谢的调控将是有益的对于理解机制NAFLD-related肝细胞癌的致癌作用。
锌手指和同源框2 (ZHX2) ZHX家族的一员,已经被确认为一种HCC-associated次数(9]。 小鼠的研究表明,ZHX2负责产后HCC-related基因的镇压,法新社等GPC3,段H19 [10,11]。 ZHX2-mediated抑制法新社和GPC3转录也证实在培养的肝癌细胞(12,13]。 临床和功能数据表明,减少增强肝癌细胞生长和chemo-resistance ZHX2表达式。 机械研究发现细胞周期蛋白、细胞周期素E和凋亡的转录镇压目标ZHX2 [14,15,16]。 有趣的是,最近的研究认为ZHX2小说血浆脂质水平的监管机构,包括TG (17),表明潜在的ZHX2在脂质代谢中的作用。 然而,ZHX2的角色在非酒精性脂肪肝和NAFLD-HCC进展仍然是未知的。
在这里,我们发现ZHX2抑制吸收外源性脂质在肝细胞和抑制非酒精性脂肪肝进展的转录抑制脂质脂肪酶(LPL)表达式。 后者导致细胞生长阻滞,抑制发展的非酒精性脂肪肝,肝细胞癌。 这些发现为NAFLD-associated肝癌提供潜在的治疗靶点。
人类肝癌细胞系HepG2、Huh7 SMMC7721, QSG7701, Bel7402,强力霉素(阿霉素)全身Bel7402-ZHX2-Teton细胞株用于细胞增殖和/或集落形成试验。 荧光素酶分析被用于转录监管分析。
Bel7402-ZHX2-Teton细胞培养与阿霉素(1μg /毫升)48 h诱导ZHX2表达式。 1毫升甲醇收集细胞,彻底混合涡15 s成粒140000克的蛋白质沉淀紧随其后。 上层清液(100μl)是存储在冰箱−80°C lipidomics分析北京生物技术包装科技有限公司
临床研究协议被山东大学医学伦理委员会批准。 新鲜肝癌和配对paracancer组织收集山东省级医院。 从所有患者知情同意了。 组织微阵列包含75肝癌组织和配对paracancer组织购买从高密度芯片(上海,中国)。 LPL表达分析在组织微阵列(n= 150)由包含IHC染色或新鲜组织(n= 40)中存在。 ZHX2之间的相关性和LPL的相关性被发现在肝细胞癌组织微阵列(n= 75)和石蜡包埋新鲜肝癌组织(n= 45)。 刚收集paracancer组织(脂肪肝)或没有(non-fatty肝)空泡形成被用来检测ZHX2表达如果染色如前所述18]。
生成肝脏特异性ZHX2基因敲除小鼠,小鼠C57BL / 6 (BL6)与外显子3两侧loxP网站(天才博士布雷特·t·矛从肯塔基大学)(19]。 这些老鼠交叉与提单/ 6小鼠表达Cre重组酶由肝脏特异性白蛋白启动子(Alb-Cre)(上海生物模型中心有限公司,中国)获得杂合的液氧Zhx2与Cre重组酶等位基因。 对液氧执行进一步育种获得纯合Zhx2等位基因有或没有Alb-Cre转基因(指定为ZHX2-KO消息灵通的或ZHX2-WT)。 老鼠尾巴的dna提取活检。 基因分型的Zhx2(液氧)和Cre转基因进行使用引物(如前所述)(19]。 八周大ZHX2-KO消息灵通的(n= 6)和ZHX2-WT (n= 6)老鼠和HFD诱导非酒精性脂肪肝。
非酒精性脂肪肝小鼠模型被喂养的饮食或HFD诱导。 简单地说,8-week-old老鼠的饮食(MD12052, Medicinece,江苏,中国)4周。 前不久闹老鼠和HFD (MD12032、Medicinece、江苏、中国)12周。 每组包含6小鼠。
NAFLD-HCC是诱导如前所述20.]。 简单地说,200年μg STZ(σ)皮下注入新生儿雄性老鼠(n在出生后2天= 36)。 4周,小鼠静脉注射AAV病毒表达ZHX2 (AAV-ZHX2)或LPL (AAV-LPL) (5×1011空斑形成单位),然后再辅以HFD。 在5月,肿瘤小鼠肝脏中的节点进行了分析通过磁资源扫描。
H22细胞异种移植肿瘤在雄性BALB / c裸小鼠肿瘤生长分析(6 - 8周)。 老鼠(n= 24)被分成四组(案子,ZHX2, LPL和ZHX2 / LPL),每组至少包含五老鼠。 肿瘤大小是监控每3天。 老鼠在15天,牺牲和异种移植肿瘤被孤立和加权。
从一式三份实验数据提出了均值±SEM或者从至少三个样本平均数±标准差。 确定使用学生的意义t以及或单向方差分析。 一个p< 0.05被认为是显著的差异。
先前的报道表明,ZHX2表达减少肝细胞癌(14,15]。 有趣的是,免疫荧光(如果)(包含IHC)及免疫组织化学染色显示,ZHX2表达显著减少paracancer肝组织与空泡形成,相比之下,没有空泡形成(图1)。 与空泡形成肝组织脂质沉积的标志(21),以上结果表明,脂质调节ZHX2的表达。 为了解决这个问题,油酸(OA)或脂肪乳剂(FE)是用来治疗HepG2细胞。 如无花果所示。1 b,ZHX2表情显然是OA的mRNA和蛋白水平下降,FE-treated HepG2细胞剂量依赖性的方式。 符合在体外实验中,信使rna和蛋白质水平的ZHX2 MCD饮食,HFD-induced脂肪明显减少肝脏从脱脂饮食(NFD)与美联储老鼠(图。1 c)。 此外,ZHX2信使rna和蛋白质水平显著降低STZ-HFD NAFLD-HCC诱导小鼠的肝脏,并减少ZHX2显然是观察肝脏脂肪变性和肝细胞癌阶段(无花果。1 d, e),表明潜在ZHX2参与非酒精性脂肪肝,肝细胞癌的进展。
ZHX2表达减少lipids-treated HepG2细胞和脂肪的肝脏。一个表达人类non-fatty ZHX2肝脏标本和脂肪肝标本由包含IHC如果决定。 代表图像被显示在左侧面板。 右面板显示ZHX2阳性细胞百分比和花期ZHX2强度的标本。n= 10; * * *p< 0.001。bZHX2表达式中检测出油酸(OA)——或脂肪乳剂(FE)治疗HepG2细胞通过rt - pcr和免疫印迹。 上面板上显示的量化数据。n≥6; * *p< 0.01。 免疫印迹结果显示在较低的面板。cZHX2表达决心在脂肪肝脏从MCD饮食-或HFD-induced老鼠通过rt - pcr和免疫印迹。 ZHX2 mRNA水平的量化是显示在上面的面板。n≥4; * * *p< 0.001。 ZHX2蛋白质含量较低的面板上显示。dSTZ-HFD被用来诱导副功拜- - - - - -肝细胞癌小鼠模型。 脂肪变性和肝细胞癌的发展两个阶段NAFLD肝细胞癌)染色法测定并显示在左侧面板。 右边的面板显示了ZHX2 mRNA和蛋白表达水平与non-fatty饮食的老鼠的肝脏组织(NFD)和病理组织STZ-HFD引起的。 * *p< 0.01,* * *p< 0.001。eZHX2表达小鼠肝组织证实了包含IHC染色并在左面板显示。 右面板显示的量化ZHX2包含IHC染色。 * * *p <0.001。 数据呈现意味着±SEM,n= 6
澄清的作用ZHX2肝脂质稳态,总脂质Bel7402有或没有Dox-induced ZHX2异位表达执行lipidomics提取。 如无花果所示。2,ZHX2异位表达显著下降脂质成分,包括TG、磷脂酰胆碱(PC),和神经酰胺(Cer)。 尤其是TG明显减少总额的规范化丰富Dox-treated Bel7402-ZHX2-Teton细胞(图2 b)。 因此,异位表达ZHX2明显抑制Bel7402细胞TG积累,和可拆卸的内生ZHX2 Huh7 TG水平显著增加细胞(图。2摄氏度)。 Bodipy染色的结果,这表明细胞内脂质水平,表明ZHX2抑制脂质积累在肝癌细胞株(无花果。二维)。 这些结果进一步验证了流式细胞术分析(图。2 e(图)和荧光图像。S1A,B)。 所有结果表明ZHX2抑制性调节肝脂质稳态。
ZHX2抑制肝细胞的脂质积累和延迟NFALD的进展。一个热图的脂质代谢产物被确定质Bel7402有或没有Dox-induced ZHX2表达式。 ZHX2言论证实了免疫印迹。b归一化大量的总TG Bel7402 lipidomics数据的分析一个 n= 3; * *p <0.01。c- - - - - -e肝癌细胞株与ZHX2过度或降价处理PA诱导脂肪变性。 TG水平(c),荧光Bodipy (d)和流式细胞术(e)被用来确定脂质积累。 脂质强度的统计结果显示在右边的面板。n≥4; *p< 0.05,* *p <0.01。f肝脏特异性基因敲除的小鼠ZHX2和控制的同胞被用来诱导非酒精性脂肪肝与HFD喂养。 整个鼠标的图片代表肝脏,油红O,他走时染色显示在左侧面板。 右面板显示统计结果的TG和胆固醇水平在肝匀浆。 *p< 0.05。 数据呈现意味着±SEM,n= 6
证实了体外研究发现,Alb-cre用于删除loxP-flankedZhx2在小鼠肝细胞建立肝脏特异性ZHX2基因敲除小鼠(ZHX2-KO消息灵通的)(图。1 c)。 ZHX2-KO消息灵通的老鼠和控制同窝出生(ZHX2-WT)喂养HFD诱导非酒精性脂肪肝。 肝ZHX2缺乏对肝脏脂肪的颜色,和ZHX2-KO增加肝组织的空泡形成消息灵通的老鼠,暗示加重肝脏脂质沉积。 类似的趋势也观察到油红O染色(无花果。2 f)。 一致,肝脏TG和总胆固醇水平显著高于ZHX2-KO消息灵通的老鼠比ZHX2-WT老鼠(图。2 f)。 喂养老鼠,MCD-diet击倒ZHX2的慢病毒表达ZHX2成分显著增加肝脏脂质沉积和hepatosteatosis (Fig.S1D)。 总的来说,我们的数据表明,ZHX2抑制脂质在肝脏沉积,并改善非酒精性脂肪肝小鼠。
许多最近的报告演示的重要性外源性脂质在肿瘤细胞增殖、转移和生存22,23]。 一致,HepG2细胞增殖减少在中有1%脂肪无酸的BSA相比有10%的边后卫,和0.1%铁部分获救HepG2细胞增殖(无花果。S2)。 进一步阐明ZHX2-mediated的参与脂质沉积在其肿瘤抑制功能,Bel7402 HepG2细胞培养在低葡萄糖中最小化新创脂质合成。 图所示2 b和无花果。3a,ZHX2过度抑制肝癌细胞增殖在低葡萄糖中10%的边后卫,但ZHX2缺席时细胞的抑制作用与1%脂肪无酸的组织培养。 然而,抑制作用的ZHX2重新补充时0.1%铁(无花果。3a),这表明ZHX2的抑制作用是部分依赖外源性脂质。 来验证这一发现,Bel7402-ZHX2-Teton ZHX2-overexpressed Huh7包含VLDL低葡萄糖培养基培养,提供外源性脂质(24]。 如无花果所示。3 b对细胞增殖的抑制作用,ZHX2-mediated更为明显的在中比没有VLDL VLDL。 相反地,ZHX2击倒导致Bel7402更重要的是增强了细胞增殖和Huh7细胞培养基培养时比,没有VLDL VLDL(无花果。3 c)。 这些结果表明,外源性脂质utilization-dependent地ZHX2抑制细胞增殖。
ZHX2抑制肝癌细胞增殖的细胞通过阻断脂质吸收。 (一个)Bel7402细胞有或没有ZHX2超表达是在低葡萄糖培养基培养脂肪无酸的1% BSA或1%脂肪无酸的BSA + 0.1%的脂肪乳剂评估细胞增殖。 Bel7402和Huh7细胞ZHX2超表达(b)或击倒(c)在低葡萄糖中有或没有VLDL培养。 细胞增殖是由CCK8评估试验设备。dDil-VLDL Huh7细胞的过度治疗EGFP-tagged ZHX2。 ZHX2本地化和VLDL强度被代表显示图像。eBel7402 Huh7细胞过度或击倒ZHX2 Dil-VLDL处理。 Dil-VLDL强度被流式细胞术进行访问。fHuh7细胞ZHX2过度或降价处理VLDL水平测量游离脂肪酸(远期运费协议)和ATP。 *p< 0.05,* *p< 0.01。 数据呈现意味着±SEM,n≥3
进一步验证ZHX2的角色限制吸收外源性脂质和抑制细胞增殖,Dil-labeled VLDL受雇Huh7外源性脂质吸收的追踪。 荧光图像显示,荧光强度的Dil-VLDL弱于ZHX2-postive细胞与ZHX2-negative Huh7细胞(图。3 d和无花果。2摄氏度)。 这是进一步证实Bel7402和Huh7细胞操纵ZHX2表达式。 流式细胞仪和荧光图像显示,过度的ZHX2抑制Dil-VLDL吸收和击倒ZHX2增加Dil-VLDL吸收(无花果。3 e和无花果。二维)。 更重要的是,VLDL导致增加游离脂肪酸(远期运费协议)和ATP Huh7细胞,细胞增殖,这两者都是重要的参考资料。 超表达ZHX2抑制VLDL-induced增加远期运费协议和ATP,虽然击倒ZHX2 VLDL-induced增加增加远期运费协议和ATP Bel7402(无花果。3 f)。 综上所述,所有的数据表明,ZHX2块肝细胞脂质吸收,从而抑制细胞增殖。
识别潜在ZHX2目标调节肝脂质稳态,rt - pcr用于屏幕上著名的脂质稳态相关基因。 如无花果所示。4在Bel7402-ZHX2-Teton细胞,LPL表达明显降低。 这个结果在Bel7402证实,HepG2, QSG7701, SMMC7721细胞与ZHX2过度或击倒(无花果。4 b)。 ZHX2是转录监管机构(9),我们假设ZHX2可能压制LPL表达在转录水平。 为了验证这个假说,荧光素酶的记者进行了分析。 显著的异位表达ZHX2压抑LPL活性启动子(-1678 + 67元),和可拆卸的内生ZHX2明显激活LPL启动子(无花果。4摄氏度)。 值得注意的是,ZHX2抑制剂量依赖性的方式(图LPL子活动。4 d)。
ZHX2 LPL启动子结合抑制ZHX2表达在转录水平。一个Bel7402细胞脂质稳态相关基因筛选有或没有Dox-induced ZHX2通过rt - pcr超表达。n= 3; *p <0.05,* *p <0.01。bLPL表达决心与ZHX2 Bel7402和HepG2细胞过度或QSG7701 SMMC7721细胞ZHX2击倒rt - pcr和免疫印迹。c荧光素酶的活性pGL3-LPLp测量与ZHX2 Bel7402和HepG2细胞过度或QSG7701 SMMC7721细胞ZHX2击倒。dLPL发起人记者向量与增加大量ZHX2 co-transfected HepG2细胞表达载体测量LPL启动子活动。e一系列LPL启动子被截断,然后用ZHX2 co-transfected表达载体SMMC7721荧光素酶检测。f从Bel7402-ZHX2-teton细胞基因组DNA片段被推倒利用anti-HA抗体,然后使用特定的引物针对−96*qPCR + 67元。n= 4; *p <0.05,* *p <0.01
识别回应ZHX2 LPL发起人的核心区域,一系列的截断LPL发起人记者质粒构建。 瞬态co-transfection紧随其后的荧光素酶报告实验表明,截断LPL发起人保留响应ZHX2直到96−−38元被删除,这表明ZHX2转录调节通过地区96−−LPL在其启动子(图38元。4 e)。 此外,芯片分析进一步证实了招聘ZHX2 LPL的启动子。 如无花果所示。4 f在该地区,ZHX2极大地丰富(96−+ 67元)LPL子当Bel7402-ZHX2-Teton被强力霉素诱导。 因此,ZHX2转录压制LPL表达通过绑定,直接或间接,LPL的启动子区域。
在非酒精性脂肪肝进展评估LPL的角色,Dil-VLDL被用来治疗肝癌细胞与LPL操纵。 如无花果所示。5异位表达LPL Dil-VLDL吸收的增加,而击倒内生LPL在Huh7 Dil-VLDL细胞吸收减少,表明LPL的参与脂蛋白的吸收。 这一结果进一步证实了流式细胞术(无花果。5 b)。 此外,体内研究表明,肝脏特异性过度LPL在小鼠肝脏TG和胆固醇水平上升,促进了非酒精性脂肪肝进展(图。S3)。 我们的研究结果与最近的一项研究报告,LPL同时绑定到脂蛋白和细胞表面蛋白,导致摄取脂蛋白(25]。
LPL抑制外源性脂质吸收和肝癌细胞的细胞增殖。一个Dil-VLDL积累在Huh7细胞过度或ZHX2击倒。n= 4; * * *p< 0.001。b流式细胞仪是用于分析Dil-VLDL吸收与ZHX2 Huh7细胞过度或击倒。n= 3; *p <0.05,* *p <0.01。c,dSMMC7721 HepG2细胞与LPL过度或可拆卸的被用来测量细胞增殖(c和集落形成d)。n≥4; *p <0.05,* * *p <0.001。e在肝细胞癌组LPL表达进行了研究。 代表包含IHC LPL染色的组织微阵列图像被显示在左侧面板。 LPL mRNA水平的统计数据在20双样本显示在右边的面板。 *p <0.05。f高水平的LPL与贫穷有关364名肝癌患者的总体生存公里情节数据库
调查LPL在肝癌发展的作用,在肝癌细胞株细胞增殖测定调制LPL表达。 如无花果所示。5 c, dLPL的超表达显著增加肝癌细胞增殖和集落形成,而击倒LPL明显抑制肝癌细胞增殖和集落形成。 此外,LPL表达,在mRNA和蛋白水平,明显高于在肝癌组织中与paracancers(无花果。5 e和表S1)。 和LPL表达的水平阶段III / IV的肝癌HCC I / II(高于阶段表S2)。 一致,公里绘图仪分析(www.kmplot.com)呈负相关,LPL表达与肝细胞癌患者的总生存期(图。5 f)[26]。 综上所述,这些数据表明,转录ZHX2的目标,LPL不仅介导脂质吸收肝癌细胞系,但也促进肝细胞癌肿瘤的生长。
定义角色ZHX2-inhibited LPL的脂质沉积,肝癌细胞的脂质含量是衡量治疗外源性脂质。 正如预期的那样,ZHX2 Dil-VLDL吸收减少,而异位表达LPL废除了吸收的抑制ZHX2 Dil-VLDL Bel7402(无花果。6)。 相反地,可拆卸的内生LPL明显逆转ZHX2 knockdown-enhanced Dil-VLDL Huh7细胞吸收(无花果。6 b)。 此外,LPL超表达改善ZHX2-decreased TG Bel7402细胞中积累(无花果。6摄氏度)。 综上所述,所有的数据表明,ZHX2抑制肝癌细胞的脂质积累压抑LPL表达。
ZHX2压抑LPL表达抑制非酒精性脂肪肝的发展。一个,bDil-VLDL积累Huh7和Bel7402细胞转染后表明质粒。n= 4; * * *p <0.001。c总TG水平测定在Bel7402细胞ZHX2和LPL超表达,同时或单独。n= 4; * *p <0.01。dAAV-ZHX2和AAV-LPL注入老鼠通过同时或单独尾静脉。 然后老鼠和HFD引起脂肪肝。 代表图像的老鼠的肝脏,他走时,油红O染色显示。e小鼠肝组织收集和均质测量水平的TG和总胆固醇。n= 6; *p <0.05
LPL在ZHX2-mediated非酒精性脂肪肝是进一步研究使用小鼠模型的缺陷。 因此,老鼠注射AAV-ZHX2和/或AAV-LPL通过尾静脉,然后再辅以HFD。 如无花果所示。6 d,他走时,油红O染色证明ZHX2超表达显著抑制肝脏脂质沉积和维护正常肝结构,显著抑制了LPL的过度。 此外,ZHX2过度降低肝脏TG和胆固醇的水平,同时异位LPL表达逆转ZHX2-decreased TG和胆固醇在肝脏同质化(无花果。6 e)。 类似的结果也取得了与ZHX2 MCD-diet喂老鼠和/或LPL表达(图3 b)。 这些结果表明,ZHX2抑制脂质沉积在肝脏和阻碍了非酒精性脂肪肝的发展通过抑制LPL表达。
自从ZHX2消极与LPL有关,我们假设ZHX2可能发挥其通过镇压LPL肝癌抑制功能。 因此,细胞增殖测定肝癌细胞与操纵ZHX2和LPL的表情。 数字7一个表明ZHX2抑制细胞增殖,LPL过度扭转ZHX2的抑制作用。 相反地,ZHX2击倒显著促进细胞生长,显著逆转了LPL击倒Huh7 Bel7402细胞(无花果。7 b)。 此外,ZHX2过度抑制异种移植肿瘤的生长,而LPL的异位表达增强的肿瘤生长,明显逆转ZHX2-inhibited异种移植肿瘤的生长(图7 c)。 增殖细胞核抗原证实LPL的影响的西方墨点法ZHX2-mediated抑制细胞增殖(无花果。7 d)。
ZHX2压抑LPL抑制细胞增殖和肿瘤生长。 HepG2细胞增殖测定,Huh7, SMMC7721和QSG7701细胞过度ZHX2和LPL (一个)和Bel7402细胞Huh7击倒ZHX2和LPL (b),使用CCK8化验设备。n≥3; *p <0.05。c,dH22细胞皮下注射到裸鼠异种移植瘤。 后来,ZHX2和LPL表达向量在异种移植肿瘤,注入每两天同时或单独。 图片、重量和异种移植肿瘤的生长曲线的影响来说明ZHX2致癌作用和LPL表达(c)。n≥5; *p <0.05,* *p <0.01。 ZHX2和LPL表达和细胞增殖细胞核抗原免疫印迹测定标志。 代表印迹显示来自异种移植实验(d)。eC57BL / 6小鼠注射AAV-GFP, AAV-ZHX2 AAV-LPL, AAV-ZHX2 + AAV-LPL通过尾静脉,然后用来诱导的小鼠肝肿瘤STZ-HFD。 肿瘤节点对老鼠的生活被确定通过磁资源使用3.0 T核磁共振成像(左面板)。 在实验中,小鼠安乐死来计算数量的肿瘤肝脏中的节点(右面板)。 意味着±SEM,n= 3; *p <0.05
旨在进一步建立ZHX2的概念/ LPL NAFLD-HCC发展轴,ZHX2 (AAV-ZHX2)和LPL (AAV-LPL)引入STZ-HFD小鼠分别或同时进行。 正如所料,在老鼠身上注射AAV-ZHX2肿瘤的节点数量明显减少与控制老鼠相比,表明ZHX2抑制非酒精性脂肪肝,肝细胞癌的进展。 值得注意的是,LPL过度引起AAV-LPL不仅增加了肿瘤的节点数量也逆转ZHX2在肿瘤形成的抑制作用STZ-HFD老鼠(图。7 e)。 这些结果也支持Ki67的包含IHC染色。 ZHX2过度降低Ki67+细胞,异位LPL Ki67升高+肿瘤细胞和恢复Ki67表达ZHX2肿瘤细胞(图3 c)。 总的来说,以上数据表明ZHX2阻碍NAFLD-HCC进展通过抑制LPL表达。
为了进一步验证的参与ZHX2 / LPL轴在人类肝细胞癌组织,包含IHC染色ZHX2, LPL进行使用串行部分肝细胞癌组织。 符合我们以前的报告(15)表达水平的ZHX2阶段III / IV的肝癌HCC I / II(低于阶段表S3)。 有趣的是,co-IF染色显示paracancer ZHX2核表达较高的组织显示LPL水平较低。 相反,较低的癌症组织ZHX2表达水平更高的LPL(无花果。8)。 在120肝癌标本,积极ZHX2和LPL染色被发现在54.2%(65 120)和65%(78 120)的肿瘤,分别。 统计分析揭示了总共ZHX2之间显著负相关和LPL表达标本,阶段HCC I / II和III / IV(无花果。8 b)。 此外,ZHX2截短蛋白ZHX2(242 - 446),其中包含HD1和HD2核本地化信号(NLS) [15在蛋白质含量,抑制LPL表达。 虽然ZHX2(242 - 439),其中包含HD1, HD2 NLS [15),没有影响LPL表达(图3 d)。 此外,肝细胞癌患者的生存分析显示高ZHX2但低LPL的患者有更好的预后生存,而且患者低ZHX2但高LPL穷得多的总生存期(图。8 c)。 因此,我们的结果表明,ZHX2 LPL表达肝细胞癌,负相关和高ZHX2表达有利于肝细胞癌患者的生存。
ZHX2-LPL轴代表负关联控制肝癌进展。一个Co-IF染色LPL和ZHX2配对HCC组织。 代表图像paracancer组织(上半部分)和癌组织(下图)所示。b统计分析ZHX2和LPL相关的肝细胞癌的不同阶段组织。c肝癌患者按高ZHX2 &低LPL和低分组ZHX2 &高LPL和整体生存的两组使用Logrank分析进行了分析。d图解模型描述ZHX2抑制LPL表达在转录水平,进而降低LPL-mediated脂质吸收,抑制非酒精性脂肪肝和细胞增殖,因此妨碍了肝癌进展
肝脏在脂质稳态中起着核心作用。 非酒精性脂肪肝和肝细胞癌都是脂质代谢disorder-associated肝脏疾病(1,5),增加肝细胞的脂质积累(主要原因27]。 据报道,一些基因的表达改变编码FATPs, CD36 SREBP1, PPARγ可能影响脂质积累在肝细胞(28]。 然而,关键的监管机构负责异常肝脂质积累在NAFLD-HCC在很大程度上是未知的。 在这里,我们表明,ZHX2表达降低脂肪肝组织和改变ZHX2干扰脂质以及肝细胞内稳态NAFLD-HCC进展。 我们最好的知识,这是第一个研究揭示的关键角色ZHX2肝脏脂质沉积和NAFLD-HCC进展。 我们的研究结果强调,ZHX2是至关重要的监管机构对正常和恶性肝细胞脂质稳态。
许多研究包括我们的演示ZHX2作为HCC-associated肿瘤抑制(9,12,15,29]。 ZHX2抑制肝癌生长通过抑制肝细胞癌生物标志物(法新社、GPC3和段H19)和细胞周期基因(细胞周期蛋白和细胞周期素E) (12,13,15]。 最近的研究报道,ZHX2调节血浆脂质稳态(17),表明潜在ZHX2参与脂质代谢及相关疾病,如非酒精性脂肪肝和肝细胞癌。 然而,直到现在,ZHX2在非酒精性脂肪肝和肝细胞癌的确切作用是未知的。 在目前的研究中,我们已经证明,抑制肝脏脂质积累和保护小鼠免受MCD和HFD诱导非酒精性脂肪肝(无花果。1和2)。 脂质在肿瘤生物学中发挥着重要作用,包括能源供应、细胞信号转导和细胞膜形成(30.]。 我们的数据表明,ZHX2控制外源性脂质吸收在肝癌细胞中,因此有限的能源资源的肝癌细胞抑制其增殖(无花果。3.)。 此外,体内数据显示ZHX2明显抑制NAFLD-HCC进展STZ-HFD小鼠模型(无花果。7)。 越来越多的证据表明,高增生性肿瘤细胞增加吸收外源性脂质(31]。 针对脂肪酸转运CD36几乎完全抑制肿瘤转移小鼠模型(22]。 我们的发现表明ZHX2阻断外源性脂质吸收是一个有用的目标在肝细胞癌。 众所周知,新创脂质合成对肿瘤细胞至关重要,以满足高增生性要求[30.]。 目前尚不清楚ZHX2抑制新创脂质合成发挥其在肝细胞癌肿瘤抑制功能,将感兴趣的研究方向。
LPL是脂质代谢的关键酶,是合成主要在脂肪组织,骨骼肌,乳腺(22]。 LPL调节脂质代谢主要通过两种方式。 一方面,LPL催化水解的TG、乳糜微粒和VLDL的主要成分25]。 另一方面,非LPL参与脂蛋白的吸收功能通过其功能性配合HSPG遗迹,低密度脂蛋白受体和VLDL受体(25,32]。 肝细胞,LPL在胎儿肝脏合成,然后转暗出生后不久(25),类似于法新社的表达模式,这是首次发现ZHX2和促进肝癌发展的目标12,33]。 在这里,我们已经确定了LPL的小说ZHX2(图的目标。4)。 这符合观测早些时候LPL表达增加在BALB / cJ突变的老鼠Zhx2基因和转基因和减少Zhx2(17]。
LPL扮演重要的角色在脂质代谢和相关疾病。 LPL不足导致高脂血症(34,35]。 最近的研究报道,LPL促进乳腺癌细胞生长和生存23]。 然而,它的功能在肝癌仍不清楚。 在这项研究中,我们发现LPL增强外源性脂质吸收,促使肝癌细胞的增殖和消极与生存相关的病人(图。5)。 所有这些数据确定LPL在肝癌发展的至关重要的作用。 应该还强调,ZHX2抑制外源性脂质吸收并通过抑制NAFLD-HCC进展LPL(无花果。6和7)。 这是支持的临床数据,显示低ZHX2但高LPL表达有一个贫穷的整体存活率比那些高ZHX2但LPL水平低(图。8)。 因此,ZHX2-LPL轴已经成为小说NAFLD-HCC发展的监管机制。 值得注意的是,我们不能排除LPL在肝癌发展的催化功能。 LPL催化功能是否还在肝癌发展中发挥作用还不清楚。 这将是未来感兴趣的调查研究。
总之,ZHX2转录压制LPL表达,随后抑制外源性肝细胞的脂质吸收。 本研究建立了ZHX2-LPL轴保持hepatocytic脂质稳态,阻碍了非酒精性脂肪肝发展和NAFLD-HCC进展,抑制肝细胞癌肿瘤的生长。 我们的发现不仅在NAFLD-HCC进展的机制提供新的见解,但也促进小说NAFLD-associated HCC治疗策略管理。
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