VEGF-A在抗pd-1耐药稳定大肠癌中诱导TOX依赖性T细胞衰竭的作用
摘要 虽然免疫检查点阻断疗法在癌症治疗中已显示出临床疗效，但在多种癌症环境下，利用这一策略在很大程度上受到耐药性的制约。在此，我们发现肿瘤浸润的T细胞在微卫星稳定(MSS)结直肠癌(CRC)中已经严重耗尽，这是Pd-1阻断耐药肿瘤的一个典型例子。在MSS CRC中，我们发现伤口愈合的特征是上调的，T细胞衰竭是由血管内皮生长因子-A(VEGF-A)驱动的。我们报道，VEGF-A诱导T细胞中转录因子TOX的表达，从而驱动T细胞的耗竭特异性转录程序。通过体外、体内和体内研究相结合的方法，我们证明联合阻断PD-1和VEGF-A可以恢复T细胞的抗肿瘤功能，从而更好地控制MSS CRC肿瘤。
导言 肿瘤微环境中的肿瘤抗原特异性T细胞耗尽，其抗肿瘤功能受到严重损害。 1 2 )。慢性T细胞受体(TCR)在慢性病毒感染和癌症( 3 4 )。耗尽的T细胞逐渐失去效应T细胞的主要特征，如效应细胞因子的产生、对靶细胞的细胞毒性和增殖能力。 5 6 )。此外，它们还表达多种免疫检查点受体，如程序性细胞死亡蛋白-1(pd-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3区(Tim-3)、淋巴细胞活化基因-3(延迟-3)和带有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)( 7 8 )-并显示与T细胞衰竭相关的转录谱( 9 12
目前，抗pd-1、抗程序化细胞死亡配体蛋白-1(pd-l1)和抗CTLA-4抗体已被开发出来，通过干扰免疫检查点受体及其配体的结合，使肿瘤患者精疲力竭的T细胞恢复活力。 13 )。免疫检查点抑制剂治疗已成为治疗各种癌症的标准治疗方法之一。 14 17 )。例如，pd-1阻断显示了持久的临床效益错配修复缺陷或微卫星不稳定-高(Msi)结直肠癌(CRC)( 18 20 )。然而，患有错配修复熟练或微卫星稳定(Mss)的患者占CRC患者的大多数(约80%至90%)，仅对pd-1阻断没有反应(据报道，有反应率为0%) 14 18 21 23 )，限制了检查点阻断疗法的临床适用性，必须制定替代策略，以造福于这一组患者。阐明MSS和CRC对检查点阻断的潜在阻力仍然是改善患者预后的一个重要目标( 24 25
msi crc对抗pd-1治疗的显著反应可由msi crc中观察到的高肿瘤突变负担( 18 20 )。尽管MSS CRC的肿瘤突变负担低于msi crc，但单是肿瘤突变负担并不能解释mss crc对抗pd-1治疗缺乏反应的原因。 26 27 )。在MSS CRC中观察到的其它类型癌症，包括默克尔细胞癌、宫颈癌、肝细胞癌、子宫内膜癌和乳腺癌，Pd-1阻断反应率为5.7%~61.7%( 27 )。因此，我们假设肿瘤突变负担以外的因素是MSS CRC免疫检查点阻滞缺乏反应的原因。
在此，我们研究了MSS CRC患者T细胞衰竭和对检查点阻断的抵抗的关键机制。我们观察到MSS CRC肿瘤浸润性T细胞严重衰竭，血管内皮生长因子-A(VEGF-A)含量增加，导致人T细胞耗竭相关转录规划呈TOX依赖性。抑制VEGF-A或TOX激活的T细胞，我们证明联合阻断PD-1和VEGF-A能有效地恢复MSS CRC中T细胞的抗肿瘤功能。
结果 肿瘤浸润CD8 + 来自MSS crc的T细胞比来自msi crc的t细胞消耗得更多。 首先，我们通过计算CD3的数量，比较了MSS和MSI细胞间T细胞浸润到肿瘤中的大小。 + 或CD8 + 细胞半定量免疫组织化学分析。MSS CRC组织CD3显著减少 + 和CD8 + 侵袭性边缘和肿瘤中心的细胞均高于MSI CRC( 图1，A至D )。流式细胞仪分析还显示CD3的相对数目。 + 或CD8 + 与肿瘤细胞相比，MSI CRC中T细胞高于MSS CRC(图1)。(1、A和B)。然后用流式细胞仪检测大肠癌患者T细胞耗竭情况。pd-1的百分比 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，或TIGIT + 肿瘤浸润CD8细胞 + T细胞在肿瘤组织中明显高于外周血或癌旁正常粘膜(图5)。表明T细胞耗竭仅限于肿瘤微环境。免疫检查点抑制受体在肿瘤浸润CD8中的表达 + 评估T细胞，pd-1的百分比。 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，或TIGIT + 肿瘤浸润CD8细胞 + T细胞在MSS CRC显著高于MSI CRC( 图1E )。然而，pd-1的百分比 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，或TIGIT + 外周血CD8细胞 + T细胞或癌旁正常粘膜CD8 + T细胞在MSS患者与MSI CRC患者之间无显着性差异(图二)。中3、A和B)。我们还试图用肿瘤相关的睾丸抗原NY-ESO-1在肿瘤特异性背景下证实这些发现，与正常的癌旁组织相比，NY-ESO-1在肿瘤组织中的表达明显上调(图二)。(中4)。为此，我们检测了免疫检查点受体表达细胞在NY-eso-1中的百分比。 157-165 人白细胞抗原(HLA)-A2多聚体 + CD8 + HLA-A2(+)患者T细胞。虽然NY-ESO-1的频率 157-165 -特异性肿瘤浸润CD8 + T细胞在两组间无差异( 图1f )，PD-1的百分比 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，或TIGIT + NY-ESO-1细胞 157-165 -特异性肿瘤浸润CD8 + T细胞在MSS CRC显著高于MSI CRC( 图1g )。我们还检测了肿瘤浸润CD8的功能。 + 通过分析抗CD3诱导的T细胞增殖和细胞因子的产生，发现MSS CRC患者T细胞严重受损.肿瘤浸润CD8 + MSI CRC的T细胞具有较高的增殖能力，而MSS CRC的T细胞增殖能力减弱。 图1H )。此外，肿瘤浸润的CD8 + T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)的程度较低。 图1i 还有无花果。(第5条)。这些结果表明，mss crc肿瘤包含较少的肿瘤浸润CD8。 + T细胞衰竭程度较MSI CRC肿瘤严重。
图1 肿瘤浸润CD8的数量及衰竭状态 + MSS和MSI CRC中的T细胞。 (A 到 D )肿瘤浸润CD3的数目。 + (A和B)和CD8 + 采用免疫组织化学方法对MSS的侵袭性边缘(A、C)和肿瘤中心(B、D)的T细胞进行分析。 n =125)和MSI( n =26)“儿童权利公约”。用随机选取的高功率场中染色细胞数(每平方毫米阳性细胞数)来量化细胞密度。具有代表性的图像显示在左侧。标尺条，100μm. E )从MSS( n =110)和MSI( n =14)“儿童权利公约”和PD-1所占百分比 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，和TIGIT + 肿瘤浸润CD8细胞 + 流式细胞术分析T细胞。有代表性的流式细胞仪图显示在顶部。SSC，侧面散射光。( F )NY-ESO-1的百分比 157-165 -肿瘤浸润CD8中的特异性细胞 + HLA-A2(+)MSS患者T细胞 n =45)和MSI( n (5)流式细胞仪分析CRC。( G )pd-1的百分比 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，和TIGIT + NY-ESO-1细胞 157-165 -特异性肿瘤浸润CD8 + HLA-A2(+)MSS患者T细胞 n =45)和MSI( n 5)流式细胞仪分析大肠癌。( H )来自MSS的单细胞( n =10)和MSI( n (3)细胞微量紫(Ctv)染色，抗CD3抗体刺激，CD8增殖。 + 流式细胞术分析T细胞。代表直方图显示在左侧。( I )来自MSS的单细胞( n =17)和MSI( n (9)抗CD3抗体及细胞内细胞因子染色对大肠癌细胞进行IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)的刺激。有代表性的情节出现在左边。棒材代表平均±扫描电镜；NS，无显着性；* P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.
与MSI CRC相比，VEGF-A在MSS CRC中表达上调。 我们推测mscrc的肿瘤微环境比msi crc更具有免疫抑制作用，导致肿瘤浸润CD8的耗竭和严重衰竭。 + T细胞为了验证这一假设，我们对癌症基因组图谱(TCGA)CRC队列进行了分类( 28 )基于免疫基因签名模块( 29 )。msscrc主要由一个血管生成基因高表达的创面愈合亚型组成，而mssc中则有一个γ显性亚型。 图2A )。在基于TCGA数据库的各种癌症中，MSS CRC在具有血管生成特征的伤口愈合亚型中频率最高( 图2B )。根据这些调查结果， VEGFA 与MSI组相比，MSS组mRNA水平显著升高(P<0.01)。 图2C 还有无花果。(中6)。我们自己的队列分析证实，与MSI CRC组织相比，MSS CRC组织中VEGF-A的表达增加。 图2D )在先前的研究基础上对VEGF-A的表达进行量化时( 30 )。我们用细胞内染色法检测了VEGF-A的主要来源。 图2e )。在产生VEGF-A的细胞中，约82%为肿瘤细胞(CD 45)。 − 埃帕姆 + 约7%为肿瘤浸润T细胞(CD 45)。 + CD3 + 表明VEGF-A主要由肿瘤细胞产生.在血浆中，MSS CRC患者的VEGF-A也显著高于MSI CRC患者( 图2f )。血浆VEGF-A水平与组织匀浆中VEGF-A水平显著相关(图二)。(第7段)。血浆VEGF-A浓度与MSS分期呈正相关，但与MSI分期无明显相关性(P>0.05)。 图2g )。这些数据表明VEGF-A在MSS CRC中高表达，尤其是在较高的阶段.
图2 免疫亚型和VEGF-A在MSS和MSI CRC中的表达。 (A )分析不同免疫亚型(创伤愈合、IFN-γ显性、炎性和淋巴细胞耗竭)在TCGACRC组MSS和MSICRC中所占的比例。( B 创伤愈合亚型在TCGA全癌组中按癌型分类的百分比。癌症类型的缩写是根据国家癌症研究所基因组数据共享( http://gdc.cancer.gov )除MSS CRC和MSI CRC外。( C )表达 VEGFA 对TCGA结直肠癌组MSS和MSI CRC中的mRNA进行了分析。原木 2 (RPKM+1)值 VEGFA mRNA表达。RPKM，每百万字节读取。( D 用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中VEGF-A的表达。 n =72)和MSI( n =17)“儿童权利公约”。具有代表性的图像显示在左侧。标尺条，100μm. E )来自CRC组织的单细胞( n 用灯盏花素A和莫能菌素培养12小时后，进行细胞内VEGF-A染色。肿瘤细胞比例(CD 45) − 埃帕姆 + 肿瘤浸润性T细胞(CD 45) + CD3 + 用流式细胞仪分析VEGF-A产生细胞中的T细胞。( F 和 G )MSS患者血浆VEGF-A浓度( n =80)和MSI( n (8)用酶联免疫吸附法(F)测定CRC，并与分期(G)相关。棒材代表平均±扫描电镜；* P < 0.05; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.
VEGF-A上调CD8免疫检查点抑制受体 + T细胞及其功能受损 由于VEGF-A在MSS CRC患者中过表达，我们观察了VEGF-A对T细胞表型和功能的影响。首先，我们证实了VEGF-A受体在人CD8中的表达。 + T细胞人外周血CD8的体外分析 + 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测正常供者T细胞在抗CD3刺激下表达VEGFR 2，而不表达VEGFR 1。 图3，A和B )。肿瘤浸润CD8 + MSS CRC的T细胞在不受体内外刺激的情况下表达VEGFR 2。 图3C )。此外，VEGFR 2仅在肿瘤抗原特异性(ny-eso-1)中表达。 157-165 -特异性)肿瘤浸润CD8 + T细胞，而旁观者(巨细胞病毒pp 65) 495-503 -特异性)肿瘤浸润CD8 + T细胞根本不表达VEGFR 2( 图3d )，表明，在肿瘤浸润的CD8中 + T细胞，肿瘤抗原特异性CD8 + T细胞对VEGF-A有反应。
图3 VEGF-A对人CD8的影响 + T细胞 (A 和 B )CD8 + 取正常供体T细胞，用抗CD3抗体刺激60小时(A)或84小时(B)。表达 VEGFR 1 和 VEGFR 2 用RT-PCR(A)分析mRNA。β-肌动蛋白作为内部对照.CD8中VEGFR 1和VEGFR 2的表达 + 用流式细胞仪(B)分析T细胞。以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为阳性对照。( C )VEGFR 2在CD8中的表达 + 外周血T细胞和MSS CRC肿瘤( n 用流式细胞仪分析。代表直方图显示在左侧。( D VEGFR 2在肿瘤抗原特异性(NY-ESO-1)中的表达 157-165 -特定的)和旁观者(CMV pp 65 495-503 -特异性)肿瘤浸润CD8 + T细胞( n 用流式细胞仪分析。代表直方图显示在左侧。( E 到 G )用抗CD3抗体和VEGF-A刺激正常人外周血单个核细胞84小时.pd-1的百分比 + ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，和TIGIT + CD8细胞 + 流式细胞术分析T细胞； n =8)。CD8增殖 + 用细胞微量紫稀释法分析T细胞； n =5)。用抗CD3抗体刺激6h后，进行细胞内细胞因子染色，检测IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)； n =6)。代表直方图或图表显示在左侧。( H )血浆VEGF-A浓度与Pd-1百分比的相关性 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，和TIGIT + 肿瘤浸润CD8细胞 + 对MSSCRC患者的T细胞进行分析。 n =49)。棒材代表平均±扫描电镜；** P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.
当我们治疗人类CD8的时候 + 重组VEGF-A蛋白的正常供者T细胞除抗CD3外，我们发现VEGF-A增加了pd-1的百分率。 + ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，或TIGIT + CD8细胞总数 + T细胞在抗原识别过程中呈剂量依赖性( 图3e 还有无花果。而VEGF-A在不刺激CD3的情况下，对免疫检查点受体的表达无上调作用(图5)。(第9段)。VEGF-A可降低抗CD3诱导的增殖( 图3f )以及干扰素-γ和肿瘤坏死因子的产生。 图3g )。VEGF-A的表达与T细胞浸润在MSS结直肠癌侵袭性边缘和肿瘤中心呈负相关(图二)。(第10段)。此外，血浆VEGF-A水平与pd-1的比例显著相关。 高 ，Tim-3 + ，滞后-3 + ，或TIGIT + 肿瘤浸润CD8细胞 + MSS CRC患者T细胞( 图3H )。提示VEGF-A可能是MSS CRC患者T细胞严重衰竭的主要原因之一，表现为免疫检查点抑制受体表达增加，增殖和细胞因子生成减少。
VEGF-A诱导TOX介导的T细胞衰竭转录程序 人CD8的转录谱 + 对正常供体T细胞进行RNA测序(RNA-seq)分析，观察抗CD3刺激前后VEGF-A对T细胞的影响。整个转录序列的分级聚类显示了CD8的不同表达谱。 + VEGF-A处理后的T细胞( 图4A )。在1502个差异表达的基因(Degs)中，VEGF-A上调了820个基因的表达，包括各种免疫检查点和促凋亡分子，而下调了682个基因的表达，其中包括kruppel样因子(kruppel-like factor，klf)家族成员和前生存转录因子(pro遗存转录因子)。 图4B )。基因集富集分析(GSEA)显示，与耗尽CD8相关的基因集。 + T细胞，最初发现于感染慢性淋巴细胞性脉络膜炎病毒(LCMV)的小鼠。 10 )，富集于VEGF-A处理的CD8中。 + T细胞( 图4c ).
图4 VEGF-A处理的CD8的转录谱 + T细胞 (A 到 D )CD8 + 正常供体T细胞( n 用抗CD3抗体刺激60小时，不加VEGF-A或存在VEGF-A。提取总RNA，进行RNA-seq分析。VEGF-A治疗前后转录组的分级聚类(A)。CD8差异表达基因的热图 + T细胞加或不加VEGF-A治疗(B)。基因表达呈行向表达。 z 几十个标准化阅读计数。精疲力竭CD8中基因启动上调(顶)或下调(下)的谷胱甘肽(GSEA) + 从慢性LCMV感染模型中提取T细胞，用VEGF-A处理的T细胞与未处理的CD8的转录组进行比较。 + T细胞(C)。归一化浓缩分数。1045种转录因子在VEGF-A处理的CD8中差异表达的火山图 + T细胞与未经治疗的CD8细胞比较 + T细胞(D)。( E 和 F )用抗CD3抗体刺激正常人外周血单个核细胞84小时，不加VEGF-A。流式细胞仪检测NFATc 1(E)和TOX(F)的表达。 n =4)。代表直方图显示在左侧。( G 加入环孢素A(CsA)刺激PBMCs后，用流式细胞仪(FCM)检测TOX的表达。 n =6)。代表直方图显示在左侧。MFI，平均荧光强度。棒材代表平均±扫描电镜；* P < 0.0001.
接下来，我们重点研究转录因子的表达，以确定VEGF-A诱导的T细胞衰竭转录程序的主要驱动因素。一幅含有转录因子基因的火山图显示， NFATC 1 和 毒理 在人CD8细胞中VEGF-A治疗后，表达上调的基因是最多的吗？ + T细胞( 图4D 和表S2)。VEGF-A处理的人CD8中NFATc 1和TOX蛋白的上调 + 用流式细胞仪对T细胞进行鉴定。 图4、E和F )。我们证实，NFATc 1介导VEGF-A诱导的人CD8中pd-1和其他免疫检查点抑制受体(如Tim-3、延迟-3和TIGIT)的上调。 + 使用NFATc 1抑制剂环孢素A的T细胞(图)。S11A)。然而，NFATc 1的抑制也否定了抗CD3刺激介导的T细胞增殖和细胞因子的产生。(S11，B和C)，表明NFATC 1不是一种特定于耗竭的调节剂。NFATc 1抑制显著抑制VEGF-A诱导的TOX表达 图4g )，促使我们研究在VEGF-A存在的抗原识别过程中TOX的表达是否能调节T细胞的耗竭。因此，我们通过用小干扰RNA(SiRNA)降低TOX的表达来研究TOX在VEGF-A诱导的T细胞衰竭中的作用。毒性特异性siRNA阻断VEGF-A介导的PD-1、Tim-3、延迟-3和TIGIT的上调。 图5A )并恢复VEGF-A处理的CD8的功能。 + 抗CD3诱导的T细胞增殖及IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)的产生 图5，B和C )。谷胱甘肽a显示，与精疲力竭的CD8相关的基因组的变化。 + 用siRNA击倒TOX，逆转慢性LCMV感染模型的T细胞。 图5d )。此外，VEGF-A的转录谱，TOX siRNA转染的CD8 + T细胞与VEGF-A-天真CD8细胞显著重叠 + T细胞( 图5e ).
图5 血管内皮生长因子-A处理的CD8的毒性依赖性耗竭 + T细胞 (A 到 C )正常献血者的PBMC( n 6)用抗CD3抗体和VEGF-A治疗84小时。治疗后24h，用TOX siRNA或对照siRNA转染PBMC。CD8中TOX、PD-1、Tim-3、延迟-3和TIGIT的表达 + 用流式细胞仪(A)分析T细胞。代表直方图显示在顶部。CD8增殖 + 用细胞微量紫稀释法(B)分析T细胞。用抗CD3抗体(C)刺激6h后，对干扰素、γ和肿瘤坏死因子(TNF)进行细胞内细胞因子染色。代表直方图或图表显示在左侧。( D 和 E )CD8 + 正常供体T细胞( n 4)用抗CD3抗体和VEGF-A刺激60小时。刺激后24小时，CD8 + 用TOX siRNA或对照siRNA转染T细胞。提取总RNA，进行RNA-seq分析。精疲力竭CD8中基因启动上调(顶)或下调(下)的谷胱甘肽(GSEA) + 慢性LCMV感染模型T细胞采用VEGF-A处理的转录组，对照siRNA转染组与VEGF-A处理组、TOX siRNA转染CD8组进行比较。 + T细胞( D )。VEGF-A-未处理CD8的分级聚类 + T细胞、VEGF-A处理的CD8 + T细胞，对照siRNA转染CD8 + T细胞和TOX siRNA转染的CD8 + T细胞( E )。棒材代表平均±扫描电镜；* P < 0.0001.
我们还进行了h3赖氨酸27乙酰化(H3k27ac)染色质免疫共沉淀，然后测序(芯片seq)，这是一个有用的工具，以确定活跃的调节元件，包括促进剂和启动子。 31 32 )。我们通过比较h3k27ac芯片-seq数据与对照siRNA-和TOX sirna转染的CD8，研究了TOX对调控序列的影响。 + 抗CD3和VEGF-A治疗后的T细胞。在TOX siRNA转染细胞中，共有7327个峰被下调，表明这些峰以TOX特异性的方式上调。S12A)。全基因组分析表明，这7327个差异H3K27ac峰在内含子和基因间区域高度富集(图二)。(S12B)，提示TOX对远端顺式调节元件具有调节作用。接下来，我们分析了免疫检查点受体基因周围的H3K27ac峰，包括 PDCD 1 , HAVCR 2 , LAG 3 ，和 TIGIT ...TOX siRNA转染CD8峰的下调 + T细胞揭示了免疫检查点受体基因的几个潜在的调节元件(图)。(S12，C到F)，表明TOX表观基因通过控制远端顺式调节元件来调控免疫检查点受体的基因。
这些数据表明，TOX介导VEGF-A诱导的T细胞衰竭，TOX不仅与免疫检查点抑制受体的上调有关，而且还与VEGF-A处理的T细胞的耗竭特异性转录程序和功能损害有关。此外，表观遗传分析揭示了TOX与免疫检查点受体基因调控之间的联系。
血管内皮生长因子-A以TOX依赖方式诱导MSS CRC T细胞衰竭 TOX是否与肿瘤浸润CD8的衰竭状态有关 + 在大肠癌患者T细胞中，我们发现免疫检查点抑制受体的表达与TOX表达显著相关( 图6a )。此外, t -分布式随机邻居嵌入( t -SNE分析表明，肿瘤浸润CD8中TOX、pd-1、Tim-3、延迟-3和tIGIT的表达紧密重叠。 + T细胞( 图6B )。此外，TOX在肿瘤抗原特异性(NY-ESO-1)中的表达较高。 157-165 -特异性)肿瘤浸润CD8 + T细胞与旁观者(巨细胞病毒pp 65)比较 495-503 -特异性)肿瘤浸润CD8 + T细胞( 图6c )。接下来，我们询问肿瘤是否浸润CD8。 + 来自CRC的T细胞根据MSI状态有不同的表达谱。为此，我们纯化了肿瘤浸润的CD8。 + 来源于MSS和MSI CRC的T细胞进行RNA-seq分析。增加 毒理 在肿瘤浸润性CD8中有特异性表达。 + 来自MSS CRC的T细胞。此外，肿瘤浸润的CD8 + 来自mss crc的T细胞表现出抑制性受体的上调基因，包括 PDCD 1 , HAVCR 2 , LAG 3 ，和 TIGIT ，以及与耗竭相关的转录因子，包括 埃梅斯 , BATF ，和 MAF (图6d )。谷胱甘肽还显示肿瘤浸润的CD8的转录谱之间有高度的重叠。 + MSS CRC的T细胞及CD8细胞衰竭时的观察 + 慢性LCMV感染模型T细胞。(S13A)或VEGF-A处理的CD8 + T细胞(图1)(S13B)。肿瘤浸润CD8的转录谱 + msi crc的T细胞与tx siRNA转染的CD8细胞相似。 + T细胞(图1)(S13C)。我们还比较了MSS和MSI CRC在蛋白水平的TOX表达。虽然我们发现在CD8中TOX的表达没有明显的差异。 + T细胞从外周血或正常粘膜根据MSI状态(图)。S14，A和B)，TOX在肿瘤浸润CD8中高度上调。 + 来自MSS CRC的T细胞与MSI CRC的比较 图6e )。我们还研究了击倒TOX是否能逆转肿瘤浸润CD8的衰竭。 + 来自MSS CRC的T细胞。毒性沉默肿瘤浸润CD8 + 来自MSS CRC的T细胞表达抑制性受体水平降低，细胞因子产生增强。 图6、F和G )。我们的数据表明肿瘤浸润的CD8 + MSS CRC中的T细胞经历VEGF-A诱导，TOX介导的转录程序，导致严重衰竭和效应功能受损.
图6 毒性依赖的肿瘤浸润CD8衰竭 + 来自MSS CRC的T细胞。 (A 肿瘤浸润CD8中TOX表达与免疫检查点抑制受体的相关性 + 大肠癌患者T细胞( n 用流式细胞仪分析。数据显示为pd-1中TOX的平均荧光强度的折叠变化。 内格 ，Tim-3 − ，滞后-3 − ，或TIGIT − 肿瘤浸润CD8 + T细胞( B ) t 肿瘤浸润CD8中TOX、PD-1、Tim-3、延迟-3和TIGIT表达的SNE分析 + T细胞( C )TOX在肿瘤抗原特异性(NY-ESO-1)中的表达 157-165 和旁观者(CMV Pp 65) 495–503 (特异性)肿瘤浸润CD8 + T细胞( n 用流式细胞仪分析。( D )肿瘤浸润CD8 + 来自MSS的T细胞( n =16，蓝色)和MSI( n 提取CRC，提取总RNA，进行RNA-seq分析。CRC病例按TOX表达水平显示，TOX表达最高的CRC病例位于左侧。选择基因的基因表现为逐行表达。 z 几十个标准化阅读计数。( E )TOX在肿瘤浸润CD8中的表达 + 来自MSS的T细胞( n =110)和MSI( n 14)流式细胞仪分析大肠癌。( F 和 G 用TOX siRNA或对照siRNA转染MSS CRC的TIL。肿瘤浸润CD8中TOX、PD-1、Tim-3、延迟-3和TIGIT的表达 + 流式细胞术分析T细胞； n =6)。代表直方图显示在顶部。用抗CD3抗体刺激6h后，进行细胞内细胞因子染色，检测IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)； n =3)。有代表性的情节出现在左边。棒材代表平均±扫描电镜；* P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.
联合阻断PD-1和VEGF-A恢复MSS CRC T细胞抗肿瘤功能 最后，我们评估了阻断VEGF-A/VEGFR 2相互作用是否增强抗PD-1诱导的T细胞恢复活力.为此，我们建立了一种肿瘤抗原特异性CD8。 + 能识别HLA-A2-限制性NY-ESO-1肽(NY-ESO-1)的T细胞株 157-165 、纯度99.1%的SLLMWITQV。S15A)。抗CD3刺激对NY-ESO-1细胞pd-1和VEGFR 2表达的影响 157-165 -特异性CD8 + T细胞(图1)(S15B)。纽约ESO-1 157-165 -特定的PD-1 + VEGFR 2 + CD8 + T细胞与HLA-A2共培养。 + pd-L1 + NY-ESO-1脉冲处理的CaCO-2 MSS CRC细胞 157-165 肽。NY-ESO-1的细胞毒活性 157-165 -特定的PD-1 + VEGFR 2 + CD8 + 抗pd-1或抗VEGFR 2的阻断抗体均能增加抗CaCO-2细胞的T细胞，这两种抗体的联合作用进一步促进了T细胞的增殖。 图7a )。此外，抗pd-1或抗VEGFR 2阻断抗体可促进IFN-γ和肿瘤坏死因子的产生，联合治疗可进一步提高IFN-和肿瘤坏死因子的产生。 图7b ).
图7 联合阻断PD-1和VEGFR 2的效果。 (A 和 B )纽约-ESO-1 157-165 -特定的PD-1 + VEGFR 2 + CD8 + T细胞与HLA-A2共培养 + pd-L1 + NY-ESO-1脉冲处理的CaCO-2 MSS CRC细胞 157-165 肽6小时。用PKH 26标记的CaCO-2细胞的to-pro-3染色评价T细胞介导的细胞毒性(A； n =4)。用细胞内细胞因子染色法检测干扰素-γ和肿瘤坏死因子(B)。介绍了具有代表性的情节。( C 和 D )在无抗PD-1和/或抗VEGFR 2的情况下，用抗CD3抗体刺激MSS CRC单细胞84 h(C； n =22)或36小时(D； n =20)。CD8增殖 + 用细胞微量紫稀释法(C)分析T细胞。细胞内细胞因子染色采用干扰素-γ和肿瘤坏死因子(TNF)在刺激后24h分别加入布来菲丁A和莫能菌素(D)。数据显示为相对于等型控件的褶皱变化。代表直方图或图表显示在左侧。棒材代表平均±扫描电镜；* P < 0.001; ****P < 0.0001.
我们检测了肿瘤浸润CD8的功能。 + 体外阻断pd-1和VEGF-A对MSS CRC单细胞株培养T细胞有促进作用。我们观察了肿瘤浸润CD8对干扰素-γ和肿瘤坏死因子的增殖和产生的影响。 + 抗CD3刺激T细胞。肿瘤浸润性CD8的增殖及细胞因子的产生 + 抗pd-1或抗VEGFR 2阻断抗体可使T细胞增多，联合治疗可进一步增强T细胞。 图7 C和D )。抗VEGF-A中和抗体在MSS CRC单细胞株的增殖方面对T细胞功能也有相似的影响(图5)。S16A)和效应细胞因子的产生。S16B)作为抗VEGFR 2的阻断抗体。抗VEGFR 2(图1)S17A)和抗VEGF-A(图5)。S17B)显著降低肿瘤浸润CD8中TOX和免疫检查点受体的表达。 + T细胞，而抗PD-1处理可增加Tim-3、延迟-3和TIGIT的表达.
我们用表达卵清蛋白(MC 38-OVA)的同基因MC38MSS CRC细胞(MC 38-OVA)建立了体内模型，证实了上述发现。 33 )，具有上调的伤口愈合特征，包括VEGF-A的表达(图)。(S18，A至D)。首先，我们通过与VEGFR 2杂交，产生了T细胞特异性的VEGFR 2条件基因敲除(CKO)小鼠。 fl/fl )LCK-CRE小鼠(LCK) CRE )评价VEGFR 2在T细胞中的作用。接种VEGFR 2 CKO小鼠的MC 38-OVA细胞的生长速度比野生型小鼠慢，从而提高了小鼠的整体存活率。 图8，A和B )。T细胞耗竭促进野生型和VEGFR 2型CKO小鼠的肿瘤生长，缩短存活时间(图1)。(第19、A至C节)。特别是当T细胞耗尽时，野生型和VEGFR 2型CKO小鼠在肿瘤生长动力学和小鼠存活方面没有差异，说明对VEGFR 2 CKO小鼠的更好的肿瘤控制依赖于T细胞。
图8 VEGFR 2对CD8的影响 + T细胞在小鼠体内肿瘤模型中的作用。 (A 和 B 野生型(WT)或T细胞特异性VEGFR 2 CKO小鼠( n 每组12例)接种MC 38-OVA MSS CRC细胞，进行肿瘤生长动力学分析(A)。估计肿瘤体积。总生存期用Kaplan-Meier生存曲线(B)进行分析。( C 到 G Wt或T细胞特异性VEGFR 2 CKO小鼠接种MC 38-OVA MSS CRC细胞，肿瘤细胞接种14d后取TIL。 n =每组5)。OVA百分比 257-265 -肿瘤浸润OVA中特异性细胞(C)、TOX(D)的表达、PD-1、Tim-3、延迟-3和TIGIT(E)的表达。 257-265 -特异性CD8 + T细胞分析。有代表性的图形或柱状图显示在左侧或顶部。OVA刺激TIL 257-265 肽作用84小时(F)或36小时(G)。OVA增殖 257-265 -特异性CD8 + 用细胞微量紫稀释法(F)分析T细胞。细胞内细胞因子染色采用细胞内细胞因子染色法检测细胞因子IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)在刺激后24h内加入布雷菲林A和莫能辛后的变化。代表直方图或图表显示在左侧。( H 到 J )小鼠接种MC 38-OVA、MSS、CRC细胞。抗PD-1和/或抗VEGFR 2治疗开始于肿瘤细胞接种后14天( n 每组12例)，分析各治疗组肿瘤生长动力学(H)。估计肿瘤体积。每个治疗组的总生存期用Kaplan-Meier生存曲线(I)表示.肿瘤细胞接种后21d取肿瘤组织，观察TOX在肿瘤浸润OVA中的表达。 257-265 -特异性CD8 + T细胞分析( n =每组6人)。∆MFI被定义为TOX的MFI与等型控制的MFI(TOX的MFI)，−的MFI是同类型控制的MFI。平均荧光强度(J)。棒材代表平均±扫描电镜；** P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.
在mc 38-ova接种后14天，我们分离和分析了肿瘤浸润淋巴细胞(Tils)，并证实肿瘤浸润CD8中没有VEGFR 2的表达。 + 流式细胞术检测VEGFR 2 CKO小鼠T细胞。(第20条)。OVA的相对频率 257–264 (SIINFEKL)肿瘤浸润CD8中的特异性细胞 + T细胞，使用特定的主要组织相容性复合物I(MHC-I)(H-2K)检测。 b 在VEGFR 2 CKO小鼠中，Multimer显著高于野生型小鼠( 图8c )。此外，TOX( 图8d )和免疫检查点抑制受体( 图8e )在肿瘤浸润OVA中 257-265 -特异性CD8 + 与野生型小鼠相比，VEGFR 2 CKO小鼠的T细胞明显下调。当TIL被OVA刺激时 257-264 (SIINFEKL)肽、增殖细胞和细胞因子(IFN-γ和TNF)在OVA中的作用 257-264 (SIINFEKL)-特异性CD8 + VEGFR 2 CKO小鼠T细胞显著高于野生型小鼠( 图8、F和G ).
然后，我们评价了联合阻断PD-1和VEGFR 2对野生型小鼠的治疗效果。虽然单用抗pd-1或抗VEGFR 2阻断抗体可抑制小鼠的肿瘤生长和延长生存期，但与抗pd-1和抗VEGFR 2抗体联合治疗可进一步提高肿瘤生长和存活的疗效。 图8 H和I )。当我们检查肿瘤浸润OVA的表型时 257-264 (SIINFEKL)-特异性CD8 + T细胞、抗VEGFR 2处理后TOX表达明显降低(P<0.05)。 图8j )、pd-1、Tim-3、延迟-3和TIGIT(图1)。S21)，而抗PD-1治疗没有改变TOX的水平( 图8j )并增加Tim-3、延迟-3和TIGIT的表达(图1)。(第21段)。综上所述，我们的数据表明，联合靶向PD-1/PD-L1和VEGF-A/VEGFR 2轴有助于恢复精疲力竭的TIL，从而增强MSS CRC肿瘤的控制能力。
讨论 通过阻断pd-1/pd-L1轴来振兴肿瘤特异性T细胞的癌症免疫疗法已经成为转移性MSI CRC的一种治疗标准。 18 20 )。然而，构成大部分CRC患者的MSS CRC患者对PD-1阻断反应不佳，因此有必要采取其他策略来使这一组患者受益。在此，我们探索了CRC的免疫微环境，并将VEGF-A诱导的TOX作为MSS CRC T细胞衰竭的核心调节因子，证明了TOX抑制后耗尽的T细胞被激活。此外，我们在体外、体内和体内支持我们的发现，抑制VEGF-A/VEGFR 2信号减轻T细胞衰竭，并联合抗PD-1和抗VEGFR 2治疗提高抗肿瘤反应。总之，我们的研究提供了机制上的洞察力，可以通过阻断PD-1/PD-L1和VEGF-A/VEGFR 2通路来克服MSS CRC中抗PD-1无反应性的问题。
血管生成异常是各种癌症的主要特征，受多种促血管生成因子和抗血管生成因子的调节(34 )。其中VEGF-A是肿瘤微环境中血管生成的主要驱动因子。 35 37 )。VEGF-A除了在血管生成中发挥作用外，还参与抗肿瘤免疫应答；VEGF-A增强髓源性抑制细胞和调节性T细胞的免疫抑制活性。 38 39 )。此外，VEGF-A还能干扰CD8对肿瘤微环境的浸润。 + 小鼠肿瘤模型中的T细胞 40 41 )。然而，VEGF-A对人T细胞的直接作用及其机制尚未阐明。特别是，VEGF-A诱导的调节T细胞命运的转录程序在很大程度上是未知的.在本研究中，我们发现mss crc肿瘤微环境中丰富的VEGF-A能诱导pd-1和其他免疫检查点抑制受体在人CD8中的表达。 + T细胞，与以前的研究一致( 42 44 )。我们还证明，VEGF-A可诱导CD8中观察到的与衰竭相关的转录程序。 + 慢性LCMV感染时T细胞( 10 )。此外，我们的功能研究还表明，VEGF-A降低了细胞因子的产生和CD8的增殖。 + T细胞在抗原识别过程中。这些结果表明VEGF-A在MSS CRC肿瘤微环境中具有直接驱动T细胞衰竭的免疫抑制作用。
机制上，VEGF-A/VEGFR 2在T细胞中上调DNA结合因子TOX，这是抗原识别过程中耗竭特异性转录程序的机制。有几种转录因子与T细胞衰竭有关，包括T-bet( 45 )，Eomes( 46 )，TCF-1( 47 )，Blimp-1( 48 )，FoxO 1( 49 )，NFATC 1( 50 )，BATF( 51 )，以及MAF( 52 )。最近，帕拉松 等人 (53 低氧诱导因子-1α(HIF-1α)诱导肿瘤浸润T细胞表达免疫检查点共抑制受体.他们还表明，T细胞表达VEGF-A通过HIF-1α驱动的转录程序.其他人认为TOX与T细胞衰竭之间存在潜在的联系( 6 12 50 )，但这一关联的直接因果关系、分子机制和生物学意义尚未阐明。在目前的研究中，我们探讨了TOX在T细胞衰竭中的作用。siRNA介导的TOX基因敲除可逆转VEGF-A诱导的T细胞耗竭表型，提示TOX是介导VEGF-A诱导的T细胞衰竭的驱动因子。
毒性试验最初被认为是CD4发展所必需的一个因素。 + 胸腺T细胞( 54 )，但TOX也参与了固有淋巴细胞的发育( 55 )。最近，佩奇 等人 (56 )表明TOX参与微生物诱导的机体对宿主组织的自身免疫，提示TOX在CD8中的作用。 + T细胞在启动过程中。在目前的研究中，我们揭示了VEGF-A通过TOX上调在T细胞衰竭中的作用.VEGF-A介导的TOX上调不仅参与了多个检查点抑制受体的上调，而且还参与了CD8的耗竭相关转录变化。 + T细胞( 14 )。最近，在小鼠慢性病毒感染或肿瘤模型中，TOX在驱动T细胞衰竭方面发挥了关键作用。 57 61 )。TOX在T细胞介导的自身免疫中的相互冲突作用(英文) 56 )和T细胞衰竭( 57 61 )可以用TOX的上下文依赖性作用来解释，特别是关于T细胞分化状态和凋亡/存活信号。
为提高MSS CRC患者检查点阻断的疗效，我们检测了PD-1/PD-L1和VEGF-A/VEGFR 2联合阻断的抗肿瘤效果。在实验中使用肿瘤抗原特异性CD8 + 抗PD-1抗体与抗VEGFR 2抗体联合作用可增强T细胞的抗肿瘤活性.我们也证实了这一发现，使用了肿瘤浸润CD8的体内外检测法。 + 来源于MSS CRC的T细胞和体内同型小鼠模型。结合检查点阻断和VEGF-A/VEGFR 2阻断的近期临床试验显示了良好的临床活性。 62 65 )。随着这些令人鼓舞的结果，我们的研究有理由扩大临床试验，研究联合VEGF-A/VEGFR 2和PD-1/PD-L1阻断治疗顽固性实体肿瘤(如MSS CRC)的安全性和有效性。
总之，我们提出了VEGF-A在形成MSS CRC免疫微环境中的基本作用.据我们所知，这是首次研究血管生成因子VEGF-A与人T细胞在肿瘤微环境中的直接相互作用。我们的发现对MSS、CRC和其他抗PD-1耐药癌症的联合免疫治疗和靶标药物有潜在的指导意义。在更广泛的背景下，我们的结果表明，VEGF-A不仅通过其在血管生成中的既定作用，而且通过直接影响肿瘤微环境中的T细胞来促进肿瘤的进展。最后，我们的研究为合理设计针对VEGF-A/VEGR 2和PD-1/PD-L1通路的治疗策略提供了一个框架。
材料和方法 研究设计与病人 本研究旨在探讨CRC患者T细胞衰竭的机制。研究对象是151名接受治疗的前瞻性人群--那些在2016年5月至2018年10月期间接受手术切除的单纯CRC患者(表S3)。这项研究得到了机构审查委员会的批准，所有患者都提供了书面知情同意。
细胞株 CaCO-2细胞是从韩国细胞系银行购买的，并根据美国式培养建议在培养基中生长。在添加10%胎牛血清(Welgene)和1%青霉素/链霉素(Sigma)的RPMI 1640(Welgene)中培养MC 38-OVA细胞。用HLA-A*0201(+)供者外周血单个核细胞(PBMC)制备NY-ESO-1特异性CD8。 + T细胞CD8 + 用磁珠分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离T细胞。负载NY-ESO-1的藻红蛋白结合HLA-A*0201右旋体 157 - 165 用肽(SLLMWITQV)标记NY-ESO-1特异性CD8。 + T细胞将抗藻红蛋白微球(Miltenyi Biotec)经磁分离得到阳性选择。纯化的NY-ESO-1特异性CD8 + 在含抗CD3抗体(50 ng/ml)、IL-2(200 IU/ml)、IL-7(10 ng/ml)和IL-15(100 ng/ml)的RPMI 1640中，用照射自体PBMCs扩增T细胞。NY-ESO-1特异性CD8的纯度研究 + T细胞维持在95%以上。
动物 C57BL/6J小鼠是从杰克逊实验室购买的。将携带VEGFR 2基因的C57BL/6J小鼠与C57BL/6J LCK-CRE小鼠杂交，实现T细胞特异性基因缺失。
样品制备 采用淋巴细胞分离培养基密度梯度离心法(Corning)获得人外周血淋巴细胞。采用MACS C-管(Miltenyi Biotec)机械解离法和肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)酶法分离人正常癌旁粘膜和肿瘤组织中的单个细胞。肿瘤浸润CD8 + 用CD8微球(Miltenyi Biotec)从单细胞分离物中分离纯化T淋巴细胞。采用Macs C-管(Miltenyi Biotec)机械分离法从小鼠肿瘤组织中分离单个细胞，用Percoll-Paque(GE Healthcare)密度梯度离心法分离单个细胞。
MSI分析 用MiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒(Takara)从福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织中提取DNA并进行扩增。贝塞斯达微型卫星小组( BAT 25 , BAT 26 , MFD 15 , D2S123 ，和 D5S346 )用于标识MSI状态。MSI-H被定义为至少存在两个MSI标记.单个不稳定标记的存在和不稳定标记的缺失被归类为微卫星稳定(MSS)CRC。
免疫组织化学 手术切除的肿瘤切片按照制造商的指示使用自动染色平台(Ventana Benchmark XT自动染色系统，Ventana医疗系统)进行染色。用二甲苯和乙醇溶液对组织块的4-μm厚切片进行分离和再水化处理.抗原提取用细胞调理液(CC1；Ventana医疗系统)进行。组织切片随后与原抗体孵育。在使用UltraView通用民建联检测试剂盒(Ventana Medical Systems)进行显色显示后，用苏木精和盖层滑脱。阳性和阴性对照同时染色，以验证染色程序。测量CD3 + 或CD8 + T淋巴细胞密度，用VENTANA iScan HT玻片扫描仪(Ventana Medical Systems)扫描(放大×200)。用VENTANA Virtuoso数字病理图像分析软件Version 5.3(Ventana Medical Systems)对数字幻灯片进行分析，避免出现质量不高的区域，以防止扫描错误。ImageJ平台的小区计数器插件( http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html )每平方毫米染色阳性细胞数。浸润边缘TILs以10场(放大倍数，×200)计数的浸润前沿染色淋巴细胞数计算，但有粉碎性伪影或坏死的肿瘤区域除外。以肿瘤中心5~10个野(放大倍数，×200)为染色淋巴细胞数，测定肿瘤中心TILs。用VEGFH评分定量表达VEGF-A( 30 )。通过计数CD 31阳性微血管，测量侵犯前高血管化区的血管密度。确定了三个场的平均值(放大倍数，×200)。标本由Severance医院的肝癌标本库/基因库提供。用于免疫组织化学的抗体详见表S4。
流式细胞术 采用活/死固定死细胞染色试剂盒(Invitrogen)排除死细胞。检测NY-ESO-1或巨细胞病毒pp 65-特异性CD8 + T细胞，细胞经藻红蛋白结合HLA-A*0201-限制性右旋糖酐染色，特异性为NY-ESO-1。 157 - 165 (SLLMWITQV)或CMV pp 65 495 - 503 (NLVPMVATV)室温作用20 min。表面蛋白在4℃用荧光标记抗体染色30 min，细胞内染色，细胞渗透固定于FoxP 3染色缓冲液试剂盒(Thermo Fisher Science)，再用荧光标记抗体染色。为了检测抗PD-1封闭抗体(克隆EH12.2H7，小鼠IgG 1同型)体外处理后的人PD-1，我们首先用克隆的EH12.2H7对PD-1进行染色，然后用荧光标记的抗小鼠IgG 1抗体作为二次抗体进行染色。所有的流式细胞术分析用LSRⅡ型仪器(BD生物科学)进行，数据用Flowjo软件(Treestar)进行分析。用于流式细胞术的抗体详见表S4。
TCGA数据分析 来自TCGA的RNA-seq数据来源于Firebrose(宽带研究所)。原木 2 比较MSS和MSI CRC患者的RPKM+1值。每个样本的免疫亚型根据先前的研究进行分类( 29
增殖和细胞因子分泌试验 为了评估细胞增殖，我们根据制造商的指示，使用CellTrace Violet细胞增殖试剂盒(ThermoFisher Science)对细胞进行染色。用细胞微量紫(5μM)在室温下孵育20 min，用胎牛血清加磷酸盐缓冲液冲洗。采用平板结合抗CD3抗体(1μg/ml；Miltenyi Biotec)或SIINFEKL肽(10μg/ml)刺激T细胞。84h后取细胞，流式细胞仪检测细胞微量紫的稀释度。增殖评分的计算方法是平均反应细胞的分裂数，并按百分比表示。用平板结合抗CD3抗体(1μg/ml；Miltenyi Biotec)或SIINFEKL肽(10μg/ml)刺激T细胞分泌细胞因子。培养24h后，分别加入brefeldin A(GolgiPlug，BD生物科学)和monensin(GolgiSTOP，BD生物科学)。12h后取细胞，流式细胞仪检测细胞因子的生成。用抗人pd-1抗体(10μg/ml，EH12.2H7)，抗人VEGFR 2抗体(10μg/ml，7D4-6)，抗人VEGF-A抗体(10μg/ml，a15136B)或小鼠IgG同工型对照(10μg/ml，mopc-21)阻断pd-1或VEGFR 2/VEGF-A。
酶联免疫吸附试验 采用人VEGF-A型定量ELISA试剂盒(R&D系统)，根据制造商的指示，测定大肠癌患者血浆和肿瘤组织中VEGF-A的浓度。为测定组织匀浆中VEGF-A的含量，以1%蛋白酶抑制剂为缓冲液，用Precellys裂解试剂盒对150 mg肿瘤组织进行1 0 0%蛋白酶抑制剂缓冲液，离心获得上清液。
RT-PCR 用RNeaseMini试剂盒从细胞中提取总RNA。根据制造商的指示，利用Legene cDNA合成主混合物(Legene Bioscience)从总RNA中合成互补DNA。Polymerase chain reactions was performed with specific primers for VEGFR1(forward：5′-TCCTTTGGATGAGCAGTGTG-3′，reverse：5′-AGCCCCTCTTCCAAGTGATT-3′)，VEGFR2(forward：5′-CCAGTCAGAGACCCACGTTT-3′，reverse：5′-TCCAGAATCCTCTTCCATGC-3′)，andβ-actin(forward：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，reverse：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′)using the following cycle conditions：30 s at 95°C，30 s at 95°C，and 30 s at 72°C.Amplification was carried out for 30 cycles and the product exposed to gel electrophoresis with SYBR(Invitrogen).用紫外光照射观察扩增DNA的存在。应用生物系统技术检测组织匀浆中CTAG1B和β-actin的表达水平。
RNA测序 用TRIZOL试剂(ThermoFisher Science)从细胞中提取RNA。用Agilent 2100生物分析仪分别用Agilent技术(Agilent Technologies)和Nd-2000分光光度计(Thermo Fisher Science)评价RNA的质量和数量。根据制造商的指示，使用QuantSeq 3‘mRNA-Seq Library Prep Kit(Lexogen)构建库。简单地说，每组总RNA的长度为500 ng，并在其5‘端含有一个与光照相容的序列的寡核苷酸(oligo-dt)引物与RNA杂交。然后进行反转录。RNA模板降解后，第二链合成由一个随机引物启动，该引物含有一个与光照相容的连接子序列，位于其5‘端。利用磁珠纯化双链文库，去除所有活性组分。该库被放大，以添加集群生成所需的完整适配器序列。从PCR组分中分离得到完整的文库。用NextSeq 500(Illumina)进行单端75测序.使用Bowtie 2对QuantSeq 3‘mRNA-Seq读码进行比对。Bowtie 2指数是从基因组组装序列或具有代表性的转录序列中产生，以与基因组和转录体相一致。对齐文件用于汇编记录本和Edger处理数据。差异表达的基因是根据独特的和多重排列的计数来确定的。差异表达基因以错误发现率<0.05和绝对倍数变化>2来定义。每个GSEA都指定了一个标准化的富集评分(NES)。
siRNA转染 对照组或TOX特异性siRNA(Thermo Fisher Science)用霓虹灯转染技术(LifeTechnologies)转染。2 0 0 0V下用2 0 0 0nm siRNA转染10 ms，共3脉冲。用平板结合抗CD3抗体(1μg/ml；Miltenyi Biotec)刺激T细胞24h，以提高转染前的转染效率。
H3K27ac芯片-seq分析 我们用芯片seq来描述h3赖氨酸27乙酰化(H3k27ac)在对照sirna和TOX sirna转染的原始c8s中的基因组全貌。 + 抗CD3和VEGF-A治疗后的T细胞。细胞在25°C下与1%甲醛交联10 min(磷酸盐缓冲液，1%胎牛血清，pH 7.4)，加125 mm甘氨酸，25℃旋转培养5 min，冰孵育15 min。用蛋白酶抑制剂将细胞悬浮在SDS裂解缓冲液(1%SDS，50 mm-HCl，pH8.0，10 mmEDTA)中。通过超声作用获得单核和双核小体大小的染色质。用H3K27ac抗体(活性基序)和蛋白质珠(热费舍尔科学)在4℃旋转培养4h。对染色质-抗体珠复合物进行了不同盐浓度的连续洗涤，并对所用抗体进行了优化。免疫沉淀复合物经RNaseA(奇根)处理后，在68°C下进行反向交联，用AMPure XP微球(贝克曼库尔特)回收免疫沉淀DNA，并按制造商的指示用NEBNext Ultra II DNA文库预试剂盒(NEB)制备芯片-seq库。芯片-seq库使用IlluminaNextseq 550平台进行测序.利用BWA-mem(VER)将测序后的DNA读序列定位到人类参考基因组(Hg 38).0.7.17，“-M”选项)。去除低排列质量(MAPQ<10)的读片，用Picard丢弃PCR重复序列。芯片峰值，相对于输入，是使用具有截止值的Mac来识别的( P < 10–5 )和狭窄的峰值选择。差异峰是用荷马“MergePeaks”和“-d给定”选项来识别的。
共培养实验 根据制造商的指示，用PKH 26染料(Sigma-Aldrich)标记靶细胞，以评估体外细胞毒性。用10μg/ml的NY-ESO-1脉冲处理。 157 - 165 肽(SLLMWITQV)在5%CO中37°C作用1h 2 孵化器。NY-ESO-1-特异性CD8 + 在有抗PD-1抗体、抗VEGFR 2抗体或IgG亚型对照的情况下，加入T细胞(效应细胞：靶标比4：1)。取细胞，用to-pro-3染料(Thermo Fisher Science)染色，6小时后检测死亡靶细胞。细胞内细胞因子染色：在培养物中加入brefeldin A(GolgiPlug，BD生物科学)和monensin(GolgiSTOP，BD生物科学)。将来源于CaCO-2 MSS CRC细胞的VEGF-A富集培养基加入到共培养物中，作为条件培养基。
体内实验 实验采用6周至8周龄雌性小鼠。同基因MC 38-OVA细胞(1.0×10) 6 细胞)经皮下注射接种于右侧。肿瘤接种后2周处死小鼠进行TILs分析。肿瘤接种后2周开始用抗PD-1抗体(RMP 1-14)、抗VEGFR 2抗体(DC 101)或大鼠IgG亚型对照(2A3)治疗。在T细胞耗竭研究中，抗CD3抗体(145-2C11)在肿瘤接种前3天连续注射三次。当肿瘤体积超过3000 mm时，对小鼠进行安乐死。 3 ...所有活体实验均经KAIST动物保护委员会批准。
统计分析 采用GraphPad棱镜(GraphPad Software)或R软件(R统计计算基金会)进行统计分析。成对或未配对 t 用试验对连续变量进行比较。χ 2 采用检验方法对定性变量进行比较。采用Pearson或Spearman相关分析评价各参数间的相关性。单尾费舍尔精确检验用于评估不同群体间重叠基因的显着性，而对数秩检验用于比较生存结果。意义被确定为 P < 0.05.
