血统分析Osr2Cre发育中的小鼠肾脏
为了研究β-catenin信号通路在哺乳动物肾单位分割中的作用，我们开展了β-cateninLOF研究，专门针对小鼠肾脏上皮性肾单位祖细胞。因为β-catenin在肾脏中广泛表达。4CRE的特异性很重要。Wnt4GFPcre (Wnt 4TM3(EGFP/cre)AMC或Wnt 4TM2(EGFP/cre)SVO)24,25和Pax8Cre (帕克斯8tm1(Cre)mbu)26广泛用于靶向肾小管。然而，这些CRE系的表达并不仅限于发育中的肾小管；Wnt4GFPcre也针对髓质间质27以及MNPs的一个子集11,28,29当Pax8Cre除肾单位谱系外，还以收集管道为目标。30...从这些非肾单位小管细胞中去除β-catenin可能间接影响肾单位的分割.因此，我们选择使用Osr2Cre (OSR 2TM2(Cre)建)以前曾被证明是以小鼠肾脏发育中的肾上腺素为靶点的。31...检查Osr2Cre我们利用cre介导的rosa报告(爱3)的激活来进行谱系分析。GT(Rosa)26 SorTM3(CAG-EYFP)HZE)32...我们发现Osr2Cre标记成熟的rv和逗号状的身体，但不是新生的rv，用rosa报告(图)。S2)。在SSB中，Osr2Cre针对的是近端和内侧段，而不是远端段(图)。1A)。为了确定SSB中这些Rosa报告阳性细胞形成的肾单位片段，我们进行了EYFP和肾单位分割标记物的共免疫染色。我们发现罗莎的记者活跃在足细胞、鲍曼胶囊、PT和LOH中。1B-D但它在DT中是不活跃的(如图所示)。1B)。此外，我们发现，不像Wnt4GFPcre或Pax8Cre, Osr2Cre未针对MNPs、髓质间质或CD(图1)。1E)。这些数据表明Osr2Cre特别针对除DT以外的所有肾单位段。我们注意到Osr2Cre肾区新生神经元中具有镶嵌性靶向的Wt 1+细胞(图)S3)但是Osr2Cre用Rosa报告标记肾小球中大多数Wt 1+细胞(图)S3)。这个结果表明Osr2Cre可能不能同时针对SSB的近端和内侧段。
图1(A–E)血统分析Osr2Cre发育中的小鼠肾脏。Cre介导的重组激活EYFP报告基因的表达OSR 2-表达细胞及其后代。(A) Osr2Cre针对S形体的近端(Wt1+)和内侧(Jag1+)段。在肾单位，Osr2Cre目标足细胞(B)，近端小管(C)，和循环的Henle(D)，但不包括远端小管(B)。白箭头B)指向逃跑的足细胞Osr2Cre. (E)由于没有EYFP信号(绿色信号)，我们得出结论：Osr2Cre既不针对帽间质(例如，白色箭头)，也不针对间质细胞(星号)。(Fβ-catenin在S形体中普遍表达.(G) Osr2Cre从S形体的近端(黄色箭头)和内侧(白色箭头)段移除β-catenin。图像是三个独立实验的代表。赫斯特。E18.5阶段标尺：50μm。
我们产生了β-cateninLOF突变肾Osr2Cre并检测了β-catenin在单胞菌中的存在。在对照组肾组织中，β-catenin在SSB中普遍表达(如图所示).1F)。符合Osr2Cre-介导Rosa报告在SSB中的激活(如图所示)。1A我们发现，在β-cateninLOF突变肾中，肾近端和内侧段β-catenin含量明显减少(图1)。1g)。β-catenin在SSB近端段的去除与内侧段的去除相当。这使我们得以研究β-catenin如何调节SSB向近端肾单位段的发育，包括足细胞、PT和LOH。
肾小体的形成需要β-catenin。
为了确定β-catenin在sshb中的丢失如何影响肾单位段的发育，我们研究了β-cateninlof突变肾中的肾单位分割标记物。Osr2Cre (CTNNB 1C/C；OSR 2IresCre/+)及其控制(CTNNB 1c/+；OSR 2IresCre/+)肾脏。我们用了WT 1，莲藕凝集素(LTL)和slc12a1分别标记足细胞、PT和LOH。我们发现所有这些肾单位片段都存在于突变的肾脏中(如图所示)。2A-C)，提示肾单位节段的初始规格是在不含β-catenin的情况下发生的.
图2(A–C)在β-catenin功能缺失突变体肾脏中Osr2Cre，足细胞、近端小管和环呈少量的β-catenin染色，提示CTNNB 1，编码β-catenin的基因被Osr2Cre...缺乏β-catenin的细胞能够形成Wt 1+足细胞(A)，LTL+近端小管(B)，以及Henle的Slc12a1+循环(C)。然而，请注意，β-catenin突变的肾脏呈现Wt1+足细胞的异常排列，较弱的ltl染色和较薄的slc12a1+小管，提示发育缺陷。(D)在β-catenin突变的肾脏中，β-catenin仍然存在于slc12a3+远端小管中，这与以下事实相一致：Osr2Cre不针对远端小管。图像是三个独立实验的代表。E18.5阶段标尺：100μm。
为了证实β-catenin被从突变肾的每个肾单位段中去除，我们检测了β-catenin的表达和肾单位分割标记物。我们发现，在突变的肾脏中，这些肾单位分割标记阳性细胞中β-catenin的含量比对照肾中的相应细胞要少得多(图一)。2A-C)，表明β-catenin基因(CTNNB 1)确实被删除。Osr2Cre...结果表明，β-catenin可作为肾单位发育过程中足细胞、PT和LOH的初始指标.我们还发现，Slc12a3+DT细胞存在于突变的肾脏中(如图所示)。二维空间)但是，由于DT细胞没有被Osr2Cre(无花果)1B这些细胞在突变的肾脏中仍呈β-catenin阳性。二维空间).
我们观察到β-cateninLOF突变体肾中的肾小体有缺陷形成。Osr2Cre...在对照肾中，Wt 1+足细胞包围了肾小体中的PECAM 1+内皮细胞(图1)。3A)。然而，在β-catenin突变的肾脏中，内皮细胞不能在肾小体内聚集，足细胞不能形成正常肾小体的单层新月形特征(图)。3A)。此外，我们发现AKAP 12，是顶叶上皮细胞的标记物(也称为SSeCKS)。33，在突变的肾脏中明显减少。这一结果与先前报道的结果一致，该报告表明，去除了肾上皮细胞中的β-catenin。Pax8Cre肾小球大体结构的缺陷22.
图3肾小体的形成需要β-catenin.(A)对照组肾小体中，Wt1+足细胞以新月形围绕PECAM 1+内皮细胞，AKAP 12标记顶叶上皮细胞。相反，在β-catenin突变的肾脏中，PECAM 1+内皮细胞不能在肾小体内填充，AKAP 12的表达明显降低。(BPECAM 1+内皮细胞侵袭正常肾脏和突变肾S形体的血管裂。在S形体近端，Wt1在内脏上皮细胞和顶叶上皮细胞中均有表达，而Mafb仅在内脏上皮细胞中检测到。在β-catenin突变的肾脏中，内脏上皮细胞和顶叶上皮细胞的初始规格是正常的.图像是三个独立实验的代表。赫斯特。E18.5阶段标尺：50μm。
目的：探讨β-catenin突变肾组织中是否存在肾小体的异常形成。Osr2Cre由于早期内脏上皮细胞(假定足细胞祖细胞)或壁上皮细胞(假定鲍曼囊祖细胞)的缺陷，我们检查了SSB期。我们发现，在对照和突变的SSBs中，内皮细胞迁移到由SSB的近段和内侧段形成的血管裂孔中，说明β-catenin是内脏上皮细胞招募内皮细胞的可有可无的。3B)。在SSB近段，内脏上皮细胞和顶叶上皮细胞表现出明显的细胞形态和差异基因表达。内脏上皮细胞呈柱状排列，壁上皮细胞呈细端至端排列(见图)。3B)。此外，内脏上皮细胞表达。WT1和马福，足细胞发育所需的两个基因34,35,36，而壁上皮细胞则表达WT1，但不是马福(无花果)3B)。我们发现缺乏β-catenin的内脏和顶叶上皮细胞在SSB中表现出正常的细胞形态和基因表达。3B)。我们的结果表明，β-catenin可作为SSB内脏上皮细胞和顶叶上皮细胞的初始指标。
β-catenin是指近端小管发育成分化的近端小管所必需的。
以前，我们已经证明，在发育中的小鼠肾脏中，假定的PT细胞呈现弱的ltl染色，而分化的PT细胞表现出较强的ltl染色，而假定的PT细胞缺乏。HNF4a，一个编码转录因子的基因，在肾脏的PT细胞中特异表达，不能发育成分化的PT细胞。37...我们发现，β-cateninLOF突变肾中的PT细胞与正常肾中的PT细胞相比，LTL染色要弱得多。2B)。由于β-cateninLOF突变肾中PT细胞的ltl染色弱，使人想起了HNF4a突变肾，我们检查假定PT细胞在β-cateninLOF突变肾未能发展成分化的PT细胞。据报道，CdH 6在假定的PT细胞中表达，在ltl染色的PT细胞中表达下调，提示cdh 6标记pt祖细胞。38...与此一致，我们发现CdH 6对照肾组织中LTL的表达和表达(图1)。4)。此外，我们还发现cdh 6阳性细胞和ltl染色细胞都表达hff4a，hff4a是在pt细胞中特异表达的一种转录因子。3以及PT开发所需的37...下调CdH 6同时伴有较强的LTL染色和HNF4a+核间距离的增加，提示PT细胞的成熟和扩增。4)。综上所述，这些观察表明Cdh 6是推测PT细胞的标记物。我们发现，在β-catenin的突变肾中，大多数HNF4a+细胞表现出较强的CdH 6信号和较短的核间距离，说明它们是假定的PT细胞。4和数字S4A)。突变的肾脏不能形成HNF4a+细胞，LTL染色较强，也不表达HNF4a+细胞。Slc5a2，一个成熟的pt标记基因，编码钠-葡萄糖共转运体(如图)。S4B)，提示缺乏β-catenin的假定PT细胞不能发育成分化的PT细胞.我们的结果表明，β-catenin是推测PT细胞进一步发展为分化的PT细胞所必需的。
图4β-catenin是形成分化的近端小管细胞所必需的，具有较强的ltl染色。HNF4a标记推定和分化近端小管。对照组肾近端小管CDH 6信号强，LTL染色弱，分化近端小管CDH 6信号弱，LTL染色强。在β-catenin功能缺失突变体肾脏中Osr2CreHNF4a+细胞均呈较强的CdH 6信号，LTL染色未形成分化的近端小管。图像是三个独立实验的代表。E18.5阶段标尺：100μm。
β-catenin是形成远端小管所必需的。
自Osr2Cre它不针对DT细胞，不允许我们研究Wnt/β-catenin信号如何调控DT的形成。为了解决这个问题，我们生成了β-cateninLOF突变肾(CTNNB 1C/C；Wnt 4GFPcre/+)使用Wnt4GFPcre (Wnt 4TM3(EGFP/cre)AMC)24...我们以前已经证明Wnt4GFPcre能瞄准包括DT在内的肾单位谱系吗？11但既然Wnt4GFPcre也针对髓质间质27, Wnt4GFPcre可能不适合研究β-catenin在LOH中的作用，因为髓间质中β-catenin的去除可能会影响邻近LOH的发展。39...然而，这并不是一个研究DT的关注，因为DT细胞位于靠近发育中的小鼠肾脏皮质区域，远离髓质间质。
与我们观察到的PT在β-cateninlof突变肾中的发育是一致的。Osr2Cre(无花果)4)，β-cateninLOF突变肾Wnt4GFPcrePT细胞较少，LTL染色较弱。5A)。在对照肾中，Slc12a1+细胞向乳头区拉长，形成典型的LOH结构。相比之下，在β-catenin的突变肾Wnt4GFPcre，Slc12a1+细胞不能拉长，阻碍了乳头的发育(见图)。5A)。考虑到β-catenin突变肾Osr2Cre表现为相对正常的LOH形成。2A)，如图所示，LOH的延伸失败。5A可能是由于骨髓基质中的β-catenin被移除所致。Wnt4GFPcre.
图5去除β-cateninWnt4Cre抑制Henle伸长环和远端小管形成。(A)对照肾中的Slc12a1+细胞拉长，促进乳头的形成。β-catenin缺失突变体肾中Slc12a1+细胞Wnt4Cre不能拉长，导致乳头形成缺陷。输尿管的标志是断线。(B)在β-catenin功能缺失突变体肾脏中Wnt4Cre，较少的slc12a3+远端小管和少数已形成的β-catenin阳性，表明这些细胞已经逃脱。Wnt4Cre-介导去除β-catenin。缺乏β-catenin阴性的远端小管细胞，提示β-catenin是形成远端小管所必需的.图像是三个独立实验的代表。E18.5阶段标尺：100μm。
什么时候CTNNB 1用Wnt4GFPcre，我们发现突变的肾脏形成的dt细胞比dt特异性转运体slc12a3要少得多。3(图)S5)。有趣的是，在突变的肾脏中发现的几个DT细胞中β-catenin呈阳性。5B和数字S5)，表明这些细胞已经逃脱Wnt4GFPcre-介导去除β-catenin。突变肾中缺乏β-catenin阴性的Slc12a3阳性DT细胞，提示β-catenin信号是DT形成所必需的。
一种稳定形式的β-catenin在发育中的肾单位块适当的肾单位分割中的表达
我们的β-cateninLOF研究表明，β-catenin调节上皮性肾单位祖细胞多个肾单位段的发育。为了进一步探讨β-catenin介导的肾单位发育机制，我们进行了一项β-cateningof研究。Wnt4GFPcre或Osr2Cre...本研究中使用的条件等位基因有第三外显子。CTNNB 1两人侧翼的基因氧氟沙星地点(CTNNB 1EX3)40...由于第三外显子编码β-catenin蛋白的N-端，CRE介导的重组导致产生N-末端截短的β-catenin，并能抵抗降解。β-catenin丰度的增加导致不依赖配体的规范wnt信号的激活。40.
我们发现Wnt4GFPcre-介导一种稳定形式的β-catenin的激活阻止了所有肾单位段的形成(如图所示)。6)。突变肾中未见肾小球、PT、LOH或DT。同样，我们发现β-catenin基因突变肾Osr2Cre缺乏肾小球和肾小球(图)S6)。slc12a1+LOH细胞和slc12a3+dt细胞存在于β-catenin gof突变肾中，但它们不能拉长或形成正常的LOH或dt片段(图)。S6)。鉴于Osr2Cre不针对DT，这是意外的Slc12a3+DT细胞在这个突变体中被减少(见讨论)。我们没有发现任何证据表明，在发育中的肾上腺素中，Wnt/β-catenin信号的本构激活促进了任何特定的肾单位段的形成。相反，我们发现在发育中的肾单位中，一种稳定形式的β-catenin的表达抑制了所有肾单位段的形成。
图6一种稳定形式的β-catenin的表达可抑制正常的肾单位图案形成.β-catenin功能突变体肾Wnt4GFPcre不能形成正确的图案。(A)突变肾中未形成近端肾小管或Henle的Slc12a1+环。(B)突变肾中未形成肾小球或Slc12a3+远端小管。图像是三个独立实验的代表。E18.5阶段标尺：100μm。
为了研究一种稳定形式的β-catenin的表达如何干扰肾单位的分割，我们观察了β-cateningof突变肾中肾单位的早期发育。Wnt4GFPcre...在对照肾中，SSB的近段和内侧段分别以Wt1和Jag1标记，Wt1和Jag1的表达结构域不重叠，表现为明显的分离(图1)。7A)。相比之下，在β-catenin GOF突变体肾中，我们观察到Wt1表达域与Jag1表达结构域的重叠。虽然β-catenin GOF突变体肾的初始形态相对正常，但Jag1的表达结构域却异常地向表达SSB近端的Wt 1方向扩展(如图1所示)。7A)。这一结果表明，β-catenin gof突变肾Wnt4GFPcre早在SSB阶段就有肾单位分割的缺陷。我们在β-catenin gof突变体肾脏中观察到了类似的表型。Osr2Cre(图)S7A).
图7一种稳定形式的β-catenin的表达阻止了上皮性肾单位祖细胞的进一步分化.(A)初生(左)和成熟(右)S形体。在对照肾中，Jag1和Wt1分别标记S形体的内侧和近段。在β-catenin功能突变体肾中Wnt4GFPcre，Jag1表达域扩展到S形体的近段。Pax2标志着集合管、帽状间充质和新生的发育中的新生神经元。(B)在正常肾组织中，S形体期后上皮性肾单位祖细胞Pax2的表达下调。因此，大多数HNF4a+细胞对Pax2均为阴性。在β-catenin功能增益突变体肾中，Pax2在肾单位中持续表达，所有HNF4a+细胞均为Pax2阳性，提示β-catenin功能增益突变细胞不能退出其祖细胞状态。图像是三个独立实验的代表。E18.5阶段标尺：100μm。
β-catenin ggof突变肾中最显著的缺陷之一Osr2Cre或Wnt4GFPcre是LTL+的完全缺乏(如图所示)。6A和数字S6)。因为hff4a在PT的发展中起着至关重要的作用。37我们检测了HNF4a在β-catenin GOF突变肾中的表达.在对照肾的肾单位谱系中，Pax2的表达主要局限于皮质的肾生成区，标志着肾顶间质和新生的新生肾细胞(图1)。7b)。在对照组肾组织中，Pax2在HNF4a+PT细胞中大部分不能检测到，提示Pax2的形成伴随着Pax2的下调(图2)。7b)。有趣的是，我们发现，在β-catenin gof突变的肾脏Wnt4GFPcre，所有HNF4a+细胞均为Pax2阳性。7b)。Pax2的表达并不局限于突变肾中的肾生成区。相反，在突变的肾脏中发现的大多数上皮结构显示了Pax2的持续表达(如图2所示)。7b)，表明具有持续性β-catenin活性的上皮性肾单位祖细胞在发育过程中停止，不能进一步分化为PTS。综上所述，我们的结果表明，β-catenin信号的严格调控对于肾单位的正确模式是必需的，即使在肾单位祖细胞最初承诺后也是如此。我们在β-catenin gof突变体肾脏中观察到了类似的表型。Osr2Cre(图)S7B).
