除了抗原驱动的信号外，T细胞还需要共同刺激信号才能有效激活.包括肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员在内的几种受体可以向T细胞传递共刺激信号.硫氧还蛋白(TXNIP)是葡萄糖摄取和细胞增殖的重要抑制因子，但TXNIP在T细胞中的调控机制尚不清楚。本研究的目的是检测TXNIP在人T细胞中的表达水平及其调节作用。我们发现天真的T细胞表达高水平的TXNIP，用TNF治疗血样会导致T细胞中TXNIP的快速下调。TNF诱导的TXNIP下调与葡萄糖摄取增加有关.此外，我们发现密度梯度离心(DGC)诱导TXNIP的下调.我们证明DGC诱导TNF的产生与TXNIP的下调是平行的.TLR配体可诱导TNF产生，TXNIP下调，提示DGC过程中释放的损伤相关分子模式(如内源性TLR配体)在DGC诱导的TXNIP下调中起一定作用。最后，我们证明TNF诱导的TXNIP下调是依赖于caspase活性，是由caspase介导的TXNIP断裂所致。

T细胞在静息状态下循环身体，直到识别特定的抗原/MHC复合物。为了充分激活和增殖，天真的T细胞除了需要抗原驱动的信号外，还需要共同的刺激信号。许多共刺激受体已经被描述在T细胞上。1...肿瘤坏死因子受体1(tnfr 1，cd120a)和tfr 2(Cfr 2)均能作为共刺激受体，因此，肿瘤坏死因子降低了抗原驱动的T细胞活化的阈值，增加了人和小鼠T细胞的增殖和存活。2,3,4,5,6,7,8...虽然肿瘤坏死因子通过增加NFκB信号通路的激活来介导其共同刺激作用，但其他机制也可能参与其中。9...静止T细胞代谢需求低，主要依赖氧化磷酸化。当T细胞被激活时，就会大量增殖和分裂，从而极大地增加了它们的代谢需求。增加的代谢需要通过葡萄糖转运蛋白的上调和葡萄糖摄取的显著增加以及代谢从主要的氧化磷酸化向有氧糖酵解的转变来满足。10,11,12...高糖摄取在活化的T细胞中是必不可少的，因为它提供了增殖和克隆扩张所需的能量和积木。事实上，有限的葡萄糖利用率可以阻止T细胞的增殖和存活，使G细胞停滞。1细胞周期13,14，制备葡萄糖摄取和利用潜力免疫调节靶点。15.

硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)16，又称维生素D上调蛋白-1(VDUP-1)。17或硫氧还蛋白结合蛋白-2(TBP-2)18，是一种在细胞代谢、生长、分裂和凋亡等细胞过程中起关键作用的蛋白质。19,20...TXNIP通过抑制细胞摄取葡萄糖的能力，调节细胞的代谢和分裂。21,22,23,24...此外，TXNIP还能稳定CDK抑制剂p16和p27，从而抑制细胞分裂，使细胞保持在G内。125,26...这些观察将txnip置于细胞周期抑制剂的范畴，这一作用得到了研究的支持，研究表明txnip下调是细胞分裂所必需的。27,28，而TXNIP起着抑癌作用。19,29,30,31...TXNIP的表达在转录水平上受到多个转录因子的强烈和强烈的调控，包括Mondoa、MLX、FOXO 1和ChREBP。32...有趣的是，促炎因子下调巨噬细胞中的TXNIP。33，肿瘤坏死因子(TNF)诱导A 549、HeLa和NIH3T3细胞TXNIP的快速下调。30,33,34.

在以前的研究中，我们发现谷胱甘肽和硫氧还蛋白是最佳T细胞活化所必需的。35,36...结合TXNIP结合抑制硫氧还蛋白还原酶活性的观察37表明TXNIP在调节T细胞反应中起重要作用。然而，很少有研究涉及TXNIP在T细胞中的作用。一项研究表明，TXNIP在天真的人T细胞中高水平表达，并在通过T细胞受体激活的T细胞中被下调。27...此外，对感染人T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)的T细胞的研究表明，TXNIP抑制细胞分裂，而从IL-2依赖性转化为独立于IL-2的细胞分裂与TXNIP丢失有关。25,38...txnip敲除小鼠的T细胞分化能力强于野生型小鼠T细胞，txnip敲除小鼠肠道淋巴浸润增加，说明T细胞调节失调。39,40...本研究的目的是检测TXNIP在人T细胞中的表达水平及其调节作用。

在这里，我们提供了第一个证据，TNF诱导了TXNIP的快速下调，同时增加了天真T细胞对葡萄糖的摄取。重要的是，TNF诱导的TXNIP下调几乎完全被caspase抑制剂Z-VAD-FMK所阻断，这可能是caspase介导的TXNIP断裂的机制之一。此外，密度梯度离心(DGC)纯化T细胞可能是由于损伤相关分子模式(DAMP)的释放，导致TNF和其他促炎细胞因子的分泌，导致T细胞TXNIP的下调。综上所述，我们的数据显示TXNIP在幼稚的T细胞中强烈表达，但被TNF迅速下调，这表明TNF可能通过诱导TXNIP的下调而成为T细胞的共同刺激分子。

TNF诱导TXNIP下调及增加T细胞葡萄糖摄取

以往的研究发现，肿瘤坏死因子能诱导巨噬细胞和细胞系中TXNIP的下调。30,33,34，txnip是葡萄糖摄取、肿瘤细胞增殖和细胞周期进程的抑制剂。26,30,31,41...为了确定TNF是否影响人T细胞中TXNIP的表达，我们从健康供体中纯化T细胞，在没有TNF或TNF存在的情况下孵育4h，再用westernblot方法检测其TXNIP表达水平。令我们惊讶的是，与T细胞独立于TNF孵育4h相比，T细胞孵育4h后TXNIP明显下调(图1)。1A)。为了验证这一观察，我们纯化了T细胞，并将它们分成两个等份样本。一个样品被立即溶解(0h)，而另一个则被孵育4h(4h T细胞)，而没有任何其他的处理(见图1)。1B有关研究中使用的不同隔离和孵化程序的详细概述)。再次，我们发现TXNIP在纯化的T细胞孵育4h后明显下调(如图所示)。1C)。在纯化T细胞的分离过程中，先用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后从PBMC中分离T细胞。为了确定TXNIP下降的起始点，我们将新鲜抽取的血样分成三个等份。第一部分立即分离和裂解T细胞(0h)，第二部分血液孵育4h后分离和溶解T细胞(4h)，从第三部分分离PBMC，然后孵育4h后纯化和裂解T细胞(4 H PBMC)。有趣的是，我们发现未经处理的血液孵育4h并不影响TXNIP水平。1D，0h对4h血)。然而，在纯化T细胞之前，PBMC孵育4h后，TXNIP几乎完全消失(见图)。1D，4 h PBMC)。从这些观察中我们得出结论，PBMC的纯化可促进T细胞TXNIP的下调，TNF对T细胞TXNIP表达的影响应通过与TNF共同孵育处理后的血样来确定。有趣的是，我们发现用TNF治疗未经处理的血液会导致TXNIP在T细胞中的下调(如图所示)。1E)。为了进一步确定TNF的作用，我们用高浓度的TNF处理血液4h，然后纯化T细胞并测定TXNIP的表达水平。我们发现TXNIP的表达甚至在最低浓度的TNF检测时也明显下调(如图所示)。1F)。先前的研究表明TXNIP可以通过抑制T细胞摄取葡萄糖的能力来调节T细胞的代谢和分裂。21,22,23,24...为了确定TNF介导的TXNIP下调是否影响T细胞的葡萄糖摄取，我们用荧光葡萄糖类似物2-NBDG在没有TNF或TNF存在的情况下与血样孵育4h，然后用流式细胞仪测定T细胞对2-NBDG的摄取。我们发现TNF对2-NBDG的摄取有明显的上调作用。1g，H和补充图。2).

TNF诱导TXNIP下调，增加T细胞对葡萄糖的摄取.(A)TxNIP的代表Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为加载控制，T细胞分离后立即溶解(0h，步骤I，B)和孵育4小时后(4小时T细胞，程序I，B)TNF(0~1000 ng/ml)。(B)不同的T细胞分离和孵育程序概述。红框中的文字给出了在图中分析和显示的T细胞溶解物的命名。(C)TxNIP的代表Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为T细胞的负载对照，孵育0小时(程序I，0 h)，B)和4小时(4小时T细胞，程序I，B)松解前。(D)TxNIP的代表Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为加载对照，立即从T细胞中分离和溶解(0h，步骤I，B)，在血液样本孵育4小时后分离并溶解(4小时血液，程序II，B)，并在PBMC孵育4小时后分离和溶解(4 h PBMC，步骤III，B). (E)TxNIP的代表Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为负载对照，从血液中分离出T细胞，孵育4h(血液4 h，程序II)，B)在不存在(−)或存在(+)的情况下(10 ng/ml)。(F)TxNIP的代表Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为负载对照，从血液中分离出T细胞，孵育4h(血液4 h，程序II)，B)与指示浓度的TNF。(F)代表FACS直方图和(G)2-NBDG的相对平均荧光强度+从2-NBDG(2-NBDG)不存在(−)或存在(+)肿瘤坏死因子(10 ng/ml)的血液中分离出T细胞，作用4h(血液4 h，程序II)，B)(均值+扫描电镜，n=3)。(阿-法每个westernblot代表至少3个不同生物学实验获得的Westernblots，定量显示至少3个不同生物学实验得到的Westernblots TXNIP带密度的平均值+SEM。在每个蛋白质印迹的右边分别给出了相关分子质量标记的位置及其在kDa中的相对分子质量。

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这些结果表明，TNF诱导T细胞TXNIP下调，TNF诱导TXNIP下调与T细胞葡萄糖摄取增加有关。此外，数据表明，DGC启动TXNIP的下调是独立于TNF预处理的.由于DGC纯化PBMC是大多数人类T细胞研究的关键步骤，因此了解该纯化过程是否及如何影响PBMC的作用是十分重要的。

DGC诱导T细胞TXNIP下调

为了确定T细胞分离过程中引起TXNIP快速下调的机制，我们仔细观察了T细胞分离过程的各个步骤。和许多其他实验室一样，我们从PBMC分离开始，将稀释在PBS中的肝素血液分层在密度培养基上，然后离心。我们经常使用密度介质LymphopreppTM...我们随后通过负选择从PBMC中分离出所需的细胞，这里是T细胞。简而言之，这涉及到将磁珠耦合到不需要的细胞，然后将细胞悬浮在磁铁中。多余的细胞被磁铁所束缚，从而能够隔离所需的、未接触的T细胞。从上面的结果，我们知道简单的抽吸和孵育血液并不会导致TXNIP下降(如图所示)。1D，0h对4h血)。细胞在DGC隔离过程中暴露于强大的离心力中。为了检验离心力引起的生理压力是否导致TXNIP下降，我们将血样分为两部分。其中一部分在没有密度梯度培养基的情况下离心培养4h，以模拟细胞在DGC分离过程中暴露的离心力，另一部分仅在不离心的情况下孵育4h。我们发现离心不影响T细胞中TXNIP的表达水平。2A)，表明TXNIP的下调不是由普通离心引起的物理应激所致。

DGC诱导T细胞TXNIP下调。(A)以CD3ζ为负载对照的血栓素NIP的代表性Westernblot(下面板)和定量(上面板)，将T细胞孵育4h(4 h血，程序II，图2)。1B)不经处理(−)或离心(+)。(B代表TxNIP的Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为负载对照，立即从T细胞中分离和溶解(0h，过程I，图1)。1B)，分离培养4h后裂解(4 h T细胞，程序I，图1)。1B)，在PBMC孵育4h后分离和溶解(4 h PBMC，步骤III，图1)。1B)DGC对Lymphoprepp、组织不透明或Ficoll-Paque的指示。(C)以CD3ζ为负载对照的血栓素NIP的代表性Westernblot(下面板)和定量(上面板)，将T细胞孵育4h(4 h血，程序II，图2)。1B)没有添加(控制)或与Lymphoprepp，组织不透明或Ficoll-Paque的指示。(D)不同T细胞的分离和孵育过程概述。红色框架中的文本给出了所使用的程序和T细胞裂解物的命名，分析和显示在(e)4至9车道(E代表TxNIP的Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为负载对照，立即从T细胞中分离和溶解(通道1：0 h，过程I，图1)。1B第4车道：单核细胞耗竭，0h，程序IV，(d)第7车道：T细胞浓缩，0h，程序VI，D)，分离并孵育4小时后裂解(莱恩2：4 h T细胞，程序I，图1)。1B第5道：单核细胞耗竭，4h T细胞，程序IV，(d)第8道：T细胞富集，4h T细胞，程序VI，D)，并在PBMC孵育4h后分离和溶解(RAY 3：4 h PBMC，步骤III，图1)。1B第6条：单核细胞耗竭，4小时多溴MC，程序V，D或T细胞持续5h(RAY 9：T细胞富集，5h T细胞，程序VI，D). (A-C,E每个westernblot代表至少3个不同生物学实验获得的Westernblots，定量显示至少3个不同生物学实验得到的Westernblots TXNIP带密度的平均值+SEM。在每个蛋白质印迹的右边分别给出了相关分子质量标记的位置及其在kDa中的相对分子质量。

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因为我们的观察表明TXNIP的下调并不仅仅是由细胞的离心引起的，而是由细胞在密度介质Lymphoprepp上的离心引起的。TM，我们接下来想确定txnip下调是否专门用于处理lymphoprepp上的细胞。TM或者是DGC的共同后果。因此，我们将血液样本分成三部分，并在三种不同的密度介质(即Lymphoprepp)上进行离心。TM，组织不透明®-1077，和Ficoll-PaqueTM分别。在每种密度培养基上离心获得PBMC，分为三部分。从一个部分，T细胞立即被分离和溶解(图)。2B第二部分，立即分离T细胞，在37℃下孵育4h(见图)。2B，4h T细胞)。第三部分PBMC在T细胞分离和裂解前孵育4h(见图)。2B，4 h PBMC)。TXNIP在所有密度介质中的表达规律相同。纯化后直接溶解的T细胞中可见TXNIP。2B，0h，在T细胞裂解前4小时内明显下调(如图所示)。2B从PBMC中分离出的T细胞孵育4h，几乎检测不到。2B，4 h PBMC)。为了排除TXNIP下调的可能性，我们将血样分成4部分，用不同类型的密度培养基孵育4h。没有一种密度介质仅仅通过在血样存在的情况下孵育血样而引起TXNIP的下调(图一)。2C).

总之，血液离心和血液与密度介质的物理接触都不足以导致T细胞TXNIP的下调。然而，两次血液离心的结合在……上面密度梯度介质诱导TXNIP下调。由于在3种不同的密度介质中观察到了这种效应，我们得出结论：用DGC从人血中分离PBMC时，T细胞中TXNIP的下调是一种普遍现象。

为了寻找另一种不引起TXNIP下调的T细胞纯化程序，我们从干细胞中检测了RosetteSep™人单核细胞耗竭鸡尾酒(单核细胞耗竭)和RosetteSep™人T细胞浓缩鸡尾酒(T细胞富集)。在单核细胞耗竭过程中，全血与单核细胞上识别CD 36的四聚体抗体复合物和红细胞上的糖蛋白A共同孵育。当随后在密度培养基(如Lymphoprepp)上离心时，单核细胞与红细胞和粒细胞一起，导致PBMC中的单核细胞减少。同样，在T细胞浓缩过程中，全血与识别非T细胞和糖蛋白A的四聚体抗体复合物的混合物共同孵育，当随后在密度培养基上离心时，非T细胞颗粒连同红细胞和粒细胞一起导致PBMC中的非T细胞减少。经经典DGC离心后获得的PBMC和利用单核细胞耗竭和T细胞富集鸡尾酒联合DGC分离得到的细胞分为三部分(见图4)。1B和二维空间关于所用程序的详细概览)。从一个部分，T细胞立即被分离和溶解(图)。2E从第二部分开始，立即分离T细胞，在37℃下孵育4次。2E，4h T细胞)。第三部分PBMC和用单核细胞耗竭鸡尾酒获得的细胞在T细胞分离和溶解前孵育4h(见图)。2E，4 h PBMC)。第三部分T细胞浓缩鸡尾酒培养5h，再裂解T细胞(图1)。2E，5h T细胞)。所有测试过程的TXNIP表达模式相同。因此，三种方法分离后的T细胞均可见明显的TXNIP，而T细胞孵育4、5h后TxNIP的表达明显下降。同样，单核细胞的耗竭并没有减少PBMC孵育4h后T细胞中TXNIP的消失(见图)。2E)。因此，我们无法确定T细胞纯化过程中没有引起T细胞TXNIP下调的过程，支持在未处理的血液样本中研究TXNIP在T细胞中的作用。

DGC和TLR激动剂诱导T细胞产生TNF和TXNIP下调

由于TNF诱导TXNIP下调，我们决定在DGC分离的PBMC上清液中检测到TNF。因此，我们在DGC后将PBMC孵育0~4h，然后测定T细胞培养上清液中TNF和TXNIP的表达水平。孵育1h后，上清液中可明显检测到TNF，TNF浓度随时间的增加而增加，与TXNIP表达的降低有关(图一)。3A，B).

DGC和TLR激动剂诱导T细胞产生TNF和TXNIP下调.(A)TNF在PBMC上清中孵育0~4h(平均+SEM，n=3)。(B)以CD3ζ为负载对照的TXNIP的代表性Westernblot(下面板)和定量(上面板)，将T细胞孵育0~4h。(C)TxNIP的典型Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为负载对照，以TLR 1-5配体(TLR 1/2，500 ng/ml PamCSK 4；TLR 2，1×10)作为负载对照。8热杀单核细胞增生李斯特菌TLR3HMW，5g/ml PolyI：C；TLR3LMW，5g/ml Poly(I：C)低分子量；TLR 4，500 ng/ml大肠杆菌K12 LPS；TLR 5，500 ng/ml[医]斑疹伤寒菌鞭毛素)4小时(血液4小时，程序II，图1)。1B)如所示。(D)TNF与上述TLR 1-5配体孵育4h(4h血，程序II，图1)。1B)如所示。(E)TNF在血液培养上清中孵育0~4小时，不加白柱，不加TLR 4配体(50 ng/ml)(黑柱)。(F代表TXNIP的Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为负载对照，以TLR 4配体(50 ng/ml)处理的T细胞为载体，在不存在或存在TNF抑制剂依那西普(10 g/ml)和英利昔单抗(10 g/ml)作用4h(血液4 h，程序II，图G)。1B)如所示。(G)CD 25的频率+未处理血中T细胞、OKT 3(100 ng/ml)、TNF(10 ng/ml)、TNF抑制剂依那西普(10 g/ml)和英利昔单抗(10μg/ml)作用72h。数据显示，在9个不同供体的四个实验中得到了平均+扫描电镜。(B、C、F每个westernblot代表至少3个不同生物学实验获得的Westernblots，定量显示至少3个不同生物学实验得到的Westernblots TXNIP带密度的平均值+SEM。在每个蛋白质印迹的右边分别给出了相关分子质量标记的位置及其在kDa中的相对分子质量。

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研究表明，内源性TLR激动剂等阻尼物质可从损伤和死亡的细胞中释放出来。42,43,44，单核细胞和中性粒细胞在tlr激活后不久就能产生促炎细胞因子，如TNF。45,46...因此，如果DGC引起细胞损伤或死亡，则内源性TLR激动剂可激活血液中单核细胞、中性粒细胞和其他细胞类型的TLR。TLR信号可能通过细胞因子的产生导致TXNIP在T细胞中的下调.为了验证这一假设，我们在TLR激动剂1-5存在或未加入TLR激动剂的情况下，将血样孵育4h，然后检测T细胞中TXNIP的表达和上清液中TNF的表达。事实上，我们发现TLR 2，4和5激动剂诱导TXNIP下调(图1)。3C)与TNF的产生并行(图1。三维空间)。为了确定TLR激动剂在DGC后是否能以TXNIP的速度快速诱导TNF，我们将TLR 4激动剂与TLR 4激动剂孵育0~4h后，测定血标本上清液中TNF的含量。TLR 4激动剂已在1h诱导TNF产生(如图所示)。3E)进一步支持TLR诱导的TNF产生导致人血DGC过程中T细胞TXNIP下调的假说。为了进一步验证这一假设，我们在TNF抑制剂依那西普和英利昔单抗的存在下，用TLR 4激动剂或不含TLR 4激动剂的血液样品孵育4h。我们发现TNF抑制剂部分阻断了TLR诱导的TXNIP下调(图一)。3F)。这一观察证实，TLR诱导的TXNIP下调部分是由TNF介导的，但其他机制/细胞因子可能也参与了TLR诱导的TXNIP的下调，但未获得TNF抑制剂对TXNIP的完全抑制作用。

先前的研究表明，肿瘤坏死因子能够传递共同刺激信号，从而增强T细胞中CD 25的表达。2,4,5...为研究肿瘤坏死因子(TNF)是否能在全血中传递共刺激信号，我们单独或与TNF或TNF抑制剂依那西普(Etanercept)和英夫利昔单抗(IFliximab)联合孵育72小时，检测T细胞表达CD 25的频率。我们发现TNF与OKT 3联合作用可增加CD 25的表达。+T细胞约为CD 25的2倍。+单用OKT 3处理的T细胞。第三代).

TNF通过caspase依赖机制诱导TXNIP下调

肿瘤坏死因子(TNF)诱导的信号转导通路包括caspase的激活等。8,47,48,49...为了明确TNF诱导TXNIP下调的信号通路，我们在没有TNF或TNF存在的情况下，用不同的细胞信号抑制剂孵育血样。抑制p38、JNK、MEK、PI3K和IκB-α的抑制剂不影响TNF-诱导的TXNIP下调，而PA-caspase抑制剂Z-VAD-FMK完全阻断TNF诱导的TXNIP下调(图1)。4A和补充图。3)。理论上，TNF诱导的caspase激活可以通过caspase介导的转录因子的切割来抑制TXNIP的表达。50,51,52或通过caspase介导的TXNIP切割。以前的研究表明，肿瘤坏死因子(TNF)能抑制细胞内TXNIP的转录。30,33,34...然而，通过QPCR分析，我们发现TNF和Z-VAD-FMK并不影响T细胞中TXNIP的转录。4B)，表明参与TXNIP转录的转录因子不受激活的caspase的影响。相反，通过过量暴露Westernblots，我们在TNF处理的样品中发现了几条低分子带，而在对照样品或TNF+Z-VAD-FMK处理的样品中没有发现。4C)。这些条带很可能代表由caspase介导的TXNIP切割所产生的TXNIP片段.因此，使用Cascleave(http://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/index.html)和CasDB程序进行计算分析。53在TXNIP中发现了几个caspase切割位点，与图中观察到的片段大小一致。4C.

TNF通过caspase依赖性机制诱导TXNIP的下调.(A代表TxNIP的Westernblot(下面板)和定量(上面板)，以CD3ζ作为负载对照，从未经治疗的血液和血液中分离T细胞(10 ng/ml)和caspase抑制剂Z-VAD-FMK(Z-VAD)(10μg/ml)作用4h(4 h血，程序II，图G)。1B)如所示。Westernblot是从3种不同生物学实验中得到的Westernblots的代表，定量显示了3种不同生物学实验得到的Westernblots TXNIP带密度的平均值+SEM值。(B)TNF(10 ng/ml)和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK(10μg/ml)作用4h(4 H)的T细胞中TXNIPmRNA的相对表达，如图2所示。1B)如所示(平均值+扫描电镜，n=3)。(C)以CD3ζ作为负载对照，过量暴露TxNIP的Westernblot(10 ng/ml)和Z-VADFMK(10μg/ml)作用4h(4 h血，程序II，图1)。1B)如所示。箭头显示caspase介导的TXNIP片段及其分子量。(A，C)给出相关分子质量标记的位置及其在kDa中的相对分子质量，并给出每个westernblot的右边。

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在本研究中，我们发现TNF诱导人T细胞TXNIP的快速下调.txnip下调在T细胞中的潜在意义被强调，因为先前的研究表明txnip在其他类型的细胞中起着细胞周期抑制剂的作用，它需要被下调才能使细胞进入细胞周期。19,25,26,27...一些研究表明，肿瘤坏死因子可以降低抗原驱动的T细胞活化的阈值，提高人和小鼠T细胞的增殖和存活。2,3,4,5,6,7,8，提示肿瘤坏死因子通过增加NFκB信号通路的激活而介导这一效应。9...我们的研究表明，肿瘤坏死因子除了对NFκB信号通路有影响外，还可能通过下调TXNIP而发挥协同刺激分子的作用。在不同的细胞类型中，TXNIP被证明可以抑制葡萄糖的摄取。21,27,54,55,56，细胞在G中停滞1细胞周期如果没有足够的葡萄糖57,58...T细胞的活化高度依赖于葡萄糖的摄取。活化后1小时内T细胞葡萄糖摄取增加59，有限的葡萄糖利用率可以阻止T细胞的活化和增殖。14...我们发现TNF与TXNIP的下调同时，诱导了未经处理的T细胞的葡萄糖摄取增加。提示TNF协同刺激作用的机制之一可能是TNF诱导TXNIP下调引起T细胞葡萄糖摄取增加。很可能还有其他几种机制参与了肿瘤坏死因子的共同刺激作用，例如，如前面所述，CD 25的表达增强。2,4,5并由我们在目前的研究中。

我们进一步发现DGC诱导TXNIP下调。在3种不同密度培养基中观察到这一作用，表明TXNIP在T细胞中的下调是DGC诱导的一种普遍现象。其他研究表明，dgc可以通过调节T细胞上的粘附分子来影响细胞。60趋化因子受体在单核细胞和淋巴细胞上的内化61，L-选择素对淋巴细胞的抑制作用62，增加NK细胞趋化因子受体的表达63...然而，我们不知道以前的研究发现，如此迅速和明显的下调细胞内的蛋白质，如我们在这里。可以推测，在纯化过程中，密度介质可能会受到内毒素或其他物质的污染，从而影响细胞。但是，我们可以排除密度介质中含有直接诱导TXNIP下调的物质，因为血液与密度介质孵育本身并不能诱导TXNIP下调。血液常规离心也没有引起TXNIP的下调。只有联合离心对密度介质诱导TXNIP下降调节.此外，我们还发现，TLR 2、4、5种激动剂对血样的处理能快速诱导TNF产生，同时TXNIP也有下调作用。提示DGC可能导致细胞损伤，导致内源性TLR配体释放，导致TLR信号传导和TXNIP下调。据报道，单核细胞在tlr触发后不久就能产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)。45在DGC后不久，我们发现PBMC产生了大量的TNF。这与另一项研究相一致。另一项研究发现，由dgc分离的pbc可自发产生肿瘤坏死因子、白细胞介素1β和白细胞介素6。64...我们只能通过阻断TNF抑制剂英利昔单抗和依那西普的TNF信号来部分抑制TLR介导的TXNIP下调，提示除TNF外的其他细胞因子可诱导TXNIP下调。这与卡纳里的一项研究是一致的。等人发现肿瘤坏死因子和IL-1β均可诱导小鼠成纤维细胞株NIH3T3的TXNIP下调。33...我们的观察进一步证实了PBMC的分离和孵育诱导的TXNIP明显低于TNF治疗的血中TXNIP。此外，我们的研究表明，在DGC期间，TXNIP下调已经在T细胞中启动，因为我们不能通过单核细胞耗竭和T细胞富集鸡尾酒来阻止TXNIP的下调。虽然我们的数据强烈地指出DGC诱导的细胞因子的产生是TXNIP下调的主要引发因素，但我们不能从形式上排除这样的可能性：通过分离T细胞，我们去除了通常阻止TXNIP在T细胞中下调的因素。但TNF可诱导T细胞TXNIP的快速下调.一般认为DGC分离的T细胞不受程序的影响，相当于循环中的T细胞。然而，我们的数据表明，DGC会导致TXNIP下调，这可能会使T细胞启动并易于随后激活。这一点得到了以下观察的支持：DGC分离的PBMC中的T细胞可以被较低水平的CMV抗原激活，而不是全血中的T细胞。65...T细胞的纯化对作为TXNIP的中枢代谢调节因子有很大的影响，在研究T细胞的代谢和活化过程中可能需要考虑到这一点。离体.

根据我们的观察，先前的研究发现，TNF可以诱导txnip下调巨噬细胞和A 549、hla和nih3t3细胞的调节。30,33,34...然而，这些研究中描述的TXNIP下调的机制与我们的结果不同.然而我们发现TNF并没有影响TXNIP转录而引起txnip下调的caspase介导的切割，他们发现TNF抑制。TXNIP提示这可能是除增加TXNIP降解外的主要机制。这些相反的观察结果的一个解释可能是，我们的研究是在人类的原始T细胞中进行的，而不是在永生化细胞系中进行的。众所周知，硫氧还蛋白与TXNIP结合并保护其不被降解。28,66...与表达高水平硫氧还蛋白的永生化细胞系相比，天真的人T细胞不能在可检测的水平上表达硫氧还蛋白。36这意味着TXNIP在天真的T细胞中不受硫氧还蛋白的保护。

总之，本研究表明TXNIP在正常人T细胞中高表达，TNF诱导细胞内TXNIP迅速下调。进一步研究表明，DGC纯化PBMC可诱导T细胞产生TNF，降低TXNIP的表达。我们认为TXNIP的下调代表了细胞周期进程中几种刹车之一的释放，TXNIP的下调可能是TNF在T细胞中共同刺激作用的机制之一。

化学品

TNF(210-TA)来自R&D系统(英国Abingdon)、TLR1-5激动剂(tlrl-kit1hw)、SB 203580(tlrl-SB20)、SP 600125(tlrl-sp 60)、PD 98059(tlrl-pd98)、LY 294002(tlrl-ly29)、Bay11-7082(tlrl-b82)和Z-VAD-FMK(tlrl-vad)。从丹麦Herlev的Hovedstadens Apotek地区获得英利昔单抗和依那西普。有丝分裂性抗CD3单克隆抗体OKT 3(16-0037-85)来自美国热费舍尔科学公司。

细胞与细胞纯化

在获得知情的书面同意后，根据“赫尔辛基原则”关于涉及人类物体的研究宣言，从健康志愿者那里采集血样。这项研究得到了丹麦首都地区生物医学研究伦理委员会的批准(H-16033682)。血液中加入肝素(585679，利奥制药A/S，丹麦巴勒鲁普)。在某些实验中，血液在5%CO中37℃下孵育4h。2在进入DGC之前。对于DGC，血液在PBS+0.15%BSA中稀释1：1，然后在SepMate的密度培养基上分层。TM-50管(15460，干细胞)。密度培养基15 ml，稀释血液25 ml。除非另有规定，TM(1115758，轴-屏蔽)，管离心10分钟，在1200克，24°C与制动器按照制造商的指示。如有指示，组织不透明®-1077(10771，Sigma-Aldrich)或Ficoll-PaqueTM(GE17-5442-02，Sigma-Aldrich)在400 g，24°C下离心30 min，制动器按制造商的指示关闭。DGC后，将含PBMC的表层倒入PBS+0.15%BSA中稀释1：1，在350 g/24°C离心10 min后，再悬浮于PBS+0.15%BSA中，在300 g/24°C下离心10 min。在5×10浓度的PBS+0.5%BSA+1mm EDTA中，PBMC再悬浮于PBS+0.5%BSA+1mm EDTA中。7T细胞是直接从这个细胞悬液中分离出来的，或者是PBMC在37℃下在5%CO中孵育4小时。2，在进行T细胞分离之前。我们用阴性选择来纯化未接触的T细胞。加入50 L EasySep™人T细胞富集试剂盒(19051，Stemcell)，培养10 min，再加入50μl/ml磁性粒子，孵育10 min。加入PBS+0.5%BSA+1mmEDTA，将总体积增加到5ml，放置在磁铁(18001，Stemcell)中10 min。在磁铁中孵育后，液体被倒入第二管。将第一管中剩余的微球和细胞再悬浮于5 ml PBS+0.5%BSA+1mm EDTA中，再放入磁铁中10 min，再倒入第二管。第二管，现在含有10毫升，然后放置在磁铁10分钟，最后倒出液体含有所需的细胞。所有培养步骤均在室温下进行。用该方法可获得90%以上的T细胞纯度。作为T细胞分离的替代方法，我们根据制造商的指示测试了RosetteSep人T细胞富集鸡尾酒(15061，Stemcell)和RosetteSep™人单核细胞耗竭鸡尾酒(15668，Stemcell)。当使用单核细胞耗竭鸡尾酒，T细胞随后被浓缩使用EasySep™人类T细胞富集试剂盒如上所述。在所有的分离程序中，纯化的细胞被重新悬浮在X体内的15种培养基中(1041，Lonza，Verviers，比利时)，并放置在24井板(142475，热费舍尔科学，罗斯基尔德，丹麦)。细胞在37℃5%CO中孵育2...在TLR激动剂的实验中，最终浓度为500 ng/ml PamCSK 4(TLR 1/2激动剂)，1×10。8热杀单核细胞增生李斯特菌/ml(TLR 2激动剂)、5g/ml聚(I：C)高分子量(TLR 3)激动剂HMW、5g/ml Poly(I：C)低分子量(TLR 3)激动剂LMW、500 ng/ml大肠杆菌K12 LPS(TLR 4激动剂)和500 ng/ml[医]斑疹伤寒菌鞭毛素(TLR 5激动剂)。

Westernblot

Westernblot分析是按前面所述进行的。35,36...总之，用蛋白酶/磷酸酶抑制剂Cocktail(5872 S，细胞信号转导)在1%TritonX-100裂解缓冲液中裂解细胞。松解术前，细胞计数及调节，使细胞数为1×10。6每个通道都装上了细胞。样品在10%的聚丙烯酰胺凝胶上运行。将这些蛋白转移到乙酰胆碱ECL硝基纤维素片(RPN2020D，GE Healthcare，Brondby，丹麦)。在检测特异性抗体前，根据特异蛋白的分子量进行切割，最后用ECL技术(RPN 2232，GE Healthcare)进行可视化。对于波段密度量化，在Bio-Rad的ChemiDoc MP成像系统中，对ECL曝光片进行了分析。主要抗体包括小鼠抗TXNIP抗体(1：1000)(K 0205-3，MBL/医学与生物实验室)和小鼠抗CD3ζ(1：2000)(6B10.2，圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，加利福尼亚州)。第二抗体为HRP结合多克隆兔抗小鼠Ig(1：2000)(P 0260，DAKO，Glostrup，丹麦)。在我们手中，CD3ζ是T细胞数量的最佳控制，因为T细胞活化或分化对CD3ζ表达没有显著影响67,68,69或本论文所用的实验程序(附图)。1)。图中的Westernblots代表了至少3个不同的生物学实验得到的Westernblots，而TXNIP带密度的定量数据来自至少3个不同的生物实验。

流式细胞术和葡萄糖摄取分析

流式细胞术检测抗体为CD3-APC(300412，Biolegend，San Diego，CA，USA)，CD4-PE(555347，BD生物科学，富兰克林湖，NJ，美国)，CD8-FITC(555366，BD生物科学)和CD 25-PE-Cy7(302612，Biolegend)。采用活性染料eFluorTM 780(65-0865-14，eBioscience，美国加利福尼亚州圣迭戈)排除死亡细胞。葡萄糖摄取实验采用荧光葡萄糖类似物2-NBDG(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(N 13195，HeatFisher Science Inc.，IL，美国)。新鲜采血在X-体15培养基中稀释1：1，用TNF(10 ng/ml)、OKT 3(1000 ng/ml)和LPS(50 ng/ml)单独刺激或刺激。细胞在10μM2-NBDG存在或不存在的情况下孵育.4小时后用Lymphoprepp法分离PBMC，并进行流式细胞分析。总之，用含0.2%叠氮化钠和2%胎牛血清(fcs/pbs)的pbs冲洗细胞，然后用荧光结合抗体染色30分钟。oc保护不受光线照射。染色后，用流式细胞仪(FACS/PBS)清洗两次，去除未结合抗体。作为门控策略，淋巴细胞首先在前向散射(FSC)侧散射(SSC)点阵图中进行门控.随后分离单线态细胞，并根据活力染色筛选出下一个死亡细胞。最后，CD3+对T细胞进行2-NBDG摄取的门控和分析，发现在无2-NBDG的情况下，与细胞孵育相关的阳性门设置为2-NBDG(补充图)。2)。在CD 25-上调实验中，取血在X-体15培养基中稀释1：1，然后用TNF(10 ng/ml)、OKT 3(100 ng/ml)、联合OKT 3(10μg/ml)和10μg/ml(10μg/ml)刺激。同样的染色程序和门控策略被应用于葡萄糖摄取实验(补充图)。2T细胞在CD4或CD8上的表达被OKT 3抗体阻断。所有样本都在哥本哈根大学卫生和医学学院流动细胞计量学核心设施的BD LSR II上进行了分析。数据用Flowjo软件(Treestar，Ashland，OR，USA)进行分析。

TNF ELISA

为检测肿瘤坏死因子，应用人肿瘤坏死因子-α高灵敏度ELISA试剂盒(BMS223HS，eBioscience，AH诊断，丹麦哥本哈根)，并按照制造商的协议进行。总之，在加入样品和标准的复制件之前，预涂层板要洗两次.然后在所有井中加入生物素-共轭物，在微盘摇床上室温下孵育2小时，至400转/分。洗涤后，将链霉亲和素-HRP加入所有水井中，室温下在微板摇瓶中孵育1h。在加入放大液I和室温下在微板振动筛上孵育15分钟之前，再清洗盘子。进一步洗涤后，加入放大液II，室温下在微板摇瓶上孵育30 min。最后清洗后，加入TMB底物溶液，在黑暗中孵育10~20 min。加入停止溶液以停止反应，并在多扫描™FC微板光度计(357型，热科学)上立即读取平板。以450 nm为主波长，620 nm为参比波长。

qPCR

提取RNA时，细胞在三试剂(T 9424，Sigma Aldrich)中进行裂解，并进行彻底的旋涡处理。加入1-溴-3-氯丙烷(BCP)(B 9673，Sigma Aldrich)，将样品分离为水相和有机相。用异丙醇从水相中沉淀RNA，用乙醇洗涤，再溶于无RNase的水中。利用应用生物系统的高容量rna-cdna试剂盒进行互补dna(Cdna)的合成。TM(4387406，热费舍尔科学)。qPCR中，12.5ng cDNA与TaqMan通用混合引物Ⅱ、ON(4440038，ThermoFisher Science)、靶标引物和18S对照引物混合。样品是在地层Mx3000P上进行的。TM实时PCR机(Agilent Technologies)。在50°C下，热廓线设定为2 min，95°C下热启动10 min，95°C下15 s，60°C下1 min，在60°C台阶结束时测量信号强度，阈值周期(CT)值与对照引物真核18 S rRNA有关。采用热Fisher科学公司的TXNIP(Hs01006897_G1)和真核18 SRRNA(4319413E)引物。

统计分析

数据显示为平均值+扫描电镜。用配对t检验计算GrahPad棱镜的显着性水平。*表示p≤0.05；N.S.表示没有意义。