内皮促炎激活在动脉粥样硬化中起着关键作用，许多促炎症和动脉粥样硬化信号聚集在雷帕霉素(MTOR)的机制靶点上。mTOR复合物1(MTORC 1)抑制剂在临床前研究中减少动脉粥样硬化，但包括胰岛素抵抗和血脂异常在内的副作用限制了它们在临床上的应用。因此，我们研究了mTORC 1的细胞类型特异性内源性调节剂PRAS 40作为替代靶点。事实上，我们以前发现PRAS 40基因治疗可以改善代谢状况；然而，它在内皮细胞中的作用和它在动脉粥样硬化中的作用尚不清楚。这里我们发现PRAS 40负调控内皮细胞mTORC 1和促炎症信号。内皮细胞内PRAS 40基因敲除可促进肿瘤坏死因子α诱导的mTORC 1信号转导、增殖、炎症标志物的上调和单核细胞的募集。相反，PRAS 40过表达阻断了mTORC 1和所有促炎症信号的措施.这些作用是类似于药理mTORC 1-抑制与Torin 1。在体内血管内皮特异性PRAS 40缺乏症小鼠动脉粥样硬化性重塑模型显示内皮促炎活性增强，新生内膜增生增加，动脉粥样硬化病变形成。这些数据表明PRAS 40通过抑制内皮细胞mTORC 1介导的促炎信号而抑制动脉粥样硬化。结合其对代谢稳态的有利作用，这使PRAS 40成为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。

动脉粥样硬化是一种大中型动脉的炎症性疾病，可引起心肌梗死和中风，是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。1...内皮细胞(EC)功能和促炎激活在动脉粥样硬化的各个阶段，从动脉粥样硬化的发生到斑块破裂和动脉粥样硬化血栓形成都起着关键作用。2.

细胞内，大量的动脉粥样硬化刺激，如生长因子、营养过剩、高血糖和其他应激源的信号被雷帕霉素(MTOR)的机制靶标整合。3,4,5...mTOR存在于mTORc 1和mTORc 2两种不同的复合物中，其作为细胞生长和增殖的中心调节因子的作用已得到充分证实。3...临床前研究中越来越多的证据表明，mTORC 1的基因或药理抑制可以抑制动脉粥样硬化。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15促进小鼠长寿16,17,18...然而，雷帕霉素衍生物(Rapalogs)对患者全身mTORC 1的抑制作用受到不良影响的限制，其中高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常在动脉粥样硬化的情况下尤其令人担忧。19,20...治疗引起的血脂异常也可以解释为什么药理学mtrc 1抑制对肾或肝移植患者心血管风险的净影响只是中性的。21,22.

在此背景下，以富含脯氨酸的AKT底物40 kDa(PRAS 40)为靶点的mTORC 1细胞特异性内源性调控因子可能是一种很有前途的选择。PRAS 40被确认为mTORC 1复合物的一个组成部分，它以复杂的方式负调控mTORC 1信号，这只是不完全理解，而且根据果蝇的遗传证据，高度依赖于细胞类型。PRAS 40对mTORC 1信号的这种细胞类型特异性的影响可能与传统的mTORC 1抑制剂不同，可能没有限制其在动脉粥样硬化中的临床应用的副作用。23...事实上，我们已经证明腺病毒载体PRAS 40基因治疗可以改善肥胖小鼠的肝脏胰岛素敏感性，减少全身高血糖和血脂异常。因此，相对于雷帕霉素及其衍生物，mTORc1-抑制PRAS 40似乎可以改善代谢状况。24.

然而，PRAS 40在不同的哺乳动物细胞类型，特别是内皮细胞中的作用尚不明确，其在动脉粥样硬化等血管疾病过程中的作用尚未得到研究。在这里我们用离体功能丧失和功能增益研究，以及条件内皮特异性PRAS 40基因敲除小鼠模型，研究动脉粥样硬化背景下PRAS 40的内皮功能。

PRAS 40对内皮细胞mTORC 1的抑制作用

PRAS 40功能被证明是高度依赖于细胞类型的。为了检测其对内皮细胞mTORC 1信号转导的影响，将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)转染了靶向PRAS 40的siRNA或杂乱的siRNA。PRAS 40基因敲除可明显增强mTORC 1介导的信号转导，其下游靶点S6K和真核翻译起始因子4e结合蛋白1(4EBP 1)的磷酸化程度明显增强(图4 EBP 1)。1A，b)。相比之下，重组腺病毒PRAS 40的过度表达抑制了mTORC 1介导的HUVECs信号传导(图1)。1C，d)。因此，功能丧失和增益研究表明PRAS 40在内皮细胞中对mTORC 1有负的调节作用。

PRAS 40抑制内皮细胞的mTORC 1信号。(a,b)以siRNA介导的PRAS 40基因在HUVECs中的敲除后，标记蛋白的代表性免疫印迹，并通过对3个个体生物复制的分析，对指示蛋白进行了统计分析。数据表示平均±扫描电镜；*P<0.001；*P<0.0001(双尾学生t检验)。(c,d)腺病毒PRAS 40在HUVECs中过度表达后的典型蛋白免疫印迹，并通过对3个单个生物复制体的分析，对指示蛋白进行了统计分析。数据表示平均±扫描电镜；*P<0.05；*P<0.0001(双尾学生t检验)。

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mtrc 1被证明可以调节促炎信号，以及动脉粥样硬化化因子和白细胞粘附分子如icam-1的表达。25,26,27...为了阐明PRAS 40在内皮致动脉粥样硬化信号转导中的作用，我们用促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)治疗HUVECs，使mTORC 1信号增强，ICAM-1表达上调(如图1所示)。2A，b)。有趣的是，siRNA介导的PRAS 40基因敲除显著增强了肿瘤坏死因子α诱导的mTORC 1的激活和ICAM-1的上调。值得注意的是，PRAS 40基因敲除也促进了肿瘤坏死因子α诱导的其他动脉粥样硬化分子如VCAM-1和CCL 2的上调。2C)。如指定名称所示，PRAS 40在氨基酸末端含有两个脯氨酸丰富的片段和位于Thr 246处的AKT共识磷酸化位点(RXRXXS/T)。磷酸化的PRAS 40在生长因子、胰岛素、葡萄糖和不同营养物质的作用下与mTORC 1分离，从而释放PRAS 40对mTORC 1的抑制作用。然而，肿瘤坏死因子α在苏氨酸256上没有明显诱导PRAS 40磷酸化，提示TNFα诱导mTORC 1激活可能是另一机制。然而，siRNA介导的PRAS 40基因敲除显著增强了肿瘤坏死因子α诱导的mTORC 1的激活和ICAM-1的上调。相反，PRAS 40的过表达完全阻断了肿瘤坏死因子α-诱导的mTORC 1的激活，并减弱了动脉粥样硬化性白细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的上调(如图1所示)。3)。如前所述，PRAS 40通过降低典型下游靶S6K的磷酸化而特异性地抑制mTORC 1，而PRAS 40过表达并没有改变mTORC 2下游靶AKT的磷酸化。

PRAS 40基因敲除促进内皮细胞的促炎信号。(a)以siRNA介导的PRAS 40基因敲除HUVECs和用肿瘤坏死因子α(2，5 ng/ml)处理所指示蛋白的典型免疫印迹。(b)通过对3个个体生物复制体的分析，对指示蛋白进行统计分析。数据表示平均值±扫描电镜；*P<0.001；*P<0.001；*P<0.0001(ANOVA，其次为Bonferroni‘s事后比较)。(C)在分析3个单个生物复制体的基础上，对siRNA介导的PRAS 40基因敲除HUVECs后所指示的转录本进行定量RT-PCR分析，并以肿瘤坏死因子α(2，5 ng/ml)处理为基础。数据表示平均值±扫描电镜；*P<0.001；*P<0.001；*P<0.0001(ANOVA，其次为Bonferroni‘s事后比较)。

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PRAS 40过表达可减弱内皮细胞的促炎信号。(a)腺病毒PRAS 40在HUVECs中的高表达，并以肿瘤坏死因子α(2，5 ng/ml)作为指示时间点的典型免疫印迹。(b)通过对3个个体生物复制体的分析，对指示蛋白进行统计分析。数据代表平均±扫描电镜，*P<0.001。(C)在对3个单个生物复制体进行分析的基础上，对腺病毒PRAS 40在HUVECs中过表达及用肿瘤坏死因子α(2，5 ng/ml)作用8h后所指示的转录本进行了定量RT-PCR分析。数据表示平均值±扫描电镜；*P<0.05；**P<0.01；*P<0.0001。

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为了明确PRAS 40对mTORC 1活性和促炎信号的负性调节的功能后果，我们用THP-1单核细胞粘附试验检测了其对单核细胞向内皮细胞再增殖的影响。与PRAS 40介导的抑制白细胞粘附分子和趋化因子表达相一致，PRAS 40基因敲除明显增强了肿瘤坏死因子α诱导的THP-1单核细胞的募集(图1)。4A)。相反，PRAS 40的过表达明显降低了THP-1单核细胞与肿瘤坏死因子α刺激的内皮细胞的粘附(如图所示)。4B).

内皮细胞PRAS 40对肿瘤坏死因子α诱导的单核细胞粘附有调节作用。(a)统计分析经siRNA介导的PRAS 40基因敲除后，单核细胞在HUVECs上粘附的折叠变化及用CalceinAM染色后单核细胞粘附的典型图像。数据表示平均值±扫描电镜，*P<0.0001。(b)统计分析肿瘤坏死因子α治疗后腺病毒PRAS 40过表达后，单核细胞粘附于HUVEC的皱襞变化。数据表示平均±扫描电镜；*P<0.0001(方差分析，其次为Bonferroni的特设后比较)。

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在动脉粥样硬化的背景下，由于细胞周转增加是促炎症内皮激活的标志，我们研究了PRAS 40对内皮细胞增殖的影响。PRAS 40的敲除与上述促炎作用相一致，强烈促进VEGF刺激的促有丝分裂作用。相反，PRAS 40过表达可显著降低血管内皮生长因子(VEGF)的增殖反应(补充图)。沙一).

与动脉粥样硬化相关的内皮细胞转化率的增加通常伴随着细胞凋亡的增强，事实上，我们也观察到了肿瘤坏死因子α刺激后细胞凋亡率的增加。PRAS 40过表达增强了这一效应，而PRAS 40-基因敲除则显著降低了细胞凋亡率，表明mTORC 1信号在这方面具有抗凋亡作用(补充图)。S2).

如果PRAS 40确实通过负调控mTORC 1介导的信号发挥抗动脉粥样硬化作用，则PRAS 40过表达的作用应通过抑制mTORC 1的药理作用来模拟。因此，我们重复了使用新型mTOR抑制剂torin 1的关键功能损失实验。通过磷酸化S6K和核糖体S6蛋白(RibS6)，mTORC 1介导的信号传导被Torin 1阻断(图1)。5A，b)。值得注意的是，与PRAS 40过表达类似，torin 1-治疗抑制了内皮细胞粘附分子ICAM-1的表达，抑制了单核细胞对肿瘤坏死因子α的粘附(如图1所示)。5C，d)。此外，Torin 1促进内皮细胞凋亡，与PRAS 40过表达的促凋亡作用相当(见图)。5E).

药理mTORC 1-抑制模拟PRAS 40在内皮细胞中过表达的作用。(a代表指示蛋白的免疫印迹-在指示的肿瘤坏死因子α浓度和时间点诱导下，用Torin 1抑制指示蛋白。(b、c)在对2个个体生物复制体的分析基础上，对指示蛋白进行了统计分析。数据表示平均值±扫描电镜；**P<0.01；*P<0.001；*P<0.0001。(C)肿瘤坏死因子α诱导和托林1处理后单核细胞在HUVECs上粘附折叠变化的统计学分析。数据表示平均值±扫描电镜；**P<0.0001(ANOVA，其次为Bonferroni的术后比较)。(E)用流式细胞术(Annexin阳性细胞)检测细胞凋亡，并以肿瘤坏死因子(α)(2，5 ng/ml)诱导24h，分析3种单个生物复制物对HUVECs凋亡的影响。数据表示平均值±扫描电镜；**P<0.01；*P≤0.0001(ANOVA，然后是Bonferroni的特设后比较)。

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加在一起，离体-上述研究表明，PRAS 40通过mTORC 1的负调节抑制动脉粥样硬化信号和促炎症激活内皮细胞。为了验证这些发现体内为了验证其在动脉粥样硬化环境下的功能相关性，我们构建了一种新的具有条件内皮特异性PRAS 40缺陷的转基因小鼠细胞系，该细胞系以cre/losp介导的突变(EC-PRAS40-KO)为基础。在这方面，我们建立了两个氧氟沙星侧的PRAS40-allels小鼠，并在内皮特异性血管内皮钙粘蛋白(Cdh 5)启动子的控制下，与含有他莫昔芬诱导cre-重组酶的小鼠杂交。颈动脉横断面免疫染色证实内皮特异性PRAS 40缺陷(附图)。S3).

EC-PRAS40-KO小鼠和CRE阴性小鼠在部分颈动脉结扎和西部饮食的基础上，建立血流紊乱和动脉粥样硬化血管重塑模型：在他莫昔芬诱导的重组和开始西餐后6周，结扎除甲状腺上动脉外的所有左颈总动脉远端分支，以建立我们先前描述的紊乱但持续的血流(图1)。6A)28...与持续的西方饮食相结合，这种紊乱的血流会在四周内导致促炎症内皮激活和动脉粥样硬化血管重塑，包括内膜增生和免疫细胞浸润。29...即使没有一致的观察，初始的动脉粥样硬化病变与孤立的泡沫细胞和细胞内脂质积累也可能发展。

内皮特异性PRAS 40缺陷促进动脉粥样硬化重构体内. (a颈动脉部分结扎的原理图。箭头指示血流方向。红色虚线代表从容器近端指示的预定距离上进行定量分析的横截面。ECA，颈外动脉；ICA，颈内动脉；STA，甲状腺上动脉；OA，枕动脉(b)用他莫昔芬诱导的内皮特异性PRAS 40缺乏(EC-PRAS40-KO)小鼠和用他莫昔芬处理的CRE阴性小白鼠(WT对照组)连续暴露10周。结扎后4周，取左颈总动脉和假手术右颈总动脉进行进一步分析。在离颈动脉近端5个预定距离处(0m，1000 m，2000 m，3000 m，4000 m)有代表性的颈动脉横断面，用弹性染色染色。黑色标尺100米。(C)平均内膜横截面积(包括斑块和新内膜)在每个预定的距离(根据分析4种不同的动物每基因型)。显示绝对斑块面积以及与对侧假手术血管大小有关的斑块面积(由外弹性板包围的面积)。数据代表平均±扫描电镜；*P<0.05；**P<0.01；*P<0.001(双尾学生t检验)。

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与我们的离体-数据表明PRAS 40具有抗动脉粥样硬化功能，部分颈动脉结扎后4周，EC-PRAS40-KO小鼠动脉粥样硬化性重塑和病变的发展与对照组相比有明显增强(图1)。6B，c)。与PRAS 40介导的抑制mTORC 1依赖的促炎信号的概念相一致。离体结果表明，EC-PRAS40-KO小鼠白细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的内皮表达明显增强(图一)。7a，b)。随着细胞粘附分子表达的增加，EC-PRAS40-KO小鼠内膜病变中巨噬细胞较少的对照组更多。7C).

内皮特异性PRAS 40缺陷促进促炎信号体内. (a,b)分别用DAPI(蓝色)和抗细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1的抗体(红色)染色，显示具有代表性的颈动脉横断面。白色标尺100 m，定量显示ICAM-1和VCAM-1染色阳性的组织形态学特征所确定的内皮细胞百分比(根据4种不同基因型动物的3条预定义切片的分析)。(c)用抗巨噬细胞标记CD 68的抗体染色的具有代表性的颈动脉横断面。定量显示CD 68阳性率的内膜横截面积(包括斑块和新内膜)的分析，每个3节，来自4种不同的动物基因型。数据表示平均±SEM；*P<0.05；**P<0.01(双尾学生t检验)。

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mTORC 1介导的信号是在动脉粥样硬化的条件下或在动脉粥样硬化的背景下被激活的，在大量的临床前研究中，mTORC 1的抑制已经被证明可以通过多种促动脉粥样硬化效应来减少动脉粥样硬化斑块的形成。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15...此外，mTORC 1-抑制剂如雷帕霉素或其衍生物可促进小鼠长寿。16,17,18...然而，患者全身使用mTORC 1-抑制剂受到不良影响的限制，其中高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常在动脉粥样硬化的情况下尤其令人不安。20...事实上，显著的治疗引起的血脂异常也可以解释为什么尽管有良好的临床前数据，mtrc 1-抑制剂对肾或肝移植患者的心血管风险只有中性的净效应。21,22...在这方面值得注意的是，上述的临床前研究主要是基于导致高胆固醇血症的遗传动脉粥样硬化模型。在这种情况下，mTORC 1引起的胆固醇水平的适度增加可能不会生效。

在本研究中，我们研究了内源性mTORC1PRAS 40作为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。由于其对mTORC 1信号的高度细胞类型特异性的影响，PRAS 40介导的抑制mTORC 1可能提供了一个与传统的mTORC 1抑制剂不同的治疗方案--可能副作用较小。的确，雷帕霉素及其衍生物会对血脂和葡萄糖稳态产生不利影响。20我们曾证明腺病毒载体PRAS 40基因治疗能改善肥胖小鼠的肝脏胰岛素敏感性，降低全身高血糖和高脂血症。24.

然而，PRAS 40在内皮细胞中的特异性功能和在动脉粥样硬化中的潜在作用尚未被研究。这个离体在此提出的功能增益和功能丧失研究表明，PRAS 40对内皮细胞中的mTORC 1具有负调控作用，同时抑制内皮细胞炎症活动和单核细胞对动脉粥样硬化刺激的反应。这些发现与以前的一些报告一致，表明mtrc 1依赖于各种细胞类型的促炎信号。26,27,30...此外，雷帕霉素抑制系统性mTORc 1-可降低实验性动脉粥样硬化中趋化因子的表达和单核细胞的生成。6,7,8,12,15...尽管mTORC 1在这方面的功能还没有在内皮细胞中得到明确的定义，但个别的报道表明，mTORC 1依赖于血管内皮细胞生长的分子，如vCAM-1或内皮素-1。31...mTORC 1介导的促炎症信号的确切机制尚待阐明。然而，最近发现了一种通过mTORC 1介导的转录因子的去磷酸化(forkhead box k1，FOXK 1)调节趋化因子表达的非正则途径。30.

促炎性内皮激活和内皮单核细胞再通是动脉粥样硬化病变发展过程中的重要事件。与我们的离体结果表明，内皮特异性PRAS 40缺失在小鼠颈动脉部分结扎和西部饮食模型中可引起动脉粥样硬化重构和病变形成。这些观察与大量的报告一致，表明药理mTORC 1抑制小鼠动脉粥样硬化的作用。然而，必须考虑的是，与我们的小鼠疾病模型不同，我们的疾病模型只引发动脉粥样硬化重塑和最初的动脉粥样硬化病变，这些研究研究了缺乏LDL受体或载脂蛋白E的动脉粥样硬化小鼠的晚期动脉粥样硬化。虽然这些遗传小鼠模型可能更好地模拟了人类动脉粥样硬化的全貌，但导致高胆固醇血症的脂质稳态终身缺陷也可能是一个混杂因素。29...事实上，先前的研究结果表明，mTORC 1-抑制在动脉粥样硬化晚期不太有效，遗传动脉粥样硬化模型中过度的高胆固醇血症掩盖了潜在的影响。7.

PRAS 40在大鼠体内的抗炎作用离体上述药理mTORC 1抑制、内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1在EC-PRAS40-KO小鼠中的表达明显增强，与相应内膜病变中的免疫细胞数增加相一致。这些数据表明PRAS 40至少部分地通过抑制内皮促炎症激活而发挥其动脉粥样硬化保护作用。然而，除了其抗炎作用外，我们还发现pras 40可以抑制内皮细胞的增殖，这与mtorc 1信号通路对不同类型细胞周期调控的作用是一致的。3...PRAS 40的这些抗有丝分裂作用也可能有助于其动脉粥样硬化的保护作用，抑制内皮细胞的增殖甚至被认为可以防止斑块的不稳定。11.

虽然PRAS 40的抗炎和抗增殖作用与其在内皮细胞中的动脉粥样硬化保护作用相协调，但凋亡信号的正调控可能与这一概念相冲突。首先，我们对pras 40介导的促凋亡效应的观察与大量证据一致，表明mtorc 1能够通过多种下游靶点(包括p5 3、bad和bcl-2等凋亡调节蛋白)以细胞类型和上下文依赖的方式调控细胞凋亡。32...有趣的是，mtorc 1的促凋亡和抗凋亡作用在内皮细胞中都有报道。33,34...动脉粥样硬化血管区以内皮细胞增殖和凋亡率增加为特征，这一事实可能确实暗示了内皮细胞更替与动脉粥样硬化斑块形成的易感性之间的机制联系。然而，内皮细胞凋亡在动脉粥样硬化病变发展中的作用可能更为复杂，只是不完全了解。35.

毕竟，PRAS 40对动脉粥样硬化的保护作用可能是多向性的，其抗炎、抗增殖和促凋亡作用在内皮细胞中的相对贡献尚不清楚。此外，我们还不能确定PRAS 40是否确实通过抑制mTORC 1信号来发挥其对动脉粥样硬化的保护作用。然而，PRAS 40过表达的作用被药理mTORC 1-抑制所模仿，这一事实暗示了这种因果关系。

因此，根据我们的研究，我们假设PRAS 40抑制动脉粥样硬化的发展，至少部分是通过抑制mTORC 1介导的内皮细胞的促炎症信号。与常规的mTORC-抑制剂相比，PRAS 40-治疗的总体治疗方案似乎是有益的，与其对代谢动态平衡的有利作用相比较，mTORC 1抑制剂的全身性应用受到了包括高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常在内的非靶标效应的限制。总之，PRAS 40有可能成为治疗动脉粥样硬化的潜在靶点。

试剂

雷帕霉素稀释后储存在DMSO中，从圣克鲁斯生物技术公司(sc-3504B)购买。Torin 1，稀释后储存在DMSO中，来自开曼化学公司(Iten#10997)。肿瘤坏死因子α，稀释后贮存于PBS中，购自PeproTech(35~01A，批号121054-1)。蛋白酶和磷酸酶抑制剂是从罗氏购买。β-巯基乙醇和二甲基亚砜是从西格玛-奥尔德里奇，吐温20洗涤剂从卡尔罗斯.

细胞培养

PBS和RPMI 1640培养基是从Sigma-Aldrich公司购买的，FBS是从默克·米利波尔公司购买的.青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺(100倍)、MEM非必需氨基酸溶液(100倍)、胰蛋白酶/EDTA溶液、HEPES缓冲剂来自生命技术公司。

取人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为内皮细胞功能模型。HUVECs在内皮细胞生长培养基-2(EGM-2)(Lonza)中培养，其中含有内皮细胞基础培养基-2(Lonza)、2%FBS和Lonza所含的其他生长因子。第5~6代培养HUVECs，通常用于实验。HUVECs的最大融合率为70%~90%。然后进行继代培养，或将其镀入6孔板中进行实验.重新播种时，用PBS洗涤细胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液(0.025%)分离细胞。实验中，将第4代冷冻小瓶中的内皮细胞解冻、培养和再镀于6孔板中，每孔80，000~12万个细胞，加入10%FBS的EBM-2培养基中。24小时后，将培养基改为含5%FBS的EBM-2进行转染、感染或直接实验。冷冻保存采用80%EGM-2、10%DMSO和10%FBS的混合培养基。

由AG Leuschner(Heidelberg大学医院)提供的THP-1单核细胞属于一种来源于急性单核细胞白血病的细胞系。在RPMI 1640培养基、10%FBS、10 mm HEPES缓冲液、50 Mβ-巯基乙醇的混合培养基中，添加非必需氨基酸和青霉素(100 IE/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(292 g/ml)的抗生素溶液。在进行继代培养前，允许浓度为30万~80万个细胞/ml。为了验证细胞数，每天检查中等颜色，用计数室定期测定细胞数。冷冻保存培养基由76.5%RPMI 1640、18.5%FBS和5%DMSO+PSG组成。

WESTERNBLOTTING

用冰冷PBS洗涤HUVECs，用蛋白质裂解缓冲液(20 mm Tris，150 mm NaCl，1%TritonX-100，0.1%SDS，蛋白酶和磷酸酶抑制剂)溶解HUVECs。为了确定蛋白质浓度，根据制造商的指示，采用了基于Lowry方法的DC蛋白分析试剂盒(Bio-Rad)。如有必要，在进一步处理前，将蛋白质样品冷冻在−20°C。经分离和浓缩试验，制备出蛋白质量为10~15g的负载样品，其馀部分为Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)，外加10%β-巯基乙醇和蛋白裂解缓冲液。加载样品在95°C下加热5 min，以保证变性。在电泳室(Bio-Rad)中用SDS-凝胶(Bio-Rad#3450118，#3450123)对溶出物进行拆分.然后，这些蛋白质被涂抹在PVDF膜上(默克·米利波)。在免疫染色过程中，用Twein 20(TBST)三缓冲盐水冲洗膜，在室温下用溶解在TBST中的I块(生命技术)阻断至少1小时。PVDF膜在4℃下孵育一夜，分别在封闭试剂和TBST缓冲液中稀释原抗体。所用初级抗体所针对的蛋白质用于以下稀释物：

• 细胞间粘附分子1-ICAM-1，1：25 000；圣克鲁斯生物技术(Sc8439)

• 磷酸p70 S6激酶(Thr 389)-pS6K1，1：1000；细胞信号技术(#9205)

• 富含脯氨酸的Akt底物40 kDa-pras 40，1：10000-1：5000；细胞信号技术(#2691)

• 富含磷酸脯氨酸的40 kDa(Thr 246)-pPRAS 40，1：10000-1：5000的Akt基片

• 磷-Akt(Ser473)-Pakt，1：1000；细胞信号技术(#9271)

• 磷脂-S6核糖体蛋白(S 235/236)-pRPS 6，1：5000；细胞信号技术(#2211)

• 磷酸-4EBP1(S65)-p4EBP1，1：5000；细胞信号技术(#9451)

• α-微管蛋白-1：20000，细胞信号技术(#2144S)

用辣根过氧化物酶结合次级抗体、WesternLightning Plus-ECL(Perkin Elmer)和CL-Xposure薄膜(Thermo Fisher Science)检测蛋白质。利用一个名为斐济的开源图像处理软件，基于ImageJ，将每个波段的宽度和强度确定为一个数值。以α-微管蛋白为对照。

RNA干扰

利用siRNA依赖的RNA干扰沉默了编码蛋白PRAS 40的AKT1S1基因。所用siRNA来源于Thermo Fisher Science：阴性对照siRNA(消声器阴性对照2号siRNA-#AM 4613)和AKT1S1靶向siRNA(siRNA ID s 38945，#4392420)。siRNAs的转染是使用脂质体2000(ThermoFisher科学)，根据制造商的指示，按照以下协议进行的。每口井

• 在EBM-2的125μl中稀释siRNA，使siRNA浓度达到500 nm。

• 转染试剂的2，5，5倍稀释在125μl的EBM-2中。

• 两种试剂混合后孵育5分钟。

• 将这两种混合物混合在一起，孵育20分钟。

将转染细胞的培养基改为EBM-2，加入5%的FBS，并分别加入所制备的siRNA复合物。最终的siRNA浓度为50 nm，体积为1，25 ml，细胞在转染培养基中暴露24小时。

腺病毒PRAS 40的高表达

两种病毒PRAS 40野生型腺病毒和控制腺病毒都是通过网关克隆系统生成的。36...通常冷冻在病毒保存缓冲液(20 NM Tris/HCL，25 mm NaCl，2，5%甘油，pH调节到8.0在22℃)中，将病毒颗粒添加到含有5%FBS的EBM-2培养基中，使感染达到预期的多重性(MOI，每个细胞的感染颗粒数)。细胞在病毒培养基中暴露24小时。

粘附试验

在PRAS 40的调控实验中，HUVECs要么被siRNA转染，要么被上述腺病毒感染。转染或感染后的第二天，从6孔板中取出细胞，接种于96孔板中，接种浓度为50，000细胞和100μ1的EBM-2+10%FBS。在Torin实验中，同时培养HUVECs。重新播种后，给予细胞48小时重新附着，形成完整的单层。用肿瘤坏死因子α刺激HUVECs，在pBS中稀释，终浓度为2，5 ng/ml，Torin 1浓度为150 nm，作用3h。用eBioscience Calcein AM活力染料(Thermo Fisher Science)染色和制备THP-1单核细胞，根据Vybrant细胞粘附试验试剂盒手册(Thermo Fisher Science，#V13181)，该染料染色具有代谢活性和活细胞活性。将染色的THP-1单核细胞加入HUVEC井中，以500，000/孔的方式进行粘附，并经洗涤去除不粘附细胞。利用具有FITC滤波器组的平板阅读器，在激发后的9个不同位置测量了每口井的荧光。每口井的平均值用于进一步的数据处理。

凋亡

以肿瘤坏死因子(α)120 ng/ml处理HUVECs 24小时，加入5%FBS，诱导HUVECs凋亡。在加入肿瘤坏死因子α的同时，加入雷帕霉素和Torin 1作为mTOR抑制剂。24小时后，用Annexin V FITC和PI(Thermo Fisher Science，#V 13242)的死细胞凋亡试剂盒进行流式细胞术(BD FACSVerse)的检测。

增殖

对于siRNA介导的PRAS 40基因敲除或腺病毒过度表达，首先培养、转染和感染上述人脐静脉内皮细胞。然后从6孔板中分离出细胞，在期望浓度约为每井1000个细胞的情况下，用96孔板(Corning)进行特殊成像。第0天，在96孔板上重新播种后，细胞被给予大约4小时的时间附着在板上。在附着期，细胞被给予含有10%FBS的培养基，以促进这一过程。随后，用CyQuant直接细胞增殖试验试剂盒进行初始计数。(Thermo Fisher Science，#C35011)。对于计数过程本身，使用InCell Analyzer 2200及其软件进行自动拍摄、处理和数字计数。这允许用绝对值来确定细胞数。为比较细胞增殖情况，在5%FBS EBM-2培养基中，用50 ng/ml浓度的AG Hassel(Heidelberg)大学医院提供的VEGF刺激细胞，每试验第2天(播种后48h)进行培养基改变，包括VEGF的再加入。初始细胞数测定后每24小时进行一次细胞计数测定。

遗传小鼠模型

研究PRAS 40体内以他莫昔芬诱导的内皮特异性PRAS 40缺失小鼠为研究对象，构建了一株新型PRAS 40基因敲除小鼠系。用EPD 0156_2_A05-欧洲条件小鼠突变程序(EPD 0156_2_A05-欧洲条件小鼠致突变程序)克隆小鼠。将ras 40小鼠与cdh 5(Pac)-creert 2小鼠杂交，产生内皮特异性基因敲除小鼠。37...CRE+/−；Pras 40fl/fl小鼠被认为是敲除动物(EC-PRAS40-KO)，而CRE阴性的小白蚁则被认为是野生型对照.

致动脉粥样硬化性重塑小鼠模型

从6周龄开始，老鼠就开始连续吃西餐(Ssniff)。®TD 88137，0，3%胆固醇)，共10周。在7周龄时，腹腔注射他莫昔芬(Sigma，T 5648，1mg/动物/d，连续5天)激活EC-PRAS40-KO小鼠Cre重组酶。CRE阴性对照小鼠也进行了同样的实验。

12周时，我们进行了颈动脉部分结扎手术。28...短期内，小鼠腹腔注射氯胺酮(120 mg/kg，辉瑞，德国)和西拉津(16 mg/kg，拜耳；德国)，并放置在一个加热的外科垫。脱毛后行颈中切口，暴露左颈总动脉远端支。4支中的3支(颈外动脉、颈内动脉和枕动脉)随后结扎至甲状腺上动脉分支远端，以流出的形式开放(见图1所示的示意图)。6A)。6.0丝缝线(Serag-Wiessner)用于结扎，皮肤用可吸收的6.0丝线缝合(肠线，德国)。手术后，动物被监视在加热垫上的一个房间直到恢复。西部饮食持续到颈动脉部分结扎后4周。

所有动物实验都得到了联邦柏林州动物伦理委员会(德国柏林兰德斯市)的批准，并按照“有效准则”和“德国动物保护法”进行。

组织学和免疫组织化学

组织学检查：血管灌注固定于4%PFA过夜。然后再用增加浓度的乙醇和石蜡包埋的容器进行再水化。石蜡包埋动脉行5μm系列切片，固定于切片上.

在形态计量学分析中，根据制造商的指示，用改良的Verhoeff Van Gieson弹性染色试剂盒(Sigma Aldrich HT 25)对幻灯片进行再水化和染色。在部分结扎左颈总动脉的情况下，分析了离颈动脉近端5条预定距离(分别为0μm、1 000μm、2 0 0 0μm、3 0 0 0μm和4 0 0 0μm)的横断面(见图1)。6A)。Photoshop cs5扩展软件(Adobe)用于测量内部弹性层、外弹性层和腔的周长，以及我们先前描述的内侧、内膜和腔内横截面积。38...在相关分析中，将斑块面积与假操作的对侧颈总动脉的横截面积进行量化，即由外弹性板所包围的面积决定。

免疫组化：石蜡切片再水化，然后在柠檬酸盐缓冲液(pH=6)中煮沸3分钟，在微波炉中提取表位。然后在添加5%正常山羊血清和1%BSA的PBS中阻断表位30分钟。一次抗体(阻断缓冲液中稀释1：200)在4℃下孵育一夜。然后用生物素化的兔IgG二次抗体检测初级抗体，然后按照制造商的指示与生物素-生物素复合物(AK-5000，载体实验室)孵育。然后按照制造商的指示使用VectorRed-Kit(SK-5100，向量实验室)可视化染色。最后，使用含DAPI的水性安装介质(H-1200，矢量平台)安装幻灯片。

抗体

抗VCAM 1：ab134047(ABCAM)，抗ICAM 1：ab119871(ABCAM)，抗CD 68：ab125212(ABCAM)，抗兔IgG：BA-1000(载体实验室)，抗大鼠IgG：BA-9401(载体实验室)。

定量分析时，计算内皮细胞(ICAM-1和VCAM-1染色)阳性率或内膜阳性面积百分比(CD 68染色)。值得注意的是，内皮细胞是根据特征性的组织形态特征来定义的(细胞核细长的细胞构成血管的腔内衬)。分析了离血管近端、内侧和远端的至少三条横截面，并计算了一条血管平均值。

显微术

显微图像用KeyenceHS全合一BZ 9000显微镜拍摄.荧光图像采用CFI方案APOλ40x镜头。图像分辨率为1360×1024像素，比例尺为375像素/m，捕获时间DAPI为1/12s，VectorRed为1/10s。在DAPI通道中使用蓝色作为荧光，在VectorRed通道中以红色表示荧光。荧光染料的激发/发射波长为：DAPI：360 nm/460 nm；VectorRed：365~560 nm/>560 nm。利用以下滤波器组采集图像：DAPI 340/360 nm激发-450/460发射；矢量红：513/556激发-570/613发射。

对于Elastica和CD 68染色的图像，使用了CFI计划Apoλ20x镜头。图像分辨率为4080×3072像素，比例尺为563像素/m，捕获时间为1/30s，位深为24。

统计

在统计分析方面，利用GraphPad软件的PRISM 6软件进行统计分析。在两组以上的实验中，采用单因素方差分析进行比较，不进行匹配，也不与使用预先选定的兴趣组进行的多组比较配对。在图中，所给出的值是组的算术平均值，其中的误差条表示均值(SEM)的标准误差。如果对两组进行比较，则采用未配对t检验来确定显着性差异。