摘要
由于慢性炎症与动脉粥样硬化的发病机理有关，因此炎症细胞因子可能有助于血管平滑肌细胞（VSMC）的表型调节。肿瘤坏死因子α（TNFα）促进了收缩性VSMCs向合成表型的转化，这通过标记蛋白的表达和胶原蛋白凝胶收缩测定来确定。蛋白质印迹分析和环氧合酶2（COX2）启动子测定表明，TNFα刺激导致了COX2的诱导。COX2的过度表达，沉默或药理学抑制作用显着影响TNFα诱导的表型转化，而所测试的前列腺素仅PGD 2显着诱导表型转化。ERK被PGD 2显着激活刺激和ERK的药理抑制作用阻止了PGD 2诱导的VSMC表型转化。但是，PGD 2受体的拮抗剂或激动剂不会影响VSMC转化。与此相反，自发脱水形式的PGD 2，如PGJ 2，Δ 12 -PGJ 2，和15-d-PGJ 2，强烈诱导表型转化。记者基因检测表明，TNFα，PGD 2和15-d-PGJ 2显着激活了过氧化物酶体增殖物应答元件（PPRE）启动子。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARδ）的过表达或沉默显着影响了15-d-PGJ2-诱导的表型转化。最后，缺乏TNFα的小鼠的动脉粥样硬化新内膜形成被显着抑制。另外，喂食塞来昔布的小鼠表现出对颈动脉结扎诱导的新内膜形成的完全抑制。这项研究表明，PGD 2通过产生内源性PPAR配体来调节VSMC的表型转化，并导致闭塞性动脉疾病中新内膜的形成。
动脉粥样硬化是在西方国家猝死的主要主要原因1，动脉粥样硬化和的发病机制与来自脂蛋白，免疫细胞，和周围组织，如内皮细胞和动脉壁的内侧的层之间的相互作用引起的慢性炎症相关联。此外，单核细胞向血管壁的迁移代表了动脉粥样硬化斑块发展的初始阶段2。此后，这些单核细胞分化为巨噬细胞，其摄取氧化的低密度脂蛋白（ox-LDL）以产生脂肪条纹3。除了形成脂肪条纹外，血管平滑肌细胞（VSMC）迅速增殖并迁移到动脉壁病变中，在那里它们合成并分泌细胞外基质蛋白以形成斑块1的纤维帽。
血管平滑肌细胞参与各种血管生理机能，如血管收缩，血管紧张度，血压，和血流。在成熟的血管中，VSMC的增殖停止，并且特异性蛋白如肌球蛋白重链（MHC），肌球蛋白轻链激酶（MLCK），钙蛋白，转凝蛋白2（SM22α）和离子通道的表达高度升高。与心脏或骨骼肌细胞不同，VSMC保留其表型可塑性。例如，血管平滑肌细胞的收缩经历响应于环境线索可逆的表型变化和最终获得的能力增殖和执行其收缩功能4。这样的表型的转化率和血管平滑肌细胞的增殖，血管疾病，如动脉粥样硬化，动脉硬化和血管老化观察5。最近，血小板衍生的生长因子（PDGF），胰岛素样生长因子-1（IGF-1），和层粘连蛋白的报道作为调节VSMC表型环境线索6，7，8。然而，尚未阐明在患病状态下VSMCs表型转化的机制。
许多证据支持动脉粥样硬化是慢性炎症的结果。实际上，先天和适应性免疫系统，如单核细胞，巨噬细胞，树突细胞（DC）的细胞，B和T细胞，和肥大细胞，在粥样硬化斑块中发现9，10。慢性炎症与病变进展密切相关，病变的特征是VSMC穿过内部弹性膜迁移到内膜或内皮下区域1。此外，在此阶段病变的发展受单核细胞/巨噬细胞和T细胞11相互作用的炎症细胞因子的影响。
在动脉粥样硬化进展期间，炎性细胞因子（如白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα））参与血管重塑。例如，IL-1β抑制不足粥样硬化和向外血管重塑在鼠模型的进展12，13，14。特别是，血管重塑是由TNFα调节的，据报道在TNFα/ ApoE双敲除小鼠的血管壁厚度在动脉粥样硬化的后期较薄[ 15]。此外，已经报道，动脉粥样硬化病变中TNFα/ ApoE基因双敲除的小鼠小16，17。因此，在动脉粥样硬化的发展过程中，TNFα似乎是重要的炎性细胞因子。
还已经报道了TNFα可诱导环加氧酶2（COX2）在各种细胞类型，例如肾外髓细胞，背根神经节细胞，癌细胞，子宫内膜细胞的表达，和软骨细胞18，19，20，21，22，和COX2的由TNFα诱导起着血管平滑肌细胞增殖中起关键作用23。COX调节血栓烷A 2（TXA 2）和前列腺素，例如前列腺素D 2（PGD 2），前列腺素I 2（PGI 2），前列腺素E 2（PGE ）的生产的限速步骤2）和前列腺素F2α（PGF2α）24。此外，前列腺素对血管平滑肌细胞有多种作用。例如，它们诱导的收缩，松弛，和增殖25，26，27，28。特别地，PGD 2被代谢以产生另外的炎性细胞因子，如前列腺素Ĵ 2（PGJ 2），Δ 12 -前列腺素Ĵ 2（Δ 12 -PGJ 2），15-脱氧Δ 12,14 -前列腺素Ĵ 2（ 15-d-PGJ 2），Δ 12前列腺素d 2（Δ 12 -PGD 2）和13,14-二氢-15-酮基PGD 2（DK-PGD 2）29，30 ; 这些代谢物的，PGJ 2前列腺素已知是过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）的内源性配体31，32。
PPARs是核受体超家族，包括PPARα，PPARδ，及PPARγ的成员33，和PPARs的已经报道，在血管中发挥不同的作用。例如，据报道，PPARγ的平滑肌特异性过表达抑制了平滑肌标志物基因的表达34，在血管病变形成过程中PPARδ被上调，其过表达增强了VSMC的增殖35。因此，脉管系统中PPAR的潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们研究了决定VSMC表型转换的关键炎症细胞因子，并试图确定炎症细胞因子介导的信号通路的分子机制。
缺乏TNFα的小鼠（TNFα -/-，B6.129S- Tnf tm1Gkl / J小鼠）和ApoE（ApoE- / -，C57B6.129P2- Apoe tm1Unc / J小鼠）购自杰克逊实验室（美国缅因州巴港） ）。TNFα -/-小鼠与ApoE缺陷型小鼠（ApoE -/-）杂交，在两个基因座上均产生杂合子。将TNFα +/- ApoE -/-小鼠交叉产生TNFα + / + ApoE -/-和TNFα -/-ApoE -/-同窝仔。在无特定病原体的条件下饲养动物。所有动物程序均按照我们的动物研究机构指南进行，并得到我们机构动物护理和使用委员会的批准（PNU-2016-1195）。该调查符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物的护理和使用指南》（NIH出版物85-23，1996年修订）。
通过使用组织植入法从4周龄雄性Sprague-Dawley大鼠中分离VSMC。简而言之，通过静脉内注射氯胺酮（100 mg / kg）使大鼠安乐死，并用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注5分钟。无菌隔离胸主动脉，丢弃周围的脂肪和结缔组织。纵向切开血管，并用剃须刀刮擦管腔侧面以除去内膜。将血管切成3–5毫米长，将管腔侧面向下移植到胶原蛋白包被的培养皿上。移植后七天，丢弃组织碎片，并收集发芽的VSMC（称为P0期VSMC）。
为了制备收缩性VSMC，P0期VSMC如前所述8进行了区分。VSMC的分化已通过蛋白质印迹法检测了SMC标记蛋白，即MHC，MLCK，SM22α，钙蛋白和平滑肌肌动蛋白（SMA）。收缩性VSMC用含有指定炎症细胞因子的培养基培养4天。为了检查PPARδ过表达对表型转化的促进作用，将细胞与所示的细胞因子孵育2天。
对于免疫细胞化学，将细胞用冰冷的PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定10分钟。将细胞用0.2％Triton X-100透化，与所示的一抗孵育1小时，然后用Cy3或Alexa Fluor 488偶联的二抗处理30分钟。将样品用抗褪色剂（80％甘油/ PBS溶液中的2％没食子酸正丙酯）固定，并使用共聚焦显微镜（FV1000-ZDC，Olympus，日本东京）获得图像。
细胞裂解液在还原条件下在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，通过使用所示的第一抗体和结合IRDye的第二抗体（Li-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）进行免疫印迹。蛋白质印迹是通过使用Odyssey系统（Li-COR Biosciences）开发的。
通过胰蛋白酶消化分离VSMC，并重悬于无血清DMEM（1×10 6 细胞/ ml）。将细胞悬液在冰上与胶原蛋白凝胶溶液（8 mg / ml I型2x PBS中的胶原蛋白，pH 8.0）混合，得到5×10 5 细胞/ ml和4 mg / ml胶原蛋白凝胶溶液。将一百微升VSMC-胶原蛋白凝胶混合物添加到12孔板中，然后在37°C下孵育30分钟以实现聚合。然后将凝胶浮在无血清DMEM中5 h，然后加入血管紧张素II（AngII，1μM）引发收缩，同时使用数字电荷耦合器件照相机捕获图像。胶原凝胶的收缩定义为凝胶面积的减少，如通过Scion Image软件（Scion Corporation，Frederick，MD的补品；http://www.scioncorp.com）。通过将面积除以初始面积获得相对凝胶面积。
pGL3-SMA和pGL3-SM22α由弗吉尼亚大学的Gary K. Owens博士友情提供。如前所述8制备了pGL3-myocardin 。pGL3-PPRE和pCDNA3.1-PPARδ由Jang Hyun Choi博士（UNIST，韩国蔚山）提供。将人COX2 cDNA亚克隆到BamHI / EcoRI中pMIGR2载体的位点。为了评估启动子活性，我们使用了双重荧光素酶报告基因检测系统。将VSMC接种在12孔板中，并通过使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）与荧光素酶报道基因构建体和海肾荧光素酶质粒共转染。每个孔包含0.88μg的荧光素酶报告质粒，0.8μg的表达载体和80ng的海肾荧光素酶质粒。转染后7小时，用新鲜培养基替换培养基，将细胞裂解，并在转染后24小时测定荧光素酶活性。通过使用Glomax TM 20/20发光计（Promega，WI，USA）分析蛋白质提取物（20μl ）。
要使COX2和PPARδ静音，shCOX2（5'-CCG GTG CAA GCC CTT CAG TGA CAT CAC（5'-CCG GTA AGA CAG ATC AGA AGC GAG GAC TCG AGT CCT CGC TTC TGA TCT GTC TTT TTT TG-3'） TCG AGT GAT GTC ACT GAA GGG CTT GCT TTT TG-3'）寡核苷酸被设计成在5'末端有一个AgeI位点，在3'末端有一个EcoRI位点，然后合成了有义和反义寡核苷酸（XENOTECH，韩国大田）。混合两个互补的寡核苷酸，在98°C加热5分钟，然后冷却至室温。将退火的核苷酸亚克隆到pLKO.1慢病毒载体的AgeI / EcoRI位点。
对于基因沉默，HEK293-FT包装细胞（Invitrogen）在六孔板中生长至约70％融合。通过使用磷酸钙方法用6μgpLKO.1慢病毒构建体，1μgΔ8.9和1μgpVSV-G对细胞进行三重转染。转染后8小时，用新鲜培养基替换培养基。转染后24小时收获慢病毒上清液，并通过0.45-μm过滤器。在存在8μg/ ml聚丙烯（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）的情况下，使用无细胞病毒培养物上清液感染收缩性VSMC。转染后48和72小时进行另外几轮感染。通过使用10μg/ ml嘌呤霉素筛选2天来分离感染的细胞。
为了诱导新内膜形成，将雄性小鼠（6周龄）的左颈总动脉结扎在分叉附近，并在4周后，分离左和右颈总动脉。为了用塞来昔布治疗小鼠，在结扎前给小鼠喂食含1500ppm塞来昔布的D12450B饮食（中央实验室动物公司，首尔），再结扎2周，并给喂含塞来昔布的饮食另外4周。通过给雄性小鼠（8周龄）喂食高脂肪的西式饮食（胆固醇为1.25％）来诱导动脉粥样硬化（研究饮食，D12108），持续15周。杀死后，给小鼠灌注PBS，将分离的颈动脉和主动脉在4°C的4％多聚甲醛中固定过夜，并包埋在石蜡中进行免疫组化。每个块的五微米切片用H＆E或指定的一抗染色。通过使用MIRAX MIDI多功能数字幻灯片扫描仪（卡尔·蔡司，耶拿，德国）或通过共聚焦显微镜（奥林巴斯）对染色进行可视化。对于油红O染色，将主动脉组织用油红O溶液（0.5％的异丙醇溶液）染色2小时，并用蒸馏水洗涤四次。为了定量，用异丙醇（1 ml）萃取油红O，并在518 nm处测量吸光度。5％的异丙醇溶液中）2小时，并用蒸馏水洗涤四次。为了定量，用异丙醇（1 ml）萃取油红O，并在518 nm处测量吸光度。5％的异丙醇溶液中）2小时，并用蒸馏水洗涤四次。为了定量，用异丙醇（1 ml）萃取油红O，并在518 nm处测量吸光度。
绘制数据并使用GraphPad Prism进行分析。未配对的学生t检验（两条尾巴）用于确定组间差异的显着性。通过方差分析（单向方差分析）和Tukey的多重比较检验来分析多组数据。结果表示为平均值±SEM，P值小于0.05被认为是显着的。
由于主动脉组织碎片在胶原蛋白涂层板上植入后VSMC萌发表明合成表型，因此我们采用了先前描述的分化方案8。如图1a，b所示，在层粘连蛋白涂层的平板上电镀VSMC会引发分化。P0级VSMC对AngII刺激无反应，而P4级VSMC对AngII刺激迅速收缩（图1c）。但是，已建立的细胞系（例如A10细胞）的分化并未导致响应AngII刺激而收缩（补充图S1）。用TNFα治疗收缩性VSMC（P4期）会显着降低SMC标记蛋白的表达（图1d，e）和心肌素，SMA和SM22α的启动子活性（补充图S2）。此外，TNFα治疗导致AngII依赖性收缩的丧失（图1f）。
从大鼠主动脉组织碎片中分离出的合成VSMC移植到层粘连蛋白包被的平板上。在指定的传代通过蛋白质印迹分析（a）或免疫细胞化学（b）评估收缩标志物基因的表达。放大倍数40倍。酒吧，100微米。c将每次传代的细胞包埋在胶原凝胶珠中，并用AngII刺激。缩时拍摄的图像以数字方式记录，并且收缩率表示为初始面积的百分比（n = 3）。* P 与未治疗（NT）组相比，<0.05。ns，不重要。在指定剂量下，用TNFα刺激P4期VSMC 4天，并通过Western blot分析（d）和免疫细胞化学（e）评估收缩标志物基因的表达。放大倍数40倍。f用TNFα刺激收缩性VSMC 4天，并如上所述分析AngII诱导的胶原凝胶收缩（n = 3）。* 与未治疗（NT）组相比，P <0.05。ns不重要。结果表示为平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较测试用于确定P值。星号表示统计意义（P <0.05）。
在VSMC从合成表型向收缩表型分化过程中，COX2表达显着降低（补充图S3a），而用TNFα刺激收缩型VSMCs诱导了COX2的诱导（图2a，b）。另外，用TNFα刺激VSMC强烈地增强了COX2的启动子活性（图2c）。此外，异位COX2表达显着降低了标记蛋白（例如SMA和SM22α）的表达以及SM22α的启动子活性（图2d，e）。此外，塞来昔布（10μM）对COX2的药理抑制作用显着抑制了TNFα诱导的收缩性VSMC的表型转化（图2f）。）。COX2的沉默使TNFα诱导的收缩性VSMC的表型转化变钝，并保留了收缩表型标记蛋白的表达和AngII依赖性收缩（图2g，h，补充图S3b）。
用TNFα刺激P4期VSMC 4天，并通过western印迹分析（a）和免疫细胞化学（b）评估COX2和收缩标记基因的表达水平。放大倍数40倍。酒吧，100微米。c将COX2启动子亚克隆到pGL3载体中，并转染到P4期VSMC中（n = 3）。如“材料和方法”一节所述评估TNFα诱导的COX2启动子的活化。COX2在P4期VSMC中异位表达，并检测了COX2，SMA和SM22α（d）和SM22α启动子活性（e）的表达水平（n = 3）。F用选择性COX2抑制剂（celecoxib）预处理P4期VSMC，并检查TNFα依赖性基因表达的变化。在P4期VSMC中沉默COX2，并评估TNFα依赖性基因表达（g）和收缩力丧失（n = 3）（h）。 与未治疗组相比，* P <0.05。ns不重要。结果表示为平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较测试用于确定P值。星号表示统计显着性（P <0.05）。
由于COX2在前列腺素合成的限速步骤中起关键作用，因此我们研究了前列腺素对SMC标记蛋白表达的影响。PGD 2（10μM）刺激收缩性VSMCs 显着下调SMC标记蛋白的表达，而其他前列腺素则无作用（图3a，补充图S4a，b）。此外，PGD 2刺激收缩性VSMCs 消除了AngII依赖性收缩（图3b）。用PGD 2刺激收缩性VSMCs以时间依赖性方式显着激活ERK信号通路（补充图S4c），并抑制ERK钝化PGD2-诱导的VSMC表型改变（图3c）。DP 1和DP 2分别与G s和G i耦合，调节cAMP的产生，已知是PGD 2受体36。然而，收缩血管平滑肌细胞的治疗与PGD 2，一个DP 1个受体激动剂（BW245C，10μM）或DP 2激动剂（DK-PGD 2，10μM）不改变cAMP产生（补充图S5a中-d ）。此外，在合成或收缩VSMC中均未观察到DP 1和DP 2的表达（补充图。S5e）。PGD 2不会诱导钙动员，这是由Gq和磷脂酶C-β 的激活介导的（补充图S5f–h）。由于ERK信号通路对于依赖PGD 2的SMC标记基因表达抑制非常重要，因此我们检查了PGD 2受体DP 1和DP 2是否参与ERK信号通路的激活。如图3d所示，PD98059（10μM）对MEK的抑制完全阻断了PGD 2诱导的ERK的活化。但是，抑制DP 1（BWA868C，10μM）或DP 2（TM-30089，10μM）或同时抑制DP 1和DP 2不会阻止PGD 2诱导的ERK激活。此外，DP的选择性激动剂1（BW245C，10μM）或DP 2（DK-PGD 2，10μM）不诱导ERK（图的激活3E）。此外，DP 1和DP 2的激动剂或拮抗剂都不会影响SMC标记蛋白的表达（图3f，g）。
一个 P4级血管平滑肌细胞与所指示的前列腺素或刺激血栓素类似物（U46619）4天。检查细胞裂解物的SMA和SM22α表达。b用TNFα或PGD 2刺激P4期VSMC 4天，并分析AngII依赖性收缩（n = 2）。* 与未治疗（NT）组相比，P <0.05。c用指示的抑制剂（PD，PD98059，SP，SP600125，SB，SB203580）预处理P4期VSMC，并评估PGD 2依赖性的SMA和SM22α表达变化。d P4级VSMC用MEK，DP 1或DP 2预处理抑制剂（PD98059，BWA868C或TM-30089），然后用PGD 2刺激。分析细胞裂解物的ERK活化。Ë P4级的VSMC用一个刺激DP 1或DP 2激动剂（BW245C（上图）或DK-PGD 2（下图）），和ERK活化进行了评估。˚F P4级的VSMC用一个预处理DP 1或DP 2拮抗剂（BWA868C或TM-30089），和PGD 2度检查在SMA和SM22α依赖性基因表达的变化。用DP 1或DP 2激动剂（BW245C（上图）或DK-PGD 2）刺激g的 P4期VSMC。（下图）），并评估SMA和SM22α的表达水平。结果表示为平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较测试用于确定P值。星号表示统计显着性（P <0.05）。
PGD 2产生炎性代谢产物，如Δ 12 -PGD 2和15- d-PGJ 2 29，30。由于我们的结果显示DP 1和/或DP 2受体不影响VSMC的表型变化，因此我们假设PGD 2代谢产物参与VSMC的表型调节。如图4a所示，PGJ 2系列的PGD 2代谢物显着诱导VSMC表型变化，而其他系列的代谢物则无作用。另外，PGJ 2系列代谢物显着诱导ERK激活，而其他系列代谢物则没有（补充图S6）。由于PGD 2和PGJ 2是PPAR的内源性配体31，32，我们探索PGD的效果2代谢物上PPRE启动子活性。如图4b所示，TNFα，PGD 2和15-d-PGJ 2显着提高了PPRE启动子活性，而没有诱导VSMC表型改变的15-d-PGD 2没有作用。此外，VSMC主要表达PPARδ和PPARγ（补充图S7a，b）; PPARδ（GSK3787，10μM）和PPARγ（GW9662，10μM）的选择性抑制抑制了收缩性VSMC中15-d-PGJ 2诱导的表型变化，而PPARα（GW6471，10μM）的抑制作用无效（图。4C）。由于15-d-PGJ 2显着激活了PPRE启动子的PPARδ依赖性激活（图4d），因此我们研究了在存在或不存在PPARδ的情况下15-d-PGJ 2的作用。在15-d-PGJ 2存在的情况下，PPARδ的过表达显着增强了收缩性VSMC表型变化（图4e）。此外，PPARδ的沉默抑制了15-d-PGJ 2诱导的收缩性VSMC表型变化（图。4f）。收缩性VSMC的增殖显着低于合成VSMC 的增殖（图4g），而收缩性VSMC的增殖通过PPARδ的过表达而增强（图4h）。此外，用15-d-PGJ 2刺激腹主动脉碎片促进了VSMC的离体萌芽（图4i）。
一个 P4级的VSMC用所示PGD刺激2种代谢物，和SMA和SM22α的表达水平通过Western印迹分析进行评估。b在指定的刺激下（n = 3）验证了PPRE的启动子活性。c P4期VSMC用PPARα，PPARδ或PPARγ拮抗剂（GW6471，GSK3787或GW9662）预处理，然后用15-d-PGJ 2刺激。通过蛋白质印迹分析评估SMA和SM22α的表达水平。d收缩型VSMC用携带载体或PPARδ构建体的逆转录病毒感染，并在指定刺激下验证PPRE的启动子活性（n = 3）。GW501516（10μM）被用作PPARδ激动剂的阳性对照。用 FLAG标记的PPARδ在P4期VSMC中表达，并在用15-d-PGJ 2刺激后评估SMA和SM22α的表达水平。˚F PPARδ被沉默在P4-阶段的VSMC和SMA的表达和细胞与15-d-PGJ刺激后SM22α评估2。g测量了P0或P4期VSMC的增殖（n = 10）。h在P4期VSMC中表达了载体或PPARδ，并检测了增殖（n = 5）。一世分离主动脉组织，丢弃内皮层和外膜层，并将主动脉组织片段置于胶原蛋白包被的板上，然后用15-d-PGJ 2刺激7天。虚增的VSMC用虚线表示。结果表示为平均值±SEM。单向方差分析和Tukey的多重比较测试用于确定P值。星号表示统计显着性（P <0.05）。
为了评估TNFα在体内VSMC表型调节中的作用，对既缺乏ApoE也缺乏TNFα（ApoE -/- TNFα -/ -）的小鼠喂食了高脂西方饮食，并检查了新内膜的形成。如图5a所示，喂食高脂饮食的小鼠在发炎的内侧层和斑块病变中表现出明显诱导的COX2表达，而在缺乏TNFα的小鼠中COX2表达被消除。两种基因型仅在斑块病变中观察到巨噬细胞。新内膜形成中被显著降低的ApoE- / - TNFα - / -小鼠比的ApoE - / - TNFα+ / +小鼠（图 5b）。为了避免由切片的位置引起的疏忽错误，我们还检查了主动脉窦内的新内膜形成。如图 5c所示，在缺乏 TNFα的小鼠中新内膜形成明显减少。
同时给缺乏ApoE和TNFα 的小鼠喂食高脂饮食15周。分离主动脉组织并用所示抗体染色。白色和红色箭头分别指示COX2表达和巨噬细胞。酒吧，25微米。给小鼠喂食正常或高脂饮食15周。主动脉（b）（ApoE -/- TNFα + / +小鼠，n = 8; ApoE- /- TNFα -/-小鼠，n = 12）和主动脉窦（c）（ApoE - /- TNFα + / +小鼠，n = 11；的ApoE - / - TNFα - / -小鼠中，Ñ = 18）用苏木精和曙红染色，并测定新内膜区域。蓝色虚线表示新内膜组织。酒吧，50微米。结果表示为平均值±SEM。使用未配对的学生t检验（两条尾巴）确定P值。
接下来，我们调整颈动脉结扎模型，以确定新内膜形成是否需要TNFα和COX2。在对照小鼠中，靠近分叉处靠近主动脉弓的左颈总动脉的结扎明显诱导了新内膜形成，而在缺乏TNFα的小鼠中新内膜形成明显较低（图6a）。另外，饲喂选择性COX2抑制剂塞来昔布的小鼠表现出完全阻断了颈动脉结扎诱导的新内膜形成（图6b）。总体而言，通过油红O染色评估，缺乏TNFα的小鼠的斑块形成显着减少（图6c）。
a将缺乏TNFα的小鼠的颈动脉结扎4周（ApoE - / - TNFα + / +小鼠，n = 8；ApoE-/- TNFα - /-小鼠，n = 9）。显示了用苏木精和曙红染色的颈动脉横截面的代表性显微照片。虚线定义了内侧和新内膜层。酒吧，25微米。b在结扎颈动脉之前，为小鼠喂食含有选择性COX2抑制剂（celecoxib）的饮食2周，并向其喂食含有celecoxib的饮食4周（盐水，n = 4； celecoxib，n = 6）。分离主动脉组织，并用苏木精和曙红对距结扎远端2 mm的横截面进行染色。虚线定义了内侧和新内膜层。酒吧，25微米。c给小鼠喂高脂饮食15周，分离腹主动脉并用油红O染色，并通过用异丙醇提取油红O定量脂质积聚（n = 4）。d由PPARδ介导VGD 的PGD 2介导的表型调节的示意图。结果表示为平均值±SEM。使用未配对的学生t检验（两条尾巴）确定P值。
本研究表明，TNFα通过诱导COX2和产生前列腺素（如PGD 2和PGJ 2）来调节收缩型VSMC向合成表型的去分化。另外，它表明TNFα的损失和COX2的抑制抑制了小鼠内膜增厚的诱导。因此，我们提出PGD 2介导的PPARδ激活是抑制新内膜形成的潜在靶标。
据报道，血管重塑与慢性炎症有关的9，37。因此，炎症细胞因子可能在血管重塑中起着关键作用，尤其是在VSMC的表型转换中。特别地，TNFα已经与动脉粥样硬化的发病机理有关。例如，TNFα的破坏已报道延缓动脉粥样硬化的进展和减少病变大小15，17。造血谱系细胞产生TNFα似乎很重要，因为已发现缺乏TNFα的小鼠骨髓移植可降低动脉粥样硬化的严重程度16。同样，我们的结果表明，在缺乏TNFα的小鼠中，动脉粥样硬化病变的大小明显减少（图5）。TNFα的主要作用之一似乎与VSMC表型改变有关。例如，收缩性VSMC的刺激抑制了平滑肌标记基因的表达，并导致平滑肌细胞的收缩功能丧失（图1）。TNFα诱导的VSMC表型改变的结果是VSMC过度增殖，因为在体外合成VSMC的生长快于收缩VSMC（图4g）8。因此，我们建议TNFα刺激平滑肌的表型转化，从而增强VSMC增殖并引起新内膜形成。
尽管尚不清楚TNFα介导的VSMC表型转化的机制，但最近的证据支持COX2诱导在血管重塑过程中的作用。TNFα可诱导COX2表达在多种细胞类型18，19，20，21，22，并且同样地，我们发现TNFα刺激COX2的启动子活性，从而增强了在可收缩血管平滑肌细胞（图COX2表达2A-C ）。有几条证据支持TNFα诱导COX2在收缩性VSMC表型改变中的作用。首先，COX2的沉默或过表达显着影响了VSMC中平滑肌标记基因的表达和收缩功能（图2d）。，例如，e，g，h，补充图S3b）。第二，COX酶活性的抑制抑制TNFα诱导的收缩VSMC的表型变化和颈动脉结扎诱导的新内膜形成（图2女，6B）。第三，据报道，TNFα诱导COX2是VSMC增殖所必需的23。因此，这些结果表明，VSMC表型转化需要依赖于TNFα的COX2和COX2酶活性的诱导。
前列腺素由前列腺素和血栓烷组成，由COX家族成员产生，我们的结果表明PGD 2（由COX2产生的前列腺素）似乎是VSMC表型变化的主要因素（图3a，补充图S4a， b）。同样，据报道脂质脂蛋白型前列腺素D合酶血清水平与冠状动脉疾病的严重程度相关38。两个PGD 2种受体，即，DP 1和DP 2，已由此鉴定远39，但无论这两种受体似乎参与PGD 2介导的VSMC表型改变。例如，在本研究中，DP 1和/或DP 2的抑制或激活均不影响VSMC表型变化（图3f，g）。与此相一致，缺乏DP 1受体40的小鼠在动脉粥样硬化中没有发现显着差异。此外，在VSMC中未观察到DP 1和DP 2的表达，并且用PGD 2刺激VSMC 并没有改变cAMP的水平，而cAMP是DP 1和DP 2受体信号通路的第二信使（补充图S5）。ERK信号通路在PGD 2诱导的VSMC表型改变中起重要作用。例如，用PGD 2刺激收缩性VSMC 强烈激活了ERK，并且对ERK信号的抑制完全阻断了PGD 2诱导的VSMC表型变化（图3c，d），表明PGD 2通过DP 1诱导了VSMC表型变化。-或DP 2独立机制。
PGD 2诱导的VSMC表型改变有两种机制可能性：（1）激活ERK信号通路的新型受体，以及（2）PGD 2的代谢转化。PGD 2被代谢为脂质介质，如前列腺素Ĵ 2（PGJ 2），Δ 12 -前列腺素Ĵ 2（Δ 12 -PGJ 2），15-脱氧Δ 12,14 -前列腺素Ĵ 2（15-d-PGJ 2），Δ 12 -前列腺素d 2（Δ 12 -PGD 2）和13,14-二氢-15-酮基PGD 2（DK-PGD 2）29，30。实际上，在本研究中，PGJ型PGD 2代谢物显着诱导VSMC表型变化（图4a）。PGJs已报道是PPARδ的内源性配体32，和我们的结果还表明，PGJs显著激活PPRE启动子活性（图4B），其也通过显著ERK的抑制钝化。还值得注意的是，PGJs显着增强了ERK活性（补充图S6）。此外，我们的一些观察结果支持PPARδ在VSMC表型变化中的作用。（1）选择性PPARδ拮抗剂抑制了15-d-PGJ 2诱导的VSMC表型改变（图4c）。（2）异位调节PPARδ表达显着影响VSMC的表型变化（图4e，f）。（3）PPARδ的过表达增强了血管平滑肌细胞的增殖（图4h）。这些观察结果鼓励我们提出，依赖ERK的PPARδ激活与VSMC表型的调节有关。
由于VSMC还表现出PPARγ的表达降低（补充图S7b），因此VSMC中PGD 2依赖性表型变化可能由PPARγ介导。实际上，就VSMC中的表型变化而言，PPARγ同工型显示出相似的作用（补充图S8）。PPARγ在心血管疾病发展中的作用颇有争议。例如，PPARγ的强制表达或破坏在血管平滑肌细胞增殖，心血管疾病进展的方面不相容效果，和亲的或抗炎反应的中介34，41。目前，我们尚无任何直接证据来确定PPARγ在心血管疾病中的确切作用，但坚信PPARγ的作用取决于可能受许多因素影响的细胞或疾病环境。
在本研究中，我们提供了证据，即依赖COX2的PGD 2生成以及PPARδ激活在VSMC表型的病理变化中起着重要作用（图6d）。在这方面，我们的发现表明，在心血管疾病的背景下，选择性调节PGD 2的生物学活性可能在治疗上有用。
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