ASPP 2通过抑制肝细胞癌中甲羟戊酸途径抑制肿瘤生长 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

从根本上说，癌症是一种细胞生长和增殖紊乱，需要充足的能量和营养。在本研究中，我们报告了抑癌基因ASPP 2，一种p53激活物，对甲戊酸盐通路负调节，从而介导其对肝癌(HCC)肿瘤生长的抑制作用。基因表达谱分析表明，当ASPP 2被下调时，中戊酸途径关键酶的表达增加。肝癌细胞获得了更高的胆固醇水平，增强了对ASPP 2耗竭的肿瘤启动能力。辛伐他汀是一种甲丙戊酸途径抑制剂，能有效地抑制ASPP 2耗竭引起的非锚定细胞增殖、体外对化疗药物的耐药性以及裸鼠移植瘤的生长。ASPP 2与核内SREBP-2相互作用，抑制SREBP-2在靶基因上的转录活性，其中包括与甲戊酸途径有关的关键酶。此外，临床资料显示ASPP 2水平高、甲戊酸途径酶HMGCR水平低的患者预后较好。我们的发现为探讨ASPP 2在调节甲伐酸盐途径中的关键作用提供了功能和机制上的见解，并阐明了该途径在肿瘤发生和生长中的重要作用，为肝癌的治疗提供了新的机会。

导言

多种代谢途径失调可能与癌变有关。1...例如，胆固醇在维持质膜的稳定性和结构方面起着至关重要的作用，是高增殖癌细胞所必需的。2...肿瘤细胞膜被发现富含胆固醇，这表明胆固醇利用率的提高是恶性肿瘤的一个重要特征，也许是转移性肿瘤的一个重要特征。3...来自癌症基因组图谱(TCGA)项目的突变数据也表明胆固醇代谢在癌症发展中的作用。4...甲羟戊酸途径(MVA)是将乙酰辅酶A转化为甾醇(如胆固醇和非甾醇类异戊二烯类)的重要代谢途径。临床和实验结果表明，恶性细胞和组织比正常人需要更多的胆固醇和甲丙戊酸途径中间体。5,6...某些类型的癌症，如肝细胞癌(HCC)，依赖于甲丙戊酸途径生长。例如，抑制甲羟戊酸代谢抑制肿瘤的发生和生长MYC转基因小鼠肝癌模型7在p5 3缺失引起的肝脏肿瘤发生中，甲丙戊酸途径的激活也起着重要的作用。8.

甲丙戊酸途径受到一系列酶的密切调控。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)是限速酶，可被他汀类药物阻断。9的确，这种抑制在多种肿瘤类型中具有抗肿瘤作用。9...临床观察显示，他汀类药物的使用与肝癌的风险呈负相关。10.

如hmgcr等关键限速酶的转录激活受甾醇调节的转录因子SREBP-2(甾醇调节元件结合蛋白-2)的切割控制。11,12,13...胞内甾醇的耗竭会增强SREBP-2从内质网向高尔基体的易位，从而导致随后的分裂至其活跃的成熟形式和核易位。14...SREBP-2与其靶基因启动子中的甾醇调节元件(SRES)结合，激活其转录。

ASPP 2是kankyrin重复序列、sh3结构域和富含脯氨酸区蛋白(Aspp)家族的成员，是单纯性不足的抑癌因子。15,16...ASPP 2在人类多种癌症中的异常表达17...我们先前的研究发现app 2在肝癌中被dna甲基化所下调。18...ASPP 2通过调节细胞凋亡、自噬和上皮可塑性来抑制肿瘤生长和转移16,19,20,21...然而，目前尚不清楚ASPP 2是否参与了甲羟戊酸代谢的调控，这可能与其抑制肿瘤的进展有关。在本研究中，我们提供证据表明ASPP 2的下调通过促进肝癌中甲羟戊酸的代谢而增强肿瘤的启动能力和肿瘤的生长。

结果

ASPP 2下调对肝癌细胞中甲戊酸途径基因表达和胆固醇合成的影响

为了探讨ASPP 2抑制肿瘤生长和进展的机制，我们通过比较ASPP 2缺失的HCC-LM3细胞和母细胞的基因表达情况，对ASPP 2的下游靶点进行了微阵列分析。有趣的是，GO分析显示ASPP 2的表达与萜类骨架生物合成和类固醇生物合成之间存在显著的负相关(图一)。1A)。mgcs 1、hmgcr、mvk、mvd和idi 1等基因的表达明显增强(P < 0.05, FDR < 0.25) in ASPP2-depleted HCC-LM3 cells (Fig. 1B)。为了验证这一发现，我们检测了hmg-coA还原酶(Hmgcr)和hmg-coa synthase 1(Hmgcs 1)的表达，这两种酶是甲戊酸盐途径的限速酶。22,23，采用实时PCR和Westernblotting方法。结果表明，HMGCR和HMGCS 1在ASPP 2缺失的HCC-LM3和HepG 2细胞中的mRNA和蛋白水平显著升高。1C和d)。此外，通过GC-MS分析，ASPP 2的基因敲除导致HCC-LM3细胞中游离胆固醇和总胆固醇水平升高。1E)。综上所述，这些观察表明，在肝癌细胞中ASPP 2的下调促进了甲羟戊酸途径和胆固醇的生物合成。

图1：ASPP 2的下调增强了肝癌细胞中甲丙戊酸途径基因的表达和胆固醇的生物合成。

甲丙戊酸代谢对维持ASPP 2缺失的肝癌细胞的促肿瘤能力是必不可少的。

甲丙戊酸盐代谢紊乱与多种癌症的发生发展和肿瘤发生能力有关。24,25,26...我们以前已经证明，下调ASPP 2使肝癌细胞具有干细胞样的特性。27...为了验证甲丙戊酸代谢在ASPP 2介导的肝癌细胞肿瘤发生能力中的重要性，我们使用辛伐他汀抑制甲伐他汀的代谢，辛伐他汀是一种能抑制hmgcr的抑制剂，抑制hmgcr来消耗甲伐酸途径的前体和降低胆固醇水平。28,29...辛伐他汀对单层培养的HCC-LM3细胞增殖无影响(附图)。1)。然而，在悬浮培养系统中，辛伐他汀处理的ASPP 2缺失的HCC-LM3细胞中，细胞球的数量和大小明显减少(如图所示)。2A)，暗示自我更新减少。EpCAM被认为是肝癌中肿瘤起始细胞的一种可能的制造者。30，因为EpCAM阳性的肝癌细胞具有祖细胞特征。31...辛伐他汀抑制ASPP 2耗竭诱导的HCC-LM3细胞EpCAM mRNA和蛋白表达(附图)。2)，以及EpCAM在HCC-LM3球表面的表达。2C)。此外，我们还用qRT-PCR技术检测了树干相关基因的表达.ASPP 2的缺失导致HCC-LM3和HepG 2细胞中转录因子Oct 4、ATP结合盒转运体ABCG 2和CK-19上调。这些改变被辛伐他汀治疗所影响(见图)。2B)。对化疗的耐药性被认为是肿瘤细胞的另一种特性。与对照组相比，ASPP 2缺失的HCC-LM3和HepG 2细胞对5-Fu处理表现出明显的耐药性。然而，辛伐他汀降低了这种耐药性。二维空间).

为进一步证实甲丙戊酸途径在体内促进ASPP 2缺失肝癌细胞的生长，将表达shASPP 2或shNon的HCC-LM3细胞注射到裸鼠体内，用辛伐他汀治疗或不注射辛伐他汀。异种移植后21天，辛伐他汀明显延缓ASPP 2沉默组肿瘤的生长(图1)。3a，b)。免疫组化染色显示ASPP 2沉默组HMGCR和HMGCS-1表达增强。3C)。这些数据表明，甲羟戊酸途径是维持ASPP 2缺失的肝癌细胞的肿瘤起始能力的关键。

ASPP 2与SREBP-2相互作用调节甲羟戊酸代谢

微阵列分析显示，在ASPP 2缺失的HCC-LM3细胞中，有几个甲丙戊酸途径基因转录上调。1A)，我们推测ASPP 2可能通过调节SREBP-2而成为甲羟戊酸途径的上游调节因子。研究表明，SREBP-2是甲丙戊酸途径的主要调节因子。32...SREBP-2完全位于HCC-LM3细胞的核内，ASPP 2在HCC-LM3细胞的细胞核和细胞质中均能检测到。4A)。有趣的是，我们发现SREBP-2与内源性ASPP 2共同定位在HCC-LM3细胞的细胞核中(如图所示)。4A)。此外，在细胞总裂解物或核裂解物中共免疫共沉淀检测到内源性ASPP 2与HCC-LM3中的SREBP-2相互作用。4B)。细胞核蛋白的分离通过细胞质蛋白α-微管蛋白的低表达和核蛋白LaminB 1的高表达而得到证实。3)。ASPP 2的缺失并没有降低SREBP-2的蛋白水平，但ASPP 2与SREBP-2的相互作用明显减少。4B)。V5标记的ASPP 2和HA标记的SREBP-2在HEK293T细胞中的异位表达进一步证实了这种相互作用。4c，d)。为了探讨ASPP 2是否调节SREBP-2的转录活性，我们构建了荧光素酶报告结构，包括仓鼠hmgcs 1启动子、人LDLR启动子或与SREBP-2结合的三个甾醇调节元件(3 SRE)。13...ASPP 2在HCC-LM3和Huh-7中的异位表达显著降低了3 SRE、HMGCS 1和LDLR启动子的活性，而ASPP 2的缺失对3 SRE、HMGCS 1和LDLR启动子活性的影响相反。4D)。ASPP 2耗竭诱导的HMGCR和HMGCS-1的表达SREBP-2被撞倒(无花果)4F)。此外，siRNA靶向SREBP-2消除ASPP 2耗竭诱导的肝癌-LM3细胞球状形成(图一)。4E)。这些结果提示ASPP 2与SREBP-2相互作用，是甲戊酸盐代谢的负调节因子。

ASPP 2-调节的甲丙戊酸代谢与肿瘤的进展有关，并提供预后价值。

为探讨ASPP 2调节的甲伐酸盐代谢对肝癌临床的影响，我们采用免疫组织化学方法检测了80例肝癌组织中ASPP 2和HMGCR蛋白的表达。所有肝癌患者的临床病理参数见补充表。1...30例肿瘤标本中ASPP 2高表达。大部分ASPP 2位于细胞质中(如图所示)。5A17例ASPP 2有较强的核染色(图2)。5C)。38%(30/80)的患者ASPP 2低表达，HMGCR高表达，23%(18/80)的患者ASPP 2高表达，HMGCR低表达。因此，ASPP 2和HMGCR的表达呈负相关(P < 0.05; Fig. 5B)。核内ASPP 2的低表达率为70.6%(12/17)，而胞质ASPP 2仅为46.2%(6/13)。5D)。这表明核ASPP 2可能更有可能负调控HMGCR的表达。

表中分析ASPP 2和HMGCR表达与临床特征的关系。1...HMGCR表达与肿瘤体积呈显著正相关(P<0.05)。PHMGCR高表达者肿瘤体积大。此外，ASPP 2高表达和HMGCR低表达的患者肿瘤体积较小(P=0.008)和较少的肝硬化(P=0.018)。与这些发现相一致的是，ASPP 2高表达和HMGCR低表达的患者表现出最佳的无复发生存(RFS)和总体生存(OS)(图一)。5E)。这些数据提示ASPP 2调控的甲戊酸盐代谢参与了肝癌的肿瘤进展。

80例HCC患者ASPP 2和HMGCR表达与临床病理特征的关系

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在单因素分析中，肿瘤大小、AJCC分期、ASPP 2和HMGCR表达状态是影响RFS和OS预后的因素。P < 0.05, Table 2)。在多因素分析中，肿瘤大小、ASPP 2和HMGCR表达状态是RFS和OS的独立预测因子(表)。3)。HMGCR高表达患者复发的概率是HMGCR低表达患者的2.530倍(危险度比2.530；95%可信区间，1.355~4.725)。ASPP 2高表达患者的复发风险是ASPP 2低表达患者的0.453倍(危险度为0.453；95%可信区间为0.235~0.873)。因此，随着ASPP 2的降低，HMGCR的表达增加可作为HCC患者的预后指标。

表2与无复发生存率和总生存率相关因素的单因素分析

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表3与无复发生存率和总生存率相关因素的多变量分析

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讨论

本实验证明ASPP 2是p53的激活因子，通过抑制SREBP-2介导的甲戊二酸代谢，调节肝癌的启动能力和肿瘤的生长。肝癌细胞通过慢病毒介导的ASPP 2的下调，获得更高的胆固醇水平，增加肿瘤的干细胞特征和肿瘤生长。辛伐他汀是一种甲丙戊酸代谢途径抑制剂，它逆转了ASPP 2缺失细胞的肿瘤生长和干细胞特性。

p53是细胞生长和分裂的守护者，通过多种途径作用，如细胞周期阻滞、细胞死亡和衰老。越来越多的证据表明，p53对细胞代谢途径的调节有助于其抑癌作用。33...值得注意的是，最近的证据表明，p53通过抑制SREBP-2的成熟来抑制甲戊酸盐的代谢，而SREBP-2在p5 3介导的小鼠肝脏肿瘤发生中的肿瘤抑制中起着关键的作用。8...此外，携带癌源性错义突变的p5 3与srebp-2相互作用，激活甲羟戊酸途径，这与维持乳腺癌的恶性表型有关。34.

ASPP 2最早被认为是p5 3家族调节凋亡的激活因子。35...随后发现，ASPP 2通过与特定的合作伙伴(如p73、Bcl-2、NF-kB、YES相关蛋白-1、RAS、Par3、β-catenin和Beclin-1)共同调控一系列生物事件。在细胞膜上，ASPP 2通过其N端与Par3结合以保持细胞极性的完整性。36,37，并结合β-catenin-E-cadherin复合物调节上皮可塑性。20...在细胞质中，ASPP 2结合RAS来调节RAS信号。38,39，并与ATG 5和Beclin 1相互作用，调节自噬。19,21...在细胞核内，ASPP 2与p53和p73结合，通过C端刺激细胞凋亡。40...ASPP 2通过RAS/Raf/MAPK途径磷酸化导致ASPP 2从细胞膜转移到胞浆/细胞核41...LPS刺激小鼠巨噬细胞内ASPP 2从胞浆向核的移位，并在LPS诱导的母体炎症小鼠模型中引起血-脑脊髓液屏障内ASPP 2的核积聚。42...ASPP 2的C末端含有ankyrin重复序列，这可能促使ASPP 2通过RanGDP/Ankyrin重复序列结合核导入途径进入细胞核。43.

在此，我们发现ASPP 2与核内的SREBP-2相互作用，并通过SREBP-2抑制甲丙戊酸途径基因的转录激活。核ASPP 2染色的HCC组织比胞质ASPP 2染色的HCC组织更容易出现HMGCR低表达，进一步支持核ASPP 2对甲羟戊酸途径的负效应。

以前对癌细胞的观察显示ASPP 2主要在细胞质或细胞膜上表达。20...然而，我们的数据显示ASPP 2在HCC-LM3细胞和约21%(17/80)的HCC中均有核和胞浆的表达。观察ASPP 2和SREBP-2在HCC-LM3核中的共定位.以往的研究表明，SREBP-2的转录活性可能通过与突变体p5 3、myc和rb的相互作用而调节。9...两个功能增益的p5 3突变能与核SREBP-2相互作用，并能增加srebp-2介导的甲丙戊酸途径基因的转录。34...DNA元素百科全书(ENCODE)项目的数据表明，MYC与SREBP-2附近的甲伐酸途径基因启动子结合，这可能与Myc诱导的肝癌发生有关。Rb可阻止SREBP-2与靶基因启动子的关联，并可作为甲伐酸盐代谢的负调节因子。44...我们的发现表明ASPP 2是SREBP-2的一种新的负调节因子.鉴于ASPP 2与核内p53相互作用，ASPP 2与SREBP 2之间的相互作用是P53依赖的，尚需进一步研究。

由于肝脏负责约80%的新胆固醇生物合成在人类，这是不足为奇的看到一个关键的作用，中戊酸在肝癌的发展。我们的发现已经确定了ASPP 2在调节甲伐酸盐代谢中的重要作用，以及它在肿瘤发生能力和肿瘤生长中的重要作用，这可能为肝癌提供新的治疗机会。

材料和方法

细胞培养

我们从美国型培养公司(ATCC)购买了HEK293T细胞。HCC-LM3(P53 Wt)、HepG 2(P53 Wt)、Huh-7(P53 Mut)分别来自复旦大学钟山医院肝癌研究所(上海)。对所有细胞株进行了支原体污染鉴定和检测。在DMEM(吉布科，Waltham，MA，美国)中添加10%(vol/vol)FBS(吉布科)，并保持在37°C和5%CO2。辛伐他汀可抑制HMGCR，使甲羟戊酸途径前驱物消耗，降低胆固醇水平。

慢病毒shRNA与小干扰RNA的构建

我们利用Invitrogen和InvivoGen公司的网络软件设计了三对针对ASPP 2 mRNA表达的cDNA寡核苷酸。合成后，我们将这些双链寡核苷酸插入到载体pENTR/U6(Invitrogen)中，并对得到的质粒进行测序，以确保shRNA构建针对人ASPP 2的表达或被置乱，它们被生成并命名为LV-shASPP 2和LV-shNon。然后将质粒转染到HCC-LM3细胞中，用实时PCR和westernblot方法验证转染后48h的基因沉默效率。补充材料中有关于慢病毒载体产生和慢病毒感染的详细信息。

胆固醇分析

6孔板肝癌-LM3细胞感染LV-shNon和LV-shAspp 2。3天后收集两组细胞。用气相色谱-质谱法测定游离胆固醇和总胆固醇，采用内标法.每个符号代表三口井的平均±SD。这些实验至少重复了三次。

荧光素酶报告质粒的构建及荧光素酶报告子的检测

设计并构建了荧光素酶报告质粒pgl-仓鼠hmgcs 1-启动子和pgl-ldlr启动子(详见辅助材料)。将pGL3.0增强子(Promega)和构建的荧光素酶报告质粒转染肝癌细胞(3×10)。4)用X-tremeGENE Hp DNA转染试剂将PRL-TK三倍体作用于48孔板中。转染24h后，用双荧光素酶报告系统(Promega)检测细胞的荧光素酶活性。所有数据均以±S.D表示，实验至少重复了三次。

肿瘤移植模型

感染LV-shNon和LV-shaspp 2后(MOI为50)，HCC-LM3细胞(5×10)。6裸鼠皮下注射(男性BALB/cnu/nu，每组6只)。7天后肿瘤形成良好。腹腔注射辛伐他汀(40 mg/kg体重)，0.5%CMC-Na(羧甲基纤维素钠)腹腔注射3周。然后处死小鼠，分离肿瘤组织进行组织病理学实验。

球体形成试验

将0.4%牛血清白蛋白、4μg/mL胰岛素(Sigma-Aldrich、St Louis、MO、USA)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(PeproTech)、B27(1：50；Invitrogen)和20 ng/mL表皮生长因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)添加到DMEM/F12培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。然后用DMEM/F12培养基将感染LV-shNon和LV-SAspp 2的细胞悬液，浓度为5000细胞/mL。培养基中加入0.01M辛伐他汀或二甲基亚砜。在不同的条件下，将5000个细胞镀在超低附着板(康宁、康宁、纽约、美国)上。孵化一周后，用奥林巴斯IX 70显微镜计算球体数。

免疫荧光

Cultured cells were washed 3 times with cold phosphate buffer saline(PBS)，fixed with 4%paraformaldehyde，blocked and then incubated with ASPP2 antibody(1:200，A4480，Sigma-Aldrich，antigenic epitope was located at amino acids 691–1128 of ASPP2 of human species)and SREBP-2 antibody(1:150，N-19 sc8151，Santa Cruz，antigenic epitope was located in N-terminus of SREBP-2 of human species)overnight at 4°C.Corresponding Alexa 555-conjugated and/or Alexa 488-conjugated secondary antibodies(Invitrogen)were used to incubate the cells for 1 h at room temperature，然后是4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；病媒实验室有限公司，伯林加梅，加利福尼亚州)5分钟。用LSM 710激光共聚焦显微镜(复旦大学)拍摄具有代表性的图像。采用上述方法，在奥林巴斯IX 70显微镜下，用EpCAM抗体(1：100，#36746，细胞信号技术)对肝癌-LM3球进行免疫荧光检测。有关EpCAM免疫荧光检测的详细信息，请参阅辅助材料和方法。

免疫沉淀试验

经不同处理后，用裂解缓冲液(50 mM Tris HCl，150 mM NaCl，0.1%SDS，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠)和蛋白酶抑制剂1mm PMSF(Sigma，P 7626)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche，04693116001)孵育细胞。细胞在冰上溶解30分钟，16，000×离心。g4°C下，细胞裂解液与抗体孵育20 min，蛋白A/G琼脂糖(Santa Cruz，sc-2003)沉淀免疫复合物3 h，4°C复合物在裂解缓冲液(5×5 min)中洗涤。免疫沉淀蛋白采用Westernblotting分析。

核蛋白免疫沉淀

核复合物Co-IP试剂盒(Active Motif，54001)根据制造商的指示，对肝癌细胞株LM3或HEK293T细胞的核蛋白进行分离。简单地说，收集的细胞再悬浮在冷PBS/磷酸酶抑制剂中，然后分别分离细胞质组分和核组分。胞质蛋白α-微管蛋白(Proteintech，11224-1-AP)的低表达和核蛋白LaminB 1(Proteintech，12987-1-AP)的高表达证实了核蛋白的分离。将核蛋白提取液稀释于裂解缓冲液中，隔夜与抗体孵育，4℃时用蛋白A/G琼脂糖沉淀免疫复合物3h，免疫沉淀蛋白进行Western印迹分析。

细胞活力及耐药试验

将感染LV-shAspp 2和LV-shNon的细胞接种到96孔板(5，000细胞/孔)中，用不同浓度的5-Fu和10μM-辛伐他汀或二甲基亚砜处理48h，用MTS法测定细胞活力(CellTiter 96水1溶液细胞增殖试验；Promega，麦迪逊，WI，美国)。这些实验至少重复了三次。

病人样本

我们完成了由上海维澳生物技术有限公司(上海维澳生物技术有限公司)构建的组织微阵列。从2008至2015年间接受治疗性肝切除的患者中获得了80例肝细胞癌基因芯片标本。补充表中总结了患者的临床病理特征。1...有关病人样本的其他详情，请参阅辅助材料.

免疫组织化学染色

应用ImageScope系统分析ASPP 2、HMGCR和HMGCS 1在福尔马林固定、石蜡包埋的原发性肿瘤组织中的表达。Briefly，the slides were dewaxed，hydrated，quenched endogenous peroxidase activity，retrieved antigen，blocked and incubated with the antibody against ASPP2(1:50，A4480，Sigma-Aldrich)，HMGCR(1:50，H300 sc-33827，Santa Cruz)，or HMGCS1(1:50，H-70 sc-33829，Santa Cruz)overnight at 4°C.Then，sections were rinsed and incubated with the working solution of horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit for 1 h at 37°C.After rinse for three times，diaminobenzidine colorimetric reagent solution from Dako(Carpinteria，CA)was used.然后用苏木精染色，梯度乙醇脱水，固定。根据信号强度和分布对ASPP 2和HMGCR的表达进行评分。免疫染色的评估由两名经验丰富的病理学家独立进行。

统计分析

我们使用SPSS16.0对所有数据进行分析。这个χ2用测试法对2尾学生的定性变量进行评定t采用检验和Wilcoxon秩和检验对定量变量进行评价。用Spearman秩检验确定两个变量的相关性。采用Kaplan-Meier分析法对接受调查的患者进行生存分析。采用对数秩检验评价各组间的生存差异。单因素和多因素分析基于Cox比例风险回归模型。所有结果均为平均±扫描电镜。所有的统计测试都是双面的，P < 0.05 was considered statistically significant.