肺腺癌(LUAD)是全球癌症相关死亡的主要原因之一。 有迫切需要发现致病机制来开发新的治疗方法。 Agmatinase (AGMAT)的表达及其与临床病理的关系通过地理特征进行了分析,Oncomine, TCGA数据库,包含IHC染色在人类LUAD标本。 一个EdU细胞增殖工具包,propidiumiodide染色,集落形成,细胞迁移和入侵检测,异种移植肿瘤模型被用来检测在LUAD AGMAT的生物功能。 此外,一氧化氮(NO)的表达水平检测使用DAF-FMDA荧光探针或亚硝酸盐试验装备,并进一步验证与Carboxy-PTIO(没有清除剂)。 角色的三种亚型的一氧化氮合成酶(nNOS、以挪士和伊诺)验证使用L-NAME(以挪士抑制剂),SMT(伊诺抑制剂)和亚精胺(nNOS抑制剂)。 AGMAT表达上调LUAD组织。 LUAD AGMAT水平的高血压患者预后差。 AGMAT提升LUAD肿瘤发生在没有发布的伊诺在体外和体内。 重要的是,没有信号上调表达的细胞周期蛋白D1通过激活MAPK和PI3K / Akt-dependent原癌基因活动,最终促进肿瘤细胞的恶性增殖。 总的来说,AGMAT提升通过调控伊诺的表达没有释放。 高水平的不开LUAD肿瘤发生通过激活MAPK和PI3K / Akt瀑布。 AGMAT可能是一个潜在的对LUAD病人诊断和治疗目标。
肺癌是最常见的癌症诊断和全球癌症死亡的最常见原因。据2018年GLOBOCAN估计癌症发病率和死亡率由国际癌症研究机构1。 有210万个新的肺癌病例和180万例死亡预测2018年代表接近1 5例(18.4%)因癌症死亡1。 肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌2,3.。 NSCLC代表~ 85%的所有情况下,肺腺癌(LUAD)是最诊断为非小细胞肺癌的组织学亚型,其次是鳞状细胞癌2,4。 虽然主要的致癌因素(例如,表皮生长因子受体,喀斯特,alaska airlines)在LUAD已报告在过去的20年5,迫切需要确定新的治疗目标由于肿瘤的异质性。
Agmatinase (AGMAT)可以灭活胍基丁胺,函数作为中介在聚胺生物合成,合成后由精氨酸脱羧精氨酸脱羧酶(ADC)6。 尽管AGMAT显著影响聚胺生物合成途径7直到1994年,证明了胍基丁胺和agmatinase可以合成了哺乳动物8。 胍基丁胺已被证明有一个广泛的生物效应,包括细胞增殖的抑制作用9,10肾小球滤过率,刺激11和一氧化氮合酶的规定12,13。 因此,有相当大的兴趣在理解胍基丁胺的生理机制监管水平。 尽管AGMAT氨基酸代谢中起着重要的作用,有报道其疾病的作用有限,尤其是在肿瘤。 AGMAT表达式是减少与乳腺癌和糖尿病患者肾透明细胞癌患者14,15。 此外,AGMAT能促进大肠癌的发展通过诱导慢性炎症16。 然而,生物功能,临床病理的特点,和监管机制的AGMAT LUAD仍然知之甚少。
内皮一氧化氮合酶(以挪士),神经元一氧化氮合酶(nNOS)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)没有被描述为三种合酶同功酶在哺乳动物17,18。 一氧化氮(NO)是一种高活性激进和在许多生理现象起着重要的作用19。 此外,因为没有提供持续的血管张力的维护和功能作为神经递质,它已成为在这些领域的主要研究目标20.。 在肿瘤细胞中,没有可以刺激血管生成和扩张小动脉的血管21,以及增加血管通透性22。 增殖蛋白激酶(MAPKs)信号组件,起着重要的作用在复杂的细胞程序,包括增殖、分化、开发、转换和细胞凋亡23,24。 此外,MAPK通路和一氧化氮合成酶是密切相关的,没有可以直接MAPKs发挥它的功能25。
在目前的研究中,我们发现AGMAT MAPK途径的关键效应LUAD恶性表型的细胞通过调节进气阀打开生产。 AGMAT上调在LUAD LUAD患者的不良预后显著相关。 的upregulation AGMAT LUAD细胞生长,集落形成,细胞周期进展,没有的分泌,而沉默AGMAT抑制这些影响。 AGMAT大大促进了Erk1/2的磷酸化,P38和Akt,调节cyclinD1的表达。 此外,AGMAT被发现的关键效应影响MAPK通路调节LUAD恶性表型。 本研究显示的功能角色AGMAT LUAD的开发和发展。
三个基因表达数据集(GSE1007226,GSE2193327,GSE3286328从基因表达综合(下载)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库。 Oncomine (https://www.oncomine.org)是一个公共的微阵列资料数据库和下一代测序。 TCGA LUAD和正常的肺数据集从TCGA数据库检索使用cBioPortal(临时)(http://www.cbioportal.org)。 总共有515 LUAD病人和59正常肺组织AGMAT表达数据分析。 患者的生存和卡方分析,LUAD AGMAT基因表达水平低(低30%;n= 155)比较与高水平的基因表达(上面的30%;n= 155)。
的全球mRNA表达谱的一个子集,TCGA LUAD进行使用GSEA 2.0.9软件(http://www.broadinstitute.org/gsea/)。 GSEA, AGMAT表达式用作数值变量。 之前估计的统计意义ES浓缩在每组的得分规范化,错误发现率计算,基因GSEA排名的指标是设置为“皮尔森”22。
组织微阵列芯片包含50双LUAD组织样本匹配他们的相邻NT肺组织样本从Alenabio购买(西安,中国)。 石蜡包埋部分deparaffinized,水化,阻塞,如前所述29,30.。 孵化后的部分用了反单克隆AGMAT抗体(1:10 0; 美国sc - 166414,圣克鲁斯,TX),他们孵化biotin-labeled鼠抗体抗体。 组织微阵列是可视化streptavidin-conjugated辣根过氧化物酶和3,3-diaminobenzidine (DAB)。 根据染色细胞的数量(0≤5%,阳性细胞; 6 - 30%阳性细胞,1; 31 - 50%阳性细胞,2; 51 - 80%阳性细胞,3; 和阳性细胞> 80%,4)和染色强度(没有染色,0; 轻微染色,1; 温和的染色,2; 和严重的染色,3),每个样本得分。 最后的得分是阳性细胞百分比之和和染色强度。
人类LUAD细胞系A549和NCI-H1975购自中国科学院细胞银行(中国上海)和培养rpmi - 1640中含10%胎牛血清的边后卫。 海拉和293 t细胞在DMEM培养基培养是从写明ATCC买来的,含10%胎牛血清的边后卫。 所有的细胞都维持在37°C公司5%2孵化器。
AGMAT表达式构造是由人类AGMAT cDNA到pcDNA3.1-puro质粒扩增全长的菌进行基因。 两个成分序列,shRNA # 1 (CCATATTGCAAGCGATGGCAA)和shRNAi # 2: (CAAACCCATTTATATCAGCTT)和非特异性炒shRNA序列,构造成一个pSuper-retro-puro向量。 A549和NCI-H1975细胞进一步转导pSuper-retro-puro-AGMAT成分或pSuper-retro-puro-Control成分5天,之后2μg /毫升嘌呤霉素的细胞被选中了2周。 转染293 t细胞分成三个质粒(pCDH-AGMAT、psPAX2 pMD2.G)产生AGMAT-expressing慢病毒。 A549和NCI-H1975细胞融合80%感染了空或者使用5μg /毫升聚凝胺AGMAT-expressing慢病毒。
与AGMAT质粒转染24 h后,海拉细胞被镀到玻璃盖玻片24 h。 在4%多聚甲醛固定后,permeabilizing Triton x - 100, 0.1%的细胞被孵化anti-AGMAT与相应的抗体或anti-Flag随后孵化Cy3或Alexa萤石488共轭二次免疫球蛋白抗体。 DAPI用于染色细胞的细胞核。
总RNA提取使用试剂盒对A549和NCI-H1975细胞总RNA分离试剂(表达载体)。 AGMAT RNA水平被发现使用中存在根据制造商的协议。 AGMAT和GAPDH表达水平的测量使用2−ΔΔCt方法。 使用以下引物序列:AGMAT,向前:CTTGTCGAAGTTTCACCACCGTA,相反:CTTTGGGGAGAGCACATAGCATC; 和GAPDH,向前:CCCACTCCTCCACCTTTGAC,相反:TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC。
治疗的细胞和组织细胞溶解使用裂解缓冲(1毫米EDTA, 1% SDS,德勤5毫米,10毫米PMSF, 50 mM Tris-HCl pH值8.0,和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)。 总细胞溶解产物8%或10% sds - page分离,然后electroblotted到PVDF膜。 西方墨点法进行使用AGMAT (1:1000; 美国sc - 166414,圣克鲁斯,TX),标志(1:20 00; 20543 - 1 - ap、proteintech美国IL) phospho-Erk1/2 (1:4000; # 8544年,春秋国旅,波士顿,美国),Erk1/2 (1:4000; # 4695年,春秋国旅,波士顿,美国),phospho-P38 (1:20 00; # 4511,春秋国旅,波士顿,美国),P38 (1:20 00; # 8690年,春秋国旅,波士顿,美国),phospho-Akt (1:20 00; # 4060,春秋国旅,波士顿,美国),一种蛋白激酶(1:20 00; # 4691,CST、波士顿、美国),原癌基因(1:20 00; # 13987年,春秋国旅,美国波士顿)CyclinD1 (1:20 00; 60186 - 1 - ig proteintech,,美国),伊诺(1:20 00; # 2982,CST、波士顿、美国),以挪士(1:20 00; # 5880,CST、波士顿、美国),以挪士(1:20 00; # 4231年,春秋国旅,波士顿,美国),和β-actin (1:4000, sc - 81178,圣克鲁斯,TX,美国)。
1×10的密度4治疗细胞(overexpressing或稳定沉默AGMAT)被播种到24-well盘子。 细胞数量统计在24、48、72、96和120 h。 此外,细胞治疗(overexpressing或稳定沉默AGMAT)进行了使用一个EdU工具包(C10310-1 RiboBio)检测增殖能力根据制造商的协议。
集落形成试验,600年对A549和NCI-H1975细胞(overexpressing或稳定沉默AGMAT)被播种和培养RPMI DMEM培养基含有10%的边后卫8或10天,分别。 这些克隆被固定在甲醇与结晶紫染色方案。
治疗细胞(overexpressing或稳定沉默AGMAT)收集并固定在70%乙醇在一夜之间在4°C。 与冰冷的PBS洗涤三次后,细胞在500年resuspendedμL PBS包含50μg /毫升propidiumiodide(π)在室温下在黑暗中30分钟。 细胞周期分布被流仪检测分析。 数据分析使用ModFit软件。
迁移和入侵检测使用transwell室进行。 迁移试验,1×105LUAD细胞稳定overexpressing或压制AGMAT resuspended RPMI 1640介质上transwell室。 入侵检测,2×105LUAD细胞稳定overexpressing或压制AGMAT resuspended RPMI 1640中有0.1%的边后卫上transwell钱伯斯涂层与基底膜基质。 钱伯斯被放置在底部RPMI 1640中含有10%的边后卫。 钱伯斯是沾0.5%结晶紫。 迁移和入侵细胞与显微镜检测。
使用膜联蛋白的细胞凋亡测定V-PE / 7-AAD凋亡工具包(MultiSciences AP104)。 简单地说,2×106NCI-H1975 A549细胞overexpressing AGMAT或稳定沉默AGMAT与冰冷的PBS洗两次,孵化与5μL膜联蛋白V-FITC和10μL 7-AAD 5分钟在黑暗中,并通过流式细胞仪检测。
细胞内没有检测到生产DAF-FMDA (Beyotime S0019,中国)。 治疗后,这些细胞被洗了三次与冰冷的PBS和孵化DAF-FMDA(5毫米)30分钟在黑暗中在室温下。 使用荧光显微镜DAF-FM荧光强度检测。
细胞外没有发现使用亚硝酸盐测定生产设备根据制造商的协议(Beyotime S0023,中国)。 治疗后,50μL上层清液从每个样本的收集和混合黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和硝酸还原酶37°C为30分钟。 乳酸脱氢酶(LDH)和LDH缓冲区被添加到每个样本。 30分钟后孵化,50μL格里斯试剂我和50μL格里斯试剂二世在黑暗中被添加了15分钟,和每个样品的吸光度检测使用一个微型板块分光光度计在540海里。 每个样本的水平没有根据标准曲线计算。
总共6×106NCI-H1975 /控制成分或NCI-H1975 / AGMAT shRNA # 1细胞和4×106A549 /控制成分或A549 / AGMAT shRNA # 1细胞皮下注入每个BALB / c的两翼ν鼠标(n= 6)。 21天之后,所有老鼠死亡,肿瘤被剥夺了,体重,然后进行免疫组织化学分析和免疫印迹。
数据提出了均值±标准差(SD)和执行使用GraphPad棱镜5。 生存曲线所描述的kaplan meier使用生存率较情节和计算。 一个独立的学生t -测试(双尾)应用于确定统计两组之间的差异。 *p< 0.05; * *p< 0.01; 和* * *p< 0.001被认为是具有统计学意义。
三个公开的微阵列数据集LUAD患者分析AGMAT信使rna表达水平之间LUAD组织和相应的正常组织。 分析表明,AGMAT的表达明显上调LUAD与对应的相邻正常组织(图。1)。 Oncomine数据库被用来进一步分析AGMAT表达水平在其他LUAD数据集,并分析地理数据库的数据库是惊人的一致(图1 b。S1)。 TCGA数据库,LUAD组织的AGMAT基因表达水平显著高于正常肺组织(1 c)。 阐明的相关性AGMAT过度LUAD患者的临床病理学特征,我们进行了卡方检验。 我们的研究结果表明,高水平的AGMAT mRNA表达呈正相关,pT状态(P= 0.004),pN状态(p= 0.002)和临床阶段(P= 0.0003)(表1)。 调查的相关性AGMAT mRNA水平的预测LUAD病人,执行kaplan - meier生存分析。 结果表明,患者AGMAT超表达趋势有更高的死亡率,缩短recurrence-free生存,和更短的总生存期(OS)(1 d, f)。 此外,一个广泛的组织微阵列分析50双匹配LUAD和相应的NT组织样本进行使用免疫组织化学(包含IHC)。 我们发现AGMAT蛋白质水平显著(P< 0.0001)上调LUAD相比与对应的相邻正常组织(图。1 g h)。 这些观察表明,AGMAT RNA和蛋白质水平显著调节LUAD,表明AGMAT可能作为预后分子标记和肿瘤发生的启动子。
一个分析AGMAT mRNA表达配对LUAD组织的三个LUAD mRNA表达分析数据集(GSE10072, GSE21933, GSE32863)。b分析AGMAT mRNA表达从Selamat LUAD和正常的肺组织肺数据集根据Oncomine数据库。cTCGA的分析数据库的水平AGMAT mRNA表达在正常肺组织和LUAD组织。d- - - - - -f低水平的患者相比LUAD AGMAT表达(30%)越低,患者高AGMAT mRNA表达有更高的死亡率,缩短DFS, TCGA LUAD标本军团和操作系统。g代表包含IHC LUAD AGMAT表达的组织和相应的图像相邻正常肺组织。hAGMAT表达分数差异LUAD组织(n= 50)和相邻的正常肺组织(n= 50)作为一个箱线图所示
调查AGMAT在癌症恶化的影响,构建生成的国旗标签(6个氨基酸)融合的长篇AGMAT成绩单。 表示构造转染到海拉细胞24 h,国旗和AGMAT使用anti-Flag和anti-AGMAT抗体进行免疫染色。 结果表明,国旗和AGMAT免疫荧光染色在AGMAT-Flag-transfected显著增加细胞(图。2 a, b)。 此外,AGMAT蛋白质定位的海拉细胞与先前的包含IHC分析是一致的。 表明构建过表达在NCI-H1975和A549细胞,AGMAT-Flag融合蛋白表达水平是由RT-qPCR和免疫印迹anti-Flag和AGMAT抗体(图。2 c, d)。
一个,b表示构造在海拉细胞稳定表达,国旗和AGMAT immuno-stained使用anti-Flag和AGMAT抗体,分别。c,d的超表达AGMAT RT-q-PCR和免疫印迹检测NCI-H1975和A549细胞。eGSEA情节表明之间的DNA复制签名和AGMAT信使rna表达水平和细胞周期之间的签名和AGMAT信使rna表达水平显著相关,TCGA的腺癌标本军团。f,gAGMAT瞬态超表达在细胞增殖能力的影响f和细胞周期g在NCI-H1975和A549细胞检测。h- - - - - -jAGMAT稳定的超表达对细胞生长的影响h,集落形成我、迁移和入侵j在NCI-H1975和A549细胞检测。 数据被表示为±SEM。 *p< 0.05,* *p< 0.01或* * *p< 0.001
识别的可能功能AGMAT,全球mRNA的表达谱,TCGA LUAD使用GSEA软件进行。 GSEA表明样品与高AGMAT表达式主要富集在细胞周期基因集和DNA复制基因集,表明AGMAT可能与细胞增殖密切相关(2 e)。 调查的角色AGMAT LUAD, AGMAT是暂时性的转染到NCI-H1975 A549细胞。 我们发现AGMAT增加扩散能力的过度(2 f),促进了细胞周期进程(2 g)。 为了确定AGMAT参与LUAD细胞对细胞凋亡的影响,膜联蛋白V / 7 aad工具被用来检测细胞凋亡。 然而,没有明显的差异之间的过度凋亡率AGMAT组和NC组(S2)。 接下来,我们构造LUAD稳定细胞系overexpressing AGMAT通过慢病毒载体(S3)。 我们发现AGMAT提升LUAD细胞增长的稳定的超表达(2 h),集落形成(2),迁移和入侵(2 j)。
进一步验证的作用AGMAT LUAD的进展,我们构造稳定细胞系沉默AGMAT使用成分。 AGMAT mRNA和蛋白水平明显降低检测到存在和免疫印迹(图。3 a, b)。 我们观察到相反AGMAT过度,稳定的AGMAT沉默抑制细胞增殖(3 c, d),集落形成(图。3 e),细胞周期进展(3 f),迁移和入侵(3 g)。 此外,稳定沉默AGMAT对细胞凋亡NCI-H1975和A549细胞没有影响相比,对照组(S4)。
一个,bAGMAT表达式在NCI-H1975稳定沉默,A549细胞,由RT-q-PCR检测和免疫印迹。c- - - - - -g稳定AGMAT沉默在细胞生长的影响c,细胞增殖d,集落形成e细胞周期进程,f、迁移和入侵g在NCI-H1975和A549细胞检测。 数据被表示为±SEM。 *p< 0.05,* *p< 0.01或* * *p< 0.001
调查如何AGMAT促进恶性肿瘤细胞表型,GSEA。 AGMAT信使rna表达水平和精氨酸代谢基因签名通过GSEA(图是密切相关的。4)。 此外,据报道,AGMAT参与精氨酸代谢31。 没有精氨酸代谢的过程中是一个重要的产品。 因此,我们发现AGMAT表达的变化是否影响生产。 细胞内没有检测到生产DAF-FMDA使用荧光显微镜。 结果表明,AGMAT过度导致NCI-H1975和A549细胞水平的大幅增加细胞内没有与增强的荧光,而在对照组的细胞显示低密度荧光(图。4 b)。 此外,有一个更高层次的上层清液中没有分泌NCI-H1975和A549细胞overexpressing AGMAT,与对照组相比(图4摄氏度)。 没有密切相关MAPK和PI3K / Akt通路。 在这里,我们发现的老年病AGMAT可以刺激Erk1/2的磷酸化,P38和Akt,增加原癌基因的表达和cyclinD1 NCI-H1975 A549细胞(4 d)。 Erk1/2激酶的抑制剂U0126), P38激酶(SB203580),一种蛋白激酶激酶(pf - 04691502)和原癌基因(10058 - f4)被用来研究MAPK和PI3K / Akt通路的作用在调节原癌基因活性和细胞周期蛋白D表达式。 vehicle-treated细胞相比,治疗与U0126 SB203580,和pf - 04691502显著降低ERK1/2的磷酸化,P38和Akt,分别,也大大降低了原癌基因的表达和细胞周期蛋白D1(S5A)。 此外,相比vehicle-treated细胞,治疗10058 - f4显著降低细胞周期蛋白D1的表达,和废除AGMAT-induced老年病的细胞周期蛋白D1(S5B)。 相比之下,AGMAT沉默显著降低细胞内和细胞外没有生产(S6A B),减少Erk1/2的磷酸化,P38和Akt,原癌基因的表达和cyclinD1(S6C)。 Carboxy-PTIO,著名的食腐动物,被用来进一步验证的作用没有NCI-H1975 A549细胞overexpressing AGMAT。 结果表明,Carboxy-PTIO扭转了AGMAT过度引起Erk1/2的磷酸化,P38和Akt, upregulation原癌基因和cyclinD1表达式(4 e, g)。
一个GSEA情节表明差异精氨酸和脯氨酸代谢签名和AGMAT信使rna表达水平显著相关,TCGA的腺癌标本军团。b,cAGMAT进行靶向治疗36 h后,细胞内和细胞外没有确定使用DAF-FM DA染色和亚硝酸盐试验装备,分别。d后AGMAT过度36 h,磷酸化水平Erk1/2, P38, Akt,以及Erk1/2的总体水平,P38, Akt, AGMAT,原癌基因,cyclinD1取决于蛋白质印迹。d- - - - - -f36 h后AGMAT超表达,细胞治疗没有清道夫,Carboxy-PTIO(100μM) 1 h。 细胞内的水平d和细胞外e没有确定。f磷酸化水平Erk1/2, P38和Akt,和总Erk1/2, P38, Akt, AGMAT,原癌基因,cyclinD1被确定。 数据被表示为±SEM。 *p< 0.05,* *p< 0.01或* * *p< 0.001
探索AGMAT机制促进没有生产,我们应用三个具体的一氧化氮合酶抑制剂,L-NAME(以挪士抑制剂),SMT(伊诺抑制剂)和亚精胺(nNOS抑制剂)。 我们发现,SMT抑制细胞内的分泌物(5)和细胞外(图。5 b)没有AGMAT的过度造成的。 我们还观察到的表达增加后伊诺AGMAT过度(5度)。 伊诺的表达被抑制在NCI-H1975和A549细胞稳定沉默AGMAT(5 d)。 此外,Erk1/2的磷酸化,P38和Akt,原癌基因和cyclinD1表达式的upregulation upregulation造成的SMT AGMAT被封锁的LUAD细胞(图。5 e)。 进一步证明AGMAT专门调节进气阀打开,同义突变sAGMAT-Flag质粒构建和应用表达AGMAT-attenuated AGMAT蛋白质的细胞。 我们发现恢复AGMAT促进细胞内的表达(图。5 f)和细胞外(图。5克)没有AGMAT-attenuated细胞。 然而,AGMAT表达式不能提高细胞内的分泌物(图。5 f)和细胞外(图。5克)没有在SMT AGMAT-attenuated细胞和相应的控制细胞。 SMT也抑制细胞内的分泌物(5 f)和细胞外(图。5克造成的)不恢复AGMAT AGMAT-attenuated细胞的表达。 此外,Erk1/2的磷酸化,P38和Akt,原癌基因的upregulation cyclinD1表达式恢复造成的表达式AGMAT被封锁的SMT AGMAT-attenuated细胞和相应的控制细胞(5 h)。 总的来说,我们的研究结果表明,AGMAT是一个关键效应MAPK和PI3K / Akt通路的调节进气阀打开。
一个,bAGMAT超24 h后,细胞治疗L-NAME(100μM),贴片(1毫米),或亚精胺为24小时(1毫米)。 细胞内的水平一个和细胞外b没有决心。c,d后AGMAT过度36 h或稳定沉默,nNOS水平,以挪士,伊诺表达式被免疫印迹检测。eAGMAT超24 h后,细胞治疗L-NAME(100μM),贴片(1毫米),或亚精胺为24小时(1毫米)。 磷酸化水平Erk1/2, P38和Akt,和总水平Erk1/2, P38, Akt, AGMAT,原癌基因,cyclinD1被确定。f- - - - - -h指定的同义突变sAGMAT-Flag质粒或其控制质粒转染到NCI-H1975 A549细胞稳定沉默AGMAT表达式或进入细胞的对照组。 质粒转染24 h后,细胞治疗SMT(1毫米),或24小时。 细胞内的水平f和细胞外g没有决心。h磷酸化水平Erk1/2, P38和Akt,和总水平Erk1/2, P38, Akt, AGMAT,原癌基因,cyclinD1被确定。 数据被表示为±SEM。 *p< 0.05,* *p< 0.01或* * *p< 0.001
BALB / c裸小鼠皮下注射稳定沉默AGMAT细胞和控制细胞的左右两翼,分别。 体内生长NCI-H1975明显较弱,A549细胞异种移植由AGMAT-stably沉默与由控制细胞(6 a、b)。 此外,Ki67染色结果与这一现象(图一致。6摄氏度)。 NCI-H1975和A549异种移植肿瘤细胞溶解。 与对照组相比,Erk1/2, P38,和一种蛋白激酶磷酸化,伊诺的表达,原癌基因,和cyclinD1 AGMAT-silenced组显著减少(图6 d)。 总的来说,我们的研究结果表明,AGMAT促进体内LUAD细胞恶性表型,这与体外结果是相一致的。
沉默AGMAT抑制体内LUAD细胞的致瘤性。一个NCI-H1975和A549细胞的体内生长线稳定沉默AGMAT检查。 代表图像表示组裸体小鼠的肿瘤。b介绍了异种移植肿瘤的重量(n= 6)。c代表图像Ki67染色表明细胞在肿瘤形成。d肿瘤细胞溶解和磷酸化水平Erk1/2, P38, Akt,和总水平Erk1/2, P38, Akt, AGMAT,进气阀打开,原癌基因,cyclinD1被检测到
的示意图表示agmatinase促进肺腺癌肿瘤发生机制
在目前的研究中,我们证明了这两个AGMAT mRNA和蛋白表达水平上调LUAD组织与正常肺组织通过分析地理相邻,Oncomine, TCGA数据集,以及人类LUAD组织微阵列。 kaplan meier生存分析显示,患者overexpressing AGMAT LUAD-associated死亡的风险更高比患者低AGMAT表达,他们趋势有较高的死亡率和较短的操作系统。 AGMAT的过度表达在人类LUAD细胞系透露,AGMAT促进细胞增殖,集落形成,移民,和入侵,而沉默AGMAT有相反的效果。 此外,稳定沉默AGMAT减少NCI-H1975和A549肿瘤异种移植小鼠的生长。 AGMAT帮助LUAD细胞恶性表型获得增殖能力的提高、运动性、侵袭性,导致体内的增长LUAD异种移植由AGAMT稳定沉默细胞明显受损。 此外,我们发现AGMAT可以通过移植诱导生产在H1975伊诺和A549细胞的表达。 没有激活MAPK和PI3K / Akt通路,从而调控cyclinD1蛋白质的表达,最终促进人类LUAD细胞的恶性增殖。 以前的研究已经表明AGMAT促进结肠癌的积极进展16。 我们的结果从LUAD是一致的这一发现,进一步支持AGMAT在各种癌症的肿瘤促进效果。 精氨酸具有重要的生理生化功能不同的前体化合物,包括尿素、肌酸、谷氨酸脯氨酸,胍丁胺32,33。 精氨酸降解发生通过多种途径在精氨酸酶的作用下,一氧化氮合酶和AGMAT32,33。 这些途径产生不,胍丁胺,谷氨酸,多胺,和脯氨酸,每个重要的生物功能。 此外,在这些酶和酶异常产品往往会导致一些疾病,包括心血管疾病、肺部疾病,传染性疾病和癌症。 几项研究已经发现,胍丁胺具有显著的抗癌效果。 胍基丁胺被发现抑制六结肠癌细胞系的增殖浓度的方式,以及胍丁胺含量很低在结肠癌癌组织标本34。 胍基丁胺也抑制了肿瘤细胞的增殖的结肠,肝和神经的起源35。 此外,外源胍基丁胺还可以抑制人类白血病HMC-1和HL-60细胞的扩散36。 此外,胍丁胺负责胍基丁胺腐胺在体内的转换37。 胍基丁胺不仅阻止了LPS-induced海拔伊诺的mRNA表达,但也减少了伊诺由有限合伙人的活动,从而抑制亚硝酸盐的产生38,39。 此外,还发现在急性肾损伤模型,胍丁胺减少肾没有和伊诺的水平40。 因此,基于我们的研究结果和出版的文献,我们推测,AGMAT促进伊诺表达式由胍基丁胺水解和没有生产,从而促进肺腺癌的发展。 AGMAT是否由胍基丁胺水解抑制胍基丁胺的抗癌效果,从而表现出促进作用,将是未来研究的重点。 没有/伊诺MAPK和PI3K / Akt通路密切相关。 Hwanglyeonhaedok-tang,传统医学用于治疗胃炎,发现降低伊诺表达抑制MAPK和PI3K / Akt通路的激活在胃癌细胞41。 此外,rifaximin治疗表达下调的释放不,并导致浓度降低一种蛋白激酶的磷酸化,mTOR, p38MAPK42。 我们发现AGMAT晋升没有释放通过调控伊诺表达激活MAPK和PI3K / Akt信号级联。 此外,由进气阀打开不能防止肿瘤细胞化疗药物诱导细胞凋亡43,44。 然而,过度AGMAT或稳定沉默AGMAT没有影响NCI-H1975和A549细胞的凋亡。 我们推测,AGMAT可能影响细胞凋亡LUAD细胞只有当外部不利因素存在,如化疗药物。 这个有趣的现象将是我们下一步的研究工作。
总之,AGMAT老年病相关LUAD患者预后较差。 小说角色的AGMAT LUAD阐明肿瘤发生,的upregulation AGMAT促进细胞生长,细胞增殖,集落形成,细胞周期进展。 此外,AGMAT促进没有释放通过上调伊诺LUAD细胞的表达。 此外,AGMAT MAPK和PI3K / Akt通路的关键效应通过没有生成伊诺。 因此,AGMAT可能作为一种新的预后因素和治疗LUAD目标。
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