四种登革热病毒血清型(DENV1-4)导致全球重大公共卫生问题。 高人类单克隆抗体中和特定类型(hmAbs)目标conformation-dependent DENV信封蛋白抗原表位,包括1 f4, DENV1特定类型hmAb。 使用重组DENV2病毒显示DENV1 1 f4抗原决定基(rDENV2/1),我们测量的比例和动力学DENV1中和抗体针对1 f4抗原决定基在不同的个人生活在亚洲和美洲DENV1基因型循环。 样本分析了20个人3和18个月的初等后DENV1感染,与样本4个人每年收集了四年的初等后DENV1感染,在尼加拉瓜的两项研究。 我们也分析了康复的中等DENV1血浆样本学习的斯里兰卡人。 我们发现中和抗体识别1 f4抗原决定基患病率在不同人群和被发现感染后20天到四年。 此外,人口都显示实质性的变化,与一系列DENV1特定类型的比例高到低中和抗体识别1 f4抗原决定基在个人。 因此,1 f4抗原决定基是一个主要的但不是独家的目标特定类型中和抗体的初等后感染不同DENV1基因型在亚洲和拉丁美洲,和额外的抗原表位可能为特定类型的DENV1中和。
四种登革热病毒血清型(DENV1-DENV4)积极意义RNA虫媒病毒的家庭黄。 广泛分布在许多地理区域,DENV导致人类最普遍的蚊媒病毒性疾病在世界范围内,有超过三分之一的世界人口在感染的风险1,2。 虽然经常发生无症状感染,感染DENV可能会导致一系列的疾病表现,从古典登革热(DF)更严重的登革出血热(DHF)和登革热休克综合征(DSS)3.,4,5。 虽然严重的表现可能偶尔被报道在原发感染,感染一个不等的DENV DHF / DSS的血清型是主要的风险因素6。
中和抗体抵御DENV感染症状的关联7,8,9。 后第一个自然感染任何DENV四种血清型,特定类型中和抗体针对同源血清型引起。 除了这些特定类型的抗体,它被认为是终身,人口众多的可交叉反应的抗体生成,从而可以保护或可能会加强与不同的血清型的感染和疾病10,11,12。 鉴于这种风险,必须引起平衡和保护性免疫的疫苗同时四个DENV种血清型。
信封(E)糖蛋白是主要蛋白质表面的病毒粒子,在它形成平行的头部到尾部为表面躺在木筏成熟病毒13,14,15。 在DENV种血清型,E蛋白的氨基酸同源性为60 - 70%16。 E蛋白ectodomain中和抗体的主要目标,由三个领域:EDI, EDII EDIII13,17,18,19。 EDI是形成一个eight-strandedβ-barrel和由E单体的中部地区。 EDII包含一个高度保守的融合循环,促进融合的病毒与endosomal在温和的酸性条件下膜20.。 EDIII immunoglobulin-like褶皱和参与受体识别21。
孤立的人类单克隆抗体(hmAbs)从个人历史的DENV感染已基本阐明中和抗体反应的特异性和机制DENV感染。 的一个关键的发现表明,强有力的特定类型hmAbs目标要求完整E蛋白的抗原表位DENV病毒粒子的组装22,23,24。 这样一个强大的特定类型的抗体是1 f4, DENV1特定类型hmAb22,25。 然而,与许多hmAbs认识第四纪抗原表位,在邻近的E蛋白1 f4不绑定。 相反,1的足迹f4坐落在一个E单体和跨越主要在EDI,虽然交互EDI / EDII铰链区也描述25。 采用E蛋白的构象在病毒粒子的背景下对绑定1 f4 hmAb至关重要25。 第二个DENV1特定类型和强烈中和hmAb 14 c10,有重叠的抗原决定基1 f4抗原决定基25。 14 c10抗原决定基在本质上是第四纪,因为它跨越了EDI和E EDIII不同的分子表面的病毒26。
反向遗传学的方法已经被用来移植第四纪的核心抗原表位的目标DENV特定类型hmAbs成不同DENV骨干创建嵌合病毒27,28,29。 之前我们已经表明,初级DENV3多克隆血清的大量个人dengue-endemic区域跟踪与DENV3特定类型不同程度5 j7抗原决定基移植到DENV4骨干30.,31。 DENV2-specific中和抗体反应是跟踪与2所示d22摊位第四纪抗原决定基的样本个体经验自然DENV感染32。 同样,嵌合病毒已经成功地用于追踪人的抗体反应与单价减毒活疫苗免疫DENV2疫苗29或四价的登革热疫苗候选人33,34。 一起,这些研究支持嵌合的针对性登革热病毒作为解剖工具多克隆中和抗体的特异性反应和帮助验证新的抗原表位的足迹。
我们有设计和恢复DENV2重组病毒的移植DENV1 1 f4构象表位。 这种嵌合病毒已经验证了结构完整性和用于地图DENV1特定类型刺激通过接种疫苗的抗体35。 在这里,我们使用DENV2/1病毒中和抗体的量化比例和动力学针对这种抗原决定基在个体经验的初级DENV1感染。 值得注意的是,我们分析了个人在两个不同基因型的DENV1 dengue-endemic地区循环——在亚洲和美洲——在不同的跨度为感染后,这通知的患病率和耐用性抗原决定基的基因型变异在DENV1血清型。 我们的结果表明,1 f4-specific中和抗体在个人在流行地区,是普遍和从~ 20天到晚四年感染后。 重要的是,DENV1特定类型的比例反应这一目标显示实质性变化从高到低的1 f4抗原决定基在研究人群,这表明DENV1剧目由多个immunodominant抗原决定基。 总之,我们的研究结果验证1 f4 DENV1特定类型的抗原决定基作为一个重要的组成部分中和反应在两个dengue-endemic全球地区。 的决定因素的识别防范DENV1血清型在大量的个人影响登革热疫苗的设计和评价。 此外,这些结果重申的相关性进一步的研究旨在描述DENV1其他抗原网站。
二十登革热患者参加尼加拉瓜医院研究选择的比例和动力学分析DENV1响应针对1 f4抗原决定基。 我们使用血浆样本收集3和18个月的初等后DENV1感染。 所有确诊病例阳性DENV1通过逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)和/或病毒隔离。 所有个人经验只有一个主感染DENV1在2007年或2012年,与16个显化疾病登革热和4登革出血热(补充表S1)。 分析1 f4 post-illness反应从一个四年,我们选择4个人进入儿科登革热队列研究经历了一个RT-PCR-confirmed感染DENV1血清型在2005年或2009年,有四个后续年度样本没有显化症状感染或隐性感染的血清学证据证明了ELISA抑制浓度(补充表S2)。 所有4个人表现作为DF疾病。 分析应对1 f4抗原决定基在斯里兰卡人口,我们选择12个样本收集的初等后DENV1感染。 DENV1基因型V循环在尼加拉瓜,DENV1基因型循环在斯里兰卡。
最新调查结果显示,大部分的DENV中和hmAbs识别抗原表位,只出现在组装病毒粒子23,24,25,36。 1就是这样一个hmAb f4, conformation-dependent DENV1特定类型hmAb孤立的个人经历与DENV1原发感染22。 1 f4抗原决定基足迹位于EDI和EDI / EDII铰链区在一个E蛋白单体,由26个氨基酸,由红色和黄色球体在无花果。1 25。 三十独特的氨基酸残基围绕的核心DENV1 1 f4抗原决定基被移植到一个DENV2骨干,创建rDENV2/1病毒(无花果。1 b),它有效地中和了hmAb 1 f4,但不是14 c1035。 确定目标1 f4 DENV1特定类型的抗体抗原决定基的多克隆血清个人经历了主要感染DENV1中和化验与等离子体进行样品收集在不同的跨度为post-illness(3和18个月)对rDENV2/1病毒显示1 f4抗原决定基及其父母DENV1 DENV2菌株。 代表反曲的剂量反应曲线显示中和抗体滴度(NT50血浆样本个体1449)表明,在多克隆血清抗体识别1 f4抗原决定基移植到DENV2骨干3和感染后(图18个月。1 c, D)。 此外,维护rDENV2/1中和抗体滴度尽管减少父母DENV1 NT50值在以后的时间点表示持久的中和抗体反应定向到1 f4抗原决定基。
氨基酸残基组成的f4抗原决定基的EDI和EDI / EDII铰链区DENV1 E蛋白的单体被移植到DENV2骨干由中和试验和分析。 (一个DENV1 E的)图二聚体(域I, II和III在红色、黄色和蓝色,分别),黄色和红色球体代表1 f4抗原决定基足迹。 (B)内的氨基酸残基1 f4抗原决定基,在红色和黄色球体,被移植到DENV2骨干,创建rDENV2/1病毒。 (C, D)代表反曲的剂量反应曲线用于估计50%中和效价(NT50)rDENV2/1和父母DENV1 DENV2血浆样本中病毒病人1449 3 (C)和18个月(D)。
DENV-specific抗体反应的动力学之后第一次感染的特点是外观的IgM抗体,紧随其后的是一个持久的免疫球蛋白g的反应。 免疫球蛋白早期响应包含不同抗体的人群,包括cross-neutralizing抗体和特定类型中和抗体。 虽然有些cross-neutralizing抗体是短暂的,特定类型的抗体被认为是终身,可以检测到年后感染37。 我们使用了rDENV2/1病毒专门确定主DENV1 1 f4构象表位的抗体反应跟踪多个个体。 如上所述,我们进行中和化验主要DENV1等离子体对rDENV2/1病毒及其DENV1和DENV2父母的病毒。 正如所料,在所有的科目,主要DENV1等离子体强烈中和父母DENV1病毒在跨度为感染后(图2 a, B)。 也正如所料,NT50值相应的血清型DENV1明显高于到不同的血清型DENV2(无花果。2 a, B)。 在跨度为NT50值rDENV2/1均明显高于父母DENV2浓度显著低于父母DENV1滴度。 成对的纵向分析样品在3和18个月DENV1 NT的揭示了重要的衰变50值(无花果。2摄氏度),而DENV2和rDENV2/1浓度保持不变(无花果。2 d, E)。 事实上,低水平的DENV2 cross-neutralizing抗体滴度在早期的时间点可以解释缺乏可检测的变化在随后的时间点。 完全,纵向分析表明抗体针对1 f4抗原决定基维护尽管DENV1 NT的衰退50值,表明这种epitope-specific反应的耐久性。
包含1 f4抗原决定基的氨基酸残基DENV2骨干结果中获得多克隆血清中和对rDENV2/1嵌合病毒的初等后DENV1感染。 (一个,B)主要DENV1等离子体从20个人在尼加拉瓜医院研究强烈中和父母DENV1病毒和获得中和能力对包含1的DENV2骨干f4氨基酸残基(rDENV2/1) 3和感染后18个月。 NT50值rDENV2/1病毒和DENV1 DENV2父母病毒由单向方差分析比较(n = 20)。 (C- - - - - -E)纵向样本的配对分析3和18个月显示了DENV1 NT的显著衰减50值,而DENV2和rDENV2/1浓度随时间保持不变。 采用t检验比较中和抗体滴度在3和18个月感染后血清型。 数据是代表两个独立的实验,样本处理每个血浆样品一式两份。 * * p < 0.01; * * * p < 0.001; * * * * p < 0.0001。
接下来,我们决定多少DENV1特定类型的反应是针对1 f4构象表位。 使用公式(rDENV2/1 NT50——DENV2 NT50)/ (DENV1 NT50——DENV2 NT50),可交叉反应的(DENV2) NT50已经从DENV2/1和DENV1 NT减去吗50滴度,我们计算的比例DENV1中和抗体反应归因于1 f4抗原决定基。 在20个人参加医院的研究在尼加拉瓜,我们观察到的平均比例DENV1特定类型响应针对1 f4抗原决定基在感染后3个月是24.9%,38.3%,感染后(图18个月。3)。 这个分析显示了一个实质性的变化程度DENV1 NT50滴度跟踪1 f4抗原决定基:大多数人包含高或低比例1 f4抗原决定基。 在3个月的初等后DENV1感染,范围从0 - 91%的比例,而在18个月(图范围从0 - 100%。3)。 成对分析表明,大多数人有反应的增加1 f4抗原决定基(8/20)或保留了应对1 f4抗原决定基(10/20)(图3 b, C)在感染后3个月和18个月,这是一个强烈的迹象长寿池抗体特定的抗原决定基。 估计抗原相似性DENV1 rDENV2/1,我们采用抗原制图方法38。 每个等离子体样品的中和抗体滴度在3和18个月被视为衡量等离子体和病毒之间的距离。 我们观察到,比DENV2 rDENV2/1接近DENV1初等后DENV1感染(图。3个月3 d)。 由18个月,rDENV2/1甚至接近DENV1(无花果。3 d)。 这一分析表明rDENV2/1和DENV1分享更大的相似性在随后的时间点,随着DENV1血清反应变得越来越具体1 f4抗原决定基。
DENV1特定类型的比例中和抗体反应针对1 f4抗原决定基是高度可变的医院在尼加拉瓜人口研究3和感染后18个月。 (一个)分析DENV1特定类型反应的比例应由1 f4抗原决定基在3和18个月揭示了实质性的变化,与个人的显示比例从高到低DENV1响应针对1 f4抗原决定基。 (B)配对分析,每个被分配一个颜色,一个象征,使DENV1特定类型的轨迹的可视化反应1 f4抗原决定基在3和感染后18个月。 (C)分布的个体获得认可的f4抗原决定基3至18个月(米黄色),失去了识别(布朗)或保持不变(绿色)。 (D)病毒抗原制图地图位置(DENV1 DENV2 rDENV2/1蓝绿色,紫色和黄色,分别)和血浆(蒂尔广场开放),每种病毒之间的距离和等离子体来自各自的中和抗体效价。 每个网格对应一个二倍稀释NT50。 从3到18个月的初等后DENV1感染,DENV1和rDENV2/1浓度收敛,rDENV2/1指示的箭头指向DENV1。
为了更好地理解不同的模式见图个人轨迹分析。3 b,我们分组显示的人增加,DENV1中和抗体的比例常数或减少由于1 f4 /时间和与此同时分析rDENV2/1病毒的中和抗体滴度和DENV1 DENV2父母的病毒。 见图。4,表现出增加1个人f4 (A组)表现出衰减比例DENV1 NT50值,只有在rDENV2/1 NT略有增加50观察值。 子集的个体保持恒定的比例随着时间的推移,我们观察到的相同的模式,尽管DENV1 NT的大小50衰减值低于A组(图。4 b)。 最后,个体表现出减少1 f4 DENV1比例随时间呈现一个上升和DENV2抗体滴度(无花果。4摄氏度)。 在所有的组,DENV2/1中和抗体滴度保持相对不变。
DENV1中和抗体反应的比例直接影响1 f4抗原决定基的同型的水平和异形的滴度。 (一个- - - - - -C)更好地理解比例的不同模式中观察到的个人轨迹分析,我们分组显示的人增加了一个)、常数(B)或减少(C)随着时间的比例(右轴),与此同时分析了NT50值(左轴)的父母DENV1(蒂尔线)和DENV2病毒(紫色的线)和rDENV2/1嵌合病毒(黄线)。 在A组中,增加抗体针对1 f4抗原决定基DENV1 NT的衰变50价值观和伴随的维护rDENV2/1滴度。 在B组,固定比例3至18个月是伴随着改变父母的病毒的中和抗体滴度的大小,在C组,1 f4抗原决定基的损失的识别与NT的增加有关50值DENV1和DENV2病毒。
虽然我们证明DENV1特定类型1 f4表位的抗体追踪大量的尼加拉瓜人感染后18个月,我们要评估这个响应是否保持一段时间。 测试的长期耐久性DENV1响应针对1 f4抗原决定基,我们分析了样本收集每年1至4年的初等后DENV1长期感染登革热在尼加拉瓜队列研究。 总的来说,平均NT50价值rDENV2/1病毒和病毒的父母保持4年1年(无花果。5 a - c)。 关于1的比例f4的分析,我们发现从第一年到4年,1 f4抗原决定基占平均48 - 65%的DENV1中和反应(图。5 d)。 然而,类似于人口登记在尼加拉瓜医院的研究中,我们观察到大量的变异个体的DENV1特定类型的反应随着时间的推移这种构象表位(图。5 d)。
主要DENV1血浆样本收集四年不同程度感染后跟踪1 f4抗原决定基的儿科登革热在尼加拉瓜队列研究。 (一个- - - - - -C)中和抗体滴度的均值rDENV2/1和父母DENV1 DENV2病毒在感染后4年没有明显变化。 NT50通过单向方差分析分析值比较(n = 4)。 (D)从第一年到年4初等后DENV1感染,1 f4抗原决定基占47,48岁,52和47%的DENV1特定类型反应,分别。 比例由单向方差分析比较分析(n = 4)。
DENV的传统分类成四个遗传学上截然不同的血清型似乎低估了病毒中和抗体反应基因型变异的影响38。 最近的数据点清晰效果DENV遗传变异的基因型在中和能力39,40。 鉴于努力设计一个有效的疫苗人群暴露于DENV株不同的基因型,我们评估是否多克隆反应个人生活在一个dengue-endemic地区一种独特的基因型的DENV1(基因型)与1 f4抗原决定基循环还跟踪。 尼加拉瓜DENV1对齐(基因型V),斯里兰卡DENV1(基因型)和西Pac DENV1(基因型IV)强调三个氨基酸残基的变化1 f4抗原决定基(T→S在斯里兰卡DENV1在155位置; T→我在尼加拉瓜DENV1位置161; S→T 171位置在斯里兰卡DENV1)(补充图。S1)。
从研究在斯里兰卡,我们选择了12个人经验的实验室确认主要DENV1感染,从他康复的阶段的血液样本。 我们进行了相似的分析,发现最高浓度被发现DENV1同源血清型,而cross-neutralizing浓度的外源DENV2血清型都显著降低(图。6)。 而元50值rDENV2/1病毒不同的个人,平均DENV1 NT相当50值,但明显高于DENV2 NT50值(无花果。6)。 平均52%的DENV1中和抗体反应目标1 f4抗原决定基在斯里兰卡个人(图12。6B),高于尼加拉瓜的样本。 类似于尼加拉瓜人口外,我们还观察到一群人高的比例,以及一群个体与低比例的f4抗原决定基(无花果。6B)。 最后,抗原制图地图再次支持抗原相似性rDENV2/1 DENV1,表示这些病毒之间的近距离和主DENV1血清(无花果。6摄氏度)。 值得注意的是,西方父母DENV1 Pac 74是在第四基因型,哪个更密切相关的基因型在斯里兰卡我循环比基因型V循环在尼加拉瓜41,42,43。
多克隆血清识别的1 f4抗原决定基的斯里兰卡人中等DENV1学习感染恢复期的阶段。 (一个)在恢复期的阶段,NT50值DENV1感染血清型和rDENV2/1明显高于NT50值在斯里兰卡DENV-infected DENV2血清型的人。 (B)DENV1特定类型反应的比例应由1 f4抗原决定基变量和平均53% 12斯里兰卡人。 (C)病毒抗原制图地图位置(DENV1 DENV2 rDENV2/1蓝绿色,紫色和黄色,分别)和血浆(12开蒂尔广场),表明DENV1和rDENV2/1病毒之间的距离。 每个网格对应一个二倍稀释中和效价。 NT50通过单向方差分析分析值比较(n = 12)。 * * * * p < 0.05, p < 0.001。
虽然整个E蛋白的同源性是60 - 70%血清型,特定类型的抗原表位的目标似乎hmAbs位于不同地区的E蛋白在病毒粒子。 如图所示结构研究表明,DENV3特定类型的足迹hmAb 5 j7坐落在EDI / EDII铰链区,它跨越三个不同分子在一个木筏24。 DENV2特定类型的hmAb 2 d22摊位,另一方面,目标主要是EDIII和EDII包括融合循环23,29,而DENV1特定类型1 f4抗原决定基是围绕EDI和延伸到EDI / EDII铰链区25。 抗原决定基的映射逃避突变体就是两个独立的单核苷酸突变1 f4抗原决定基(氨基酸改变位置274 DI-DII铰链和47 E DI的蛋白质),导致失去中和22。 最近的研究强调,多克隆血清自然DENV-infected个人或接受者登革热疫苗的跟踪与复杂的第四纪不同程度5 j7和2 d22摊位hmAbs的抗原表位31,32。 到目前为止,两个强大的DENV1特定类型马伯孤立和特征,即1 f425和14 c1026。 血清的接受者Dengvaxia®四价的登革热疫苗被证明跟踪与1 f4抗原决定基移植到一个DENV3骨干33。 在这里,我们采用嵌合病毒,rDENV2/1,显示1 f4抗原决定基测量抗体针对这种抗原决定基的患病率在两个种群在亚洲和美洲。 值得注意的是,这是第一次应用了嵌合病毒来衡量一个特定于类型的抗原决定基的地区受到不同的基因型,因此提供了一个深入的分析DENV1抗原决定基的曲目。
IIb期临床试验的结果Dengvaxia疫苗证明减少保护DENV2疾病,尽管高血清转化和几何平均DENV2中和滴度44。 一种看似合理的解释是:疫苗没有诱导DENV2特定类型中和抗体,而是,一个大的人口可交叉反应的中和抗体34。 在这种情况下,特定类型的测量工具,使疫苗引发的中和抗体反应需要指导疫苗的设计和评价。 虽然它已经表明,特定类型让大多数的初等后血清中和抗体34,45,46这些抗体,病毒抗原表位的目标在一个更大的人口仍有待检验。 因此,方法剖析引发的多克隆抗体的特异性反应自然感染相关和必要的。 纵向分析的中和抗体滴度在3和18个月的初等后DENV1感染,我们观察到的低水平的中和DENV2不同的血清型。 血浆样品获得中和能力当DENV1特定类型的氨基酸残基1 f4抗原决定基被移植到DENV2骨干,表明这种抗原决定基特别认可DENV1特定类型多克隆血清抗体人口中等DENV1学习的感染。
在尼加拉瓜的人口,DENV1中和抗体反应的比例应由1 f4抗原决定基在个体差异很大,与一些人显示高水平的抗体针对1 f4抗原决定基,另一组不存在的或非常低水平的DENV1构象表位抗体反应定向,和其他人在中间。 这些发现表明,其他的存在immunodominant DENV1曲目中的抗原表位,如hmAb 14 c1026。 而1 f4足迹仅限于EDI和EDI / II铰链区一个E分子,14的足迹c10包括EDI / II铰链区和EDIII相邻E在病毒表面蛋白26。 结构的研究显示,14 c10和1 f4 hmAbs绑定到EDI / EDII铰链重叠的区域,这可能表明,特定类型中和优先目标这一地区E蛋白的抗体。 还需要进一步的研究来评估的重要性14 c10和其他人类配型DENV1中和抗体的抗原表位为目标。 此外,内在宿主基因多态性可能影响germline-encoded抗体和随后的抗原识别,这可以部分解释1 f4的变异性研究人群的认可。
除了异构的中和抗体发生率1 f4抗原决定基在尼加拉瓜的人口,我们观察到的不同模式的收益或损失的中和反应由于之间的抗原决定基3和感染后18个月。 很大一部分人保持同样比例的DENV1特定类型的反应应由1 f4抗原决定基在3和18个月。 有趣的是,许多个人获得DENV1中和指向1 f4抗原决定基在随后的时间点。 在这一部分,我们观察到整体DENV1 NT的衰变50价值观和轻微减少DENV2滴度,这可以归因于减弱可交叉反应的浓度22,47。 因此,在这些个体,1 f4-like抗体占更大比例的DENV1多克隆中和在随后的时间点。 相反,一个很小的子集的个人失去了应对1 f4抗原决定基在18个月。 类似于我们之前发现主DENV3 5 j7抗原决定基的情况31,我们观察到一个上升cross-neutralizing抗体滴度在这个小的子集的人失去了识别特定类型的抗原决定基。 在所有三个组,rDENV2/1中和抗体滴度随着时间的推移保持相对恒定。 内存在多个特定类型中和抗原表位DENV1曲目可以解释的数据显示衰变DENV1中和滴度,而1 f4中和滴度保持不变。 另外,DENV1特定类型的衰退中和活动也可以归因于不同的血清型中和滴度的增加。 dengue-endemic地区许多最近的研究已经表明维护可交叉反应的浓度中等DENV学习的感染,可能由于“刺激”,异形的再感染的抗体阈值的新感染8,31,48。
大量研究证实中和抗体滴度为登革热疾病相关的保护7,8,9。 尽管如此,同型的再感染在尼加拉瓜49和秘鲁50已报告,以及突破人感染后免疫的血清型有问题吗51,52。 一个假设来解释这些观察基因型的变化在每一个血清型,可能导致中和逃跑。 越来越多的研究表明基因型变异在中和反应的影响39,53,54,55,56,57。 重要的是,最近DENV疫苗临床试验结果指出更高的功效,当疫苗DENV4基因型匹配一个循环在免疫发生的地方39,51。 比较流行的f4抗原决定基的地区受到DENV1不同基因型的影响,我们从斯里兰卡包括样品,我在哪里基因型循环,在与尼加拉瓜,基因型V。 类似于尼加拉瓜人口1 f4中和不同的水平在斯里兰卡的个人分析。 然而,一个更高比例的受试者从斯里兰卡中和抗体追踪DENV1 1 f4抗原决定基比尼加拉瓜人口。 抗原制图分析,斯里兰卡DENV1免疫血清分组接近rDENV2/1应变比尼加拉瓜血清。 1 f4抗原决定基显示在rDENV2/1嵌合体是来自第四DENV1基因型毒株。 有两个氨基酸残基之间的不同移植1 f4表位和相应的地区DENV1基因型V(尼加拉瓜应变)和1残留,移植1 f4抗原决定基之间的变化和相应的地区DENV1基因型(斯里兰卡应变)。 还需要进一步的研究来确定这些特定的变化或其他因素负责观察到抗体特异性差异尼加拉瓜和斯里兰卡的科目。 综上所述,我们的分析突出的重要性,捕捉intra-serotype在分析小说中和抗原表位基因型的变化,以及需要genotype-defined嵌合病毒。 结果表明Dengvaxia疫苗后驱动DENV4特定类型中和抗体反应在许多个人34筛分析表明疫苗功效更大的反对DENV4 II基因型(vaccine-matched基因型)基因型52。 这里我们的研究可以帮助与理解疫苗刺激DENV1特定类型的性能DENV-seronegative儿童的中和抗体。
总之,我们证明1 f4 DENV1特定类型的抗原决定基是一个重要的组成部分抗原决定基曲目在大量的个人经历了自然DENV1感染。 微分识别的抗原决定基人群暴露于不同DENV1基因型提供了证据表明intra-serotype氨基酸的变化会导致特定类型的中和抗体的变化。 重要的是,1 f4抗原决定基的实质性的变化识别在尼加拉瓜和斯里兰卡人口中显示额外的抗原表位DENV1曲目也推动特定类型中和和值得进一步调查。
儿科登革热的协议队列研究登革热和儿科医院研究综述了在尼加拉瓜的机构审查委员会批准的加州大学伯克利分校(队列# 2010-09-2245; 医院# 2010-06-1649)和尼加拉瓜卫生部(队列NIC-MINSA / cndr -涂蜡的09/03/07 - 008. - ver1; 医院NIC-MINSA / CNDR-CIRE-01/10/06-13。 版本14)。 父母或法定监护人的受试者参与这些研究提供书面知情同意,和参与者同意提供6岁及以上。 伦理批准这项研究获得了伦理审查委员会的医学院,斯里兰卡科伦坡大学。 北卡罗莱纳大学(UNC)机构审查委员会决定,批准并不是必需的,因为参与UNC调查人员没有参与人体研究(豁免# 14 - 0195)。 只有那些提供书面知情同意参加这项研究。
(i)研究登记发生在医院Infantil曼努埃尔·德·耶稣里维拉,尼加拉瓜全国儿科医院参考。 孩子6个月至14岁涉嫌DENV感染(< 7天以来出现症状)都有资格参与医院的研究,如前所述58。 实验室确诊病例是由疾病严重度分类根据1997年世卫组织的指南4使用一个计算机化的算法,编译所有临床数据会议标准登革热(DF)、登革出血热(DHF),或登革休克综合征(DSS)58。 血浆样本中收集急性疾病1到6(天)和恢复期的(天14至28日post-onset症状)的阶段,以及3、6、12、18个月后疾病。 (2)小儿登革热队列研究登革热是一个持续的前瞻性队列研究,大约3700 2 - 14岁的儿童区二世的马那瓜,尼加拉瓜59。 健康年度收集血液样本4参与者从第一年到4初等后DENV1感染。 (3)在斯里兰卡,康复的DENV-immune血清得到来自个人参与医院发热性疾病研究,招募受试者疑似登革热(样本收集实验室确认后20 - 65天DENV1感染),这是完全Raut中描述等。60或从健康的人捐献的血液血库,单型的中和抗体DENV1。
在尼加拉瓜的研究中,DENV感染被特定类型rt - pcr检测病毒RNA61、隔离的DENV C6/36细胞61和/或血清转化,IgM酶联免疫吸附试验(ELISA)62或> 4倍增加总抗体效价以抑制ELISA急性和convalescent-phase配对样本10,63。 在医院的研究中,主要由登革热病例抑制ELISA,抗体滴度的< 2560天14-28 post-onset症状(早期康复的阶段)定义主要的感染状况58。 队列研究,主要感染DENV是检测到血清转化(< 1:10 > 1:10的效价由抑制ELISA)在连续成对年度样本59。 抑制ELISA搭配健康年度样本证明第一次感染DENV1后,没有抗体滴度> 4倍增加(补充表S2),这表明这些人没有经验后续感染从1到今年4初等后感染。 这是支持的观察在NT没有增加50滴度四年期间(无花果。5 a、B)。 在斯里兰卡的研究中,主要DENV1被定义为个人发烧的急性感染标本阳性DENV1通过PCR和消极DENV-specific免疫球蛋白64,65。 从七个人与实验室确认主要DENV1感染,康复的标本收集20 - 65天后表示用于当前的研究。 我们还发现了有主要DENV1免疫筛选健康人群在斯里兰卡中和抗体的存在4 DENV血清型如前所述66。 五个标本个体与中和抗体只DENV1(单型的)也用于当前的研究。
U937细胞表达DC-SIGN(树突特异性细胞粘附molecule-3-grabbing nonintegrin),一个已知DENV附件因子,用于中和化验。 U937细胞保持悬浮细胞培养在37°C公司为5%2在RPMI 1640 (Gibco)补充1%非必需氨基酸,1%青霉素和链霉素,5%胎牛血清(的边后卫,HyClone)。 传播的父母DENV1(西Pac 74)和DENV2 (S16803)病毒和病毒重组rDENV2/1执行白纹伊蚊C6/36在32细胞生长°C在5%股份有限公司2。
测量DENV-specific中和抗体,我们采用流cytometry-based化验,如前所述67。 简而言之,DENV-immune等离子体初始稀释的样本1:5连续稀释3重8倍RPMI补充2%的边后卫。 稀释的病毒感染的8 - 15%之间U937细胞(以前由病毒滴定)添加到血浆稀释和孵化1 h在37°c .感染在96孔板进行混合,在每个,50000 U937DC-SIGN uL的病毒与细胞的总量100µl完成RPMI媒体。 细胞培养在37°C公司5%2为24小时。 接下来,细胞被固定在4%多聚甲醛,在室温下培养10分钟(RT),并在252×g离心5分钟。 随后,细胞被封锁在透化作用缓冲(0.1%的皂苷,5%的牛血清白蛋白在1 x磷酸盐(PBS))为30分钟rt,然后,细胞被孵化anti-E马伯4 g2共轭Alexa 488稀释在阻止缓冲区(0.5%牛血清白蛋白和叠氮化钠0.02% 1 x PBS) 25分钟在rt,最后,细胞被洗和resuspended PBS。 收购番石榴的感染细胞进行流式细胞分析仪(EMD Milipore)闸门Alexa 488 -阳性细胞。 减少了感染的中和抗体效价50% (NT50)是由非线性计算,4-parameter剂量反应与棱镜软件回归分析(GraphPad),即表示为倒数血清稀释。 生成的数据必须符合质量控制标准,在s形剂量反应回归健康包括绝对平方和< 0.2和确定系数(R2> 0.9)。
统计分析了使用棱镜图垫5.0(拉霍亚,CA)。 单向方差分析(方差分析)是用来比较NT50值的嵌合病毒和父母的病毒早期康复的,3和post-illness 18个月。 配对t测试是用来比较DENV1特定类型中和反应的比例应由1 f4抗原决定基之间的样本收集3至18个月感染后。 统计差异被认为是显著的假定值< 0.05时。
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