不变自然杀伤T(INKT)细胞是NKT细胞识别CD1d所表达的外源性和内源性脂类抗原的主要子集。虽然iNKT细胞对自身抗原具有自反应性，但iNKT细胞在调节细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中的作用已经用α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)来阐明，这是一种由专业抗原提呈细胞(如树突状细胞)呈现的强合成糖脂。尽管α-GalCer和树突状细胞对脂类抗原表达的影响是众所周知的，但CTL在与iNKT细胞相互作用过程中所表现的内源性抗原的生理作用尚未得到研究。在本研究中，我们发现抗原启动的CTL经短暂的CD1d上调后，可产生脂类自身抗原，激活iNKT细胞产生干扰素-γ。CTL介导的iNKT细胞活化可促进IFN-γ的产生，增强CTL的增殖和细胞毒性。我们还发现，iNKT细胞与CTL的直接相互作用增强了CTL的抗肿瘤免疫反应。这部分解释了iNKT细胞在CTL介导的抗肿瘤免疫中的作用.我们的研究结果表明，在缺乏外源性iNKT细胞配体的情况下，iNKT细胞通过与T细胞上表达的CD1d直接相互作用而增强IFN-γ和CTL的增殖及细胞毒性。

自然杀伤T(NKT)细胞是TCRαβ细胞的一个子集，它识别自身和外来脂质和糖脂抗原，是MHC类分子CD1d的一部分。不变NKT(INKT)细胞是表达独特不变量tcrα链(小鼠为Vα14Jα18，人为Vα24Jα18)和有限数量可变tcrβ链的主要细胞群。1...iNKT细胞被归类为先天的淋巴细胞，当抗原与tcrs结合时会迅速分泌Th1或Th2细胞因子。2,3,4...激活的iNKT细胞可以通过招募、激活或调节NK细胞、DC、B细胞和T细胞的应答来调节适应性免疫反应。4,5,6,7,8...许多报道表明，iNKT细胞的激活增强了ctl介导的消除癌细胞或各种感染的能力。9,10,11,12...然而，这些研究大多集中于用外源糖脂刺激iNKT细胞，如海绵状糖脂α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)，一种强而典型的合成糖脂。9,10,13,14,15...在这些免疫反应中，激活的iNKT细胞以CD 40依赖的方式增强树突状细胞(DC)，从而增强CTL反应。虽然这一机制已经得到了很好的研究，但非生理激活利用强大的合成糖脂抗原可能会引起iNKT细胞的差异激活。因此，iNKT细胞在CTL免疫应答中的生理作用尚待阐明。

iNKT细胞对自身抗原具有自身反应性。16在遇到外来抗原之前，表现出特征性的表型激活和记忆反应。2,3,16...CD1d由多种类型的细胞构成表达。17...除了抗原提呈细胞(APC)，T细胞也表达CD1d。18...负载α-GalCer的肿瘤特异性CTL能诱导和激活iNKT细胞，促进CTL介导的抗肿瘤免疫应答。19...这表明成熟的CD8有可能+T细胞通过CD1d呈现自配体刺激iNKT细胞。我们先前的研究表明，在iNKT细胞没有外源配体的情况下，iNKT细胞可以促进CTL对肿瘤细胞的二级免疫应答。20...然而，目前尚不清楚这些稳态的iNKT细胞如何增强抗原特异性的CTL反应.在本研究中，我们观察到iNKT细胞通过直接识别CTL上CD1d所呈现的内源性抗原而不受DC或外源iNKT细胞抗原的影响，从而增强CTL的效应功能(IFN-γ的产生、增殖和细胞毒性)。提示抗原刺激的CTL可以激活iNKT细胞和CTL激活的iNKT细胞产生的细胞因子，在iNKT细胞介导的CTL效应功能增强中发挥作用。

小鼠

C57BL/6(B6)野生型(WT)和卵清蛋白(OVA)257–264-特异性TCR(Vα2和Vβ5)-表达转基因小鼠(OT-1)。Jα18基因敲除(Jα18)高)小鼠是Taniguchi博士(日本横滨RIKEN)的礼物。CD1d基因敲除小鼠(CD1d)高)和Vα14转基因小鼠由艾伯特·本德拉克博士(芝加哥大学，芝加哥，伊利诺伊州，美国)提供。CD1d高小鼠用CD1d杂交+/+(CD1d)威汤哥)OT-1小鼠获得CD1d+/−不是-1只老鼠。CD1d+/−用CD1d进一步回交OT-1小鼠。高小鼠获得CD1d高不是-1只老鼠。Ly5.1+/−(Ly5.1)+Ly5.2+)OT-1或Ly5.1+/+OT-1小鼠经同源Ly5.1杂交后，获得OT-1小鼠。+/+B6小鼠。Ly5.1+/−(Ly5.1)+Ly5.2+)CD1d高采用同样的方法获得OT-1小鼠。所有小鼠均表现为C57BL/6背景。在韩国大学在特定的无病原体条件下饲养，并在7-9周龄时使用。本研究所采用的实验方案已获韩国大学动物保护与使用机构委员会批准。

MACS细胞的制备与富集

从CD1d脾细胞中提取脾DC高用抗CD11c微球(Miltenyi Biotec)对小鼠进行磁激活细胞分选(MACS)。用NK1.1从Vα14 Tg小鼠中纯化iNKT细胞+iNKT分类试剂盒(Miltenyi Biotec)。CD8+用抗CD8α微球(Miltenyi Biotec)从OT-1小鼠脾脏中分离T细胞，并根据厂家的指示，用抗CD11c磁珠(Miltenyi Biotec)耗竭DC后，将T细胞从OT-1小鼠脾脏中分离出来。按mcs分类的细胞纯度依次为：dcs>80%，iNKT细胞>90%，CD8。+T细胞>98%(附图)。1).

CD8的CFSE标记+T细胞

CD8+用MACS法从OT-1小鼠脾脏制备T细胞。纯化CD8+T细胞在羧荧光素二乙酸琥珀酰酯(CFSE)标记缓冲液中再悬浮，37℃孵育10 min，用2.5μM CFSE标记，再用RPMI 1640培养基进行广泛洗涤。

试剂和体外刺激

细胞在rpmi 1640培养基(吉布科)中加入10%热灭活胎牛血清(HyClone)，培养2mm。L谷氨酰胺、50 U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、10μg/mL硫酸庆大霉素、50μMβ-巯基乙醇。鸡OVA(OVA)257–264[h-2kb限制；氨基酸序列，SIINFEKL)肽是从genscript购买的，OVA。257–264/H-2Kb单体(下称K)b卵子(OVA)是通过内源性途径获得的。K值为5μg/井(50μl)b在96个井底平板(BD生物科学)中，在4℃下孵育卵。

CD1d高DCS(1×10)4)与10μg/mL的OVA孵育。257–264肽在96孔U底板中作用18h，在OT-1 CD8刺激前用rpmi-1640冲洗。+T细胞纯化的OT-1 CD8+T细胞(1×10)5)用预处理后的CD1d刺激。高存在或不存在5×10的DCS4iNKT细胞在不依赖dc的条件下，纯化的OT-1 CD8+用包被K的平板刺激T细胞b存在或不存在5×10的情况下的卵子4iNKT细胞

体外细胞毒性试验

OT-1 CD8+T细胞在包被K的平板中被刺激b卵子共培养18h，与H共培养3由M.Mescher博士(明尼苏达大学，明尼苏达州，明尼苏达州，明尼阿波利斯，美国)提供EG7细胞(EL4的衍生物)。用比裂解(%)=[(自发cpm−实验cpm)/自发cpm]×100计算比裂解率(%)。

流式细胞术(FACS)分析

Cells were preincubated with anti-FcγR II/III monoclonal antibody(mAb，2.4G2)and labeled for 30 min with the following mAbs(all mAbs are obtained from DB Biosciences if not specified otherwise)：anti-CD8α-PerCP-Cyanine5.5(clone 53-6.7)，anti-CD1d-FITC(clone 1B1)，anti-CD11c-FITC(clone HL-3)，anti-TCR Vβ5.1-FITC or-APC(clone MR9–4)，anti-CD69-FITC(clone H1.2F3)，anti-Ly5.1-FITC(clone A20)，抗TCR Vα2-PE(克隆B20.1)、抗CD3-PE(克隆17A2)、抗TCRβ-PE或PE-Cy7(克隆H57-597)、抗CD11b-PE(克隆M1/70)、抗Ly5.2-PE(克隆LG.7F9)、抗CD 44-PE(IM 7)、CD62L-APC(MEL-14)、抗IFNγ-APC(克隆XMG1.2)和抗IL-4 APC(克隆11B11)。CD1d二聚体来源于BD生物科学，α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)购自Alexis。CD1d/α-GalCer二聚体是根据制造商的协议制备的。

流式细胞仪(FlowJo LLC)在FACSCalibur和FACSVerse流式细胞仪(BD生物科学)上进行染色分析。带有面板集的图形表示在同一实验中进行的分析，以便于直接比较荧光强度。

细胞内细胞因子产生的分析

测定细胞内细胞因子水平，用高尔基停(BD制药原)处理细胞，孵育6h。这些细胞最初用适当的mAb染色，然后用细胞固定/Cytoperm试剂盒(BD制药)进行渗透。最后用APC结合抗IL-4或抗IFN-γ单克隆抗体在冰上染色45 min.流式细胞术检测细胞内IL-4或IFN-γ的表达率.

Ot-1细胞体内免疫应答及肿瘤攻击模型

Ly5.1+/+CD1d威汤哥OT-1 CD8+T细胞(1×10)6)和Ly5.1+Ly5.2+CD1d高OT-1 CD8+T细胞(1×10)6)注入WT(Ly5.2)+/+)老鼠。在T细胞注射后的第一天，用ova免疫小鼠。257–264多肽/CFA或未免疫。免疫后2天处死小鼠，进行分析。

分类CD1d威汤哥OT-1或CD1d高OT-1 CD8+T细胞(1×10)5/小鼠)通过静脉注射转移到每只受体小鼠体内。T细胞移植后1天，小鼠皮下注射1×10。5E.G7活肿瘤细胞。用数字卡尺每3-4天监测一次肿瘤生长。肿瘤体积用以下公式计算：肿瘤体积(Mm)。3)=(长度(厘米)×宽度(厘米)2)×0.5。

统计分析

使用GraphPad Prism 6.0和未配对的方法进行了统计分析。t-用Bonferroni的多重比较检验或单向或双向方差分析。所有图表中的条形图代表平均±扫描电镜。其意义用星号表示：*p≤0.05；**p≤0.01；*p≤0.001；*p≤0.0001。

iNKT细胞促进CD8+不依赖DC和外源性NKT细胞激动剂的T细胞活化

首先，我们研究了iNKT细胞是否直接促进CD8。+T细胞活化或IF CD8+在没有外源iNKT细胞配体的情况下，T细胞通过与DC的相互作用间接激活。OT-1 CD8+OVA刺激T细胞纯度>98%。257–264肽脉冲DC(纯度>80%)存在或不存在iNKT细胞(纯度>90%)，所有纯化细胞均在附图中显示。1)。排除DC激活iNKT细胞的可能性CD1d基因敲除DC(CD1d)高采用DCS)。刺激2天后，OT-1 CD8+在NKT细胞存在的情况下，T细胞分泌的IFN-γ水平高于无细胞培养组(见图)。1A)。接下来，我们研究了iNKT细胞是否也影响CD8。+用CFSE稀释法检测T细胞增殖。结果表明，CTL与iNKT细胞共培养后，其增殖能力增强。1B)。排除CD1d产生的任何共刺激受体或细胞因子的影响高dcs对iNKT细胞的刺激作用+带有人工APC的T细胞[来自涂有OVA的平板“257–264肽/H-2Kb单体(K)b]有无iNKT细胞。iNKT细胞的存在也增加了OT-1细胞产生的IFN-γ，甚至在无APC系统中也是如此。1C)。这些结果表明，iNKT细胞与DC和外源iNKT细胞配体无关，直接促进CTL的活化。

a分类OT-1 CD8+CD1d敲除DC(CD1d)激活T细胞高用OVA预处理DCS)257–264存在或不存在iNKT细胞的多肽。刺激2d后，用细胞内流式细胞仪(FACS)检测CTL产生IFN-γ的情况。干扰素γ产生CD8的检测+T细胞用抗TCRVβ5.1、抗CD8α、抗IFN-γ(左面板)染色，bIFN-γ在OT-1 CD8中的平均荧光强度+T细胞(右面板)。ccfse标记OT-1 CD8+T细胞被刺激，如(a)。OT-1细胞CFSE稀释法的代表直方图。dOT-1 CD8+用包被K的平板刺激T细胞b卵细胞是否存在iNKT细胞。刺激2d后，测定OT-1细胞产生的干扰素-γ的含量.所有的数据都代表了四个独立的实验，结果相似。数据表示为平均值±扫描电镜；**p < 0.01 and ****p < 0.0001. One-way ANOVA with Bonferroni’s multiple comparison test was used for data analysis

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CTL(CD1d)与NKT细胞(TCR)的直接相互作用促进抗原特异性CD8的形成+T细胞活化

因为CD1d分子也在T细胞上表达，并且在PHA活化时被上调18，我们分析了CD1d在CD8上的动态表达。+T细胞在TCR启动后。CD1d的表面水平在刺激后18h达到高峰，随后下降。2A)。检测iNKT细胞是否通过CD1d对OT-1 CD8的识别作用而被介导。+T细胞，OT-1 CD8+用抗CD1d单克隆抗体(20h2，25μg/mL)预处理T细胞，然后用K刺激。b有iNKT细胞存在的卵子。抗CD1d单克隆抗体预处理，而非抗I-E预处理k非特异性对照组(MAb)阻断iNKT细胞对CD8活化的影响+T细胞(图1.2B)。这一结果表明，在没有APC的情况下，CTL通过CTL上的CD1d与iNKT细胞上的TCRs之间的相互作用，直接由iNKT细胞起辅助作用。

aOT-1 CD8+OVA刺激T细胞257–264-负载DC和CD1d在指定的时间点用流式细胞术(FACS)测定。bOT-1 CD8+用包被K的平板刺激T细胞b在iNKT细胞存在或没有iNKT细胞的情况下，添加25 g/mL抗CD1d(20H2)或抗I-E的卵子。k马布斯。刺激2d后，检测OT-1细胞分泌的IFN-γ水平.cCD1d威汤哥OT-1 CD8+T细胞或CD1d高OT-1 CD8+K刺激T细胞b卵细胞是否存在iNKT细胞。刺激2d后，用流式细胞仪检测细胞内染色后OT-1细胞产生的干扰素-γ水平。dOT-1 CD8+K刺激T细胞biNKT细胞存在或不存在时，卵子与H共培养18h。3胸腺嘧啶标记的E.G7细胞长时间延长8h，特异性裂解(%)的计算公式为：特异性裂解(%)=[(自发−实验cpm)/自发cpm]×100。所有数据代表至少三个独立的实验。数据表示为平均值±扫描电镜；**p < 0.01 and ****p <0.0001。数据分析采用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较检验。

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为了排除已污染纯化的iNKT细胞的DC刺激iNKT细胞并增强OT-1活化的可能性，我们比较了iNKT细胞对CD1d野生型OT-1(CD1d)表达的影响。威汤哥和CD1d敲除OT-1(CD1d)高不是-1)CTL。在没有iNKT细胞的情况下，CD1d高Ot-1 CTL与其同源抗原OVA具有相当的反应性。257–264与CD1d比较威汤哥OT-1 CTL(图1.2C)。然而，当iNKT细胞加入培养物时，CD1d威汤哥在K期，OT-1 CTL产生的IFN-γ水平显著升高。b卵母细胞刺激与CD1d的比较高OT-1 CTL(图1.2C)。这些结果表明，即使在不存在DC的情况下，iNKT细胞也通过CTL与iNKT细胞之间的直接相互作用来促进CTL产生干扰素-γ。接下来，我们研究了这种直接相互作用是否影响CTL的细胞毒性。结果表明，CD1d威汤哥与iNKT细胞相互作用后，OT-1细胞表现出较高的细胞毒性.然而，CD1d的细胞毒性高OT-1细胞不受iNKT细胞的影响。二维空间).

以确定这种直接相互作用是否介导CD8+T细胞免疫，CD8的启动+用同种异体小鼠进行T细胞分析。我们共注入天真的CD1d高OT-1细胞(Ly5.1)+Ly5.2+)和CD1d威汤哥OT-1细胞(Ly5.1)+/+)改为WT(Ly5.2)+/+)用OVA免疫小鼠257–264肽。经抗原特异性活化2天后，CD1d数。威汤哥OT-1细胞略高于CD1d细胞。高外周血和脾脏中的OT-1细胞。3A，b)。两组腹股沟淋巴结无显着性差异(图二)。3A，b)，其中NKT细胞的数量非常小。21...CD1d细胞增殖的差异威汤哥OT-1细胞与CD1d高OT-1细胞没有体外刺激下观察到的那么大(如图所示)。2B)。这可能是由于体内环境中iNKT细胞的丰度低于体外刺激下的iNKT细胞丰度所致。

等量纯化CD8+Ly5.1 T细胞+/+CD1d威汤哥OT-1脾细胞和Ly5.1+Ly5.2+CD1d高OT-1脾细胞腹腔注射。转到Ly5.2+/+WT-C57BL6/c小鼠(n=6)。1天后，6只小鼠中有4只用OVA刺激。257–264肽。刺激2d后，观察外周血(PBL)、脾脏(SP)和腹股沟淋巴结(ILN)转移细胞的变化。a有代表性的FACS数据显示供体细胞的频率。b将免疫小鼠供体细胞频率除以未免疫小鼠供体细胞频率，计算供体细胞的倍数变化。每个点代表一个接收者。数据是两个独立实验的代表。数据表示为平均值±扫描电镜；*p < 0.05 and ***p <0.0001。未配对t检验用于统计分析。

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活化的CTL可以激活iNKT细胞，从而促进CTL的激活。

iNKT细胞在有促炎细胞因子存在的情况下，被DC呈现的内源性脂抗原激活。22,23，这促使我们通过CD1d刺激CTL来激活iNKT细胞来研究内源性抗原的表达。首先，我们调查了OT-1 CD8。+T细胞可通过CD1d表达的内源性抗原激活iNKT细胞。iNKT细胞与CD1d共培养威汤哥OT-1或CD1d高OT-1细胞。CD1d(CTL)与TCR(INKT)的直接相互作用促进了iNKT细胞产生IFN-γ，而不促进iNKT细胞产生另一种具有代表性的细胞因子IL-4。4A)。接下来，我们确定是否天真和启动的CTL激活iNKT细胞。与单纯或活化的OT-1 CD8共培养后，检测iNKT细胞产生的IFN-γ和CD 69的表达。+T细胞我们发现这是有准备的，但不是天真的CD8。+T细胞激活iNKT细胞。4b，c)。这些结果表明，启动的CTL通过CD1d表达内源性抗原，在一定程度上激活iNKT细胞。

a纯化CD1d威汤哥OT-1或CD1d高OT-1 CD8+K刺激T细胞b有iNKT细胞存在的卵子。采用细胞内流式细胞仪(FACS)检测IFN-γ-或IL-4产生iNKT细胞的百分率.b天真的OT-1 CD8+K刺激T细胞biNKT细胞与预激活或幼稚的OT-1细胞共培养18h.用细胞内流式细胞仪(FACS)检测培养2h后iNKT细胞中IFN-γ的水平。b). c纯化的OT-1 CD8+T细胞和iNKT细胞与CD1d共培养高存在或不存在OVA的DCS257–264...激活18h后，流式细胞术检测iNKT细胞表面CD 69的表达。iNKT细胞在α-GalCer-CD1d二聚体上的门控性+TCR-β+细胞群。所有数据代表至少三个独立的实验。数据为平均值±扫描电镜。*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. Unpaired t测试(a, c)。采用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较检验进行统计分析。b)

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其次，我们探讨了iNKT产生的IFN-γ是否参与了iNKT细胞介导的CTL效应功能的增强。通过阻断细胞因子的表达，观察CTL反应。干扰素-γ的废除显著降低了iNKT细胞介导的IFN-γ的CTL生成。阻断IL-4或IL-12对CTL细胞内IFN-γ水平无影响(图5)。5A)。IFN-γ在iNKT细胞介导的CTL功能促进中起一定作用.然而，CTL本身也合成干扰素-γ.阻断干扰素-γ也可能影响CTL。因此，我们激活了CD1d的群体。高(Ly5.2)+/+)OT-1和CD1d威汤哥(Ly5.1)+Ly5.2+)在有或没有iNKT细胞的情况下，确定CD1d是否释放细胞因子。高OT-1细胞激活iNKT细胞对CD1d的影响高OT-1细胞产生干扰素-γ。在没有iNKT细胞的情况下，两者都是CD1d威汤哥和CD1d高OT-1细胞的IFN-γ水平与之相似.然而，CD1d产生的干扰素-γ威汤哥OT-1(Ly5.1)+)细胞数高于CD1d细胞。高OT-1(Ly5.1)−)有iNKT细胞存在的细胞。此外，iNKT细胞的存在增加了CD1d产生的干扰素-γ。高OT-1，但不如CD1d强威汤哥图1(图1)5B)因为iNKT细胞产生影响CD1d的细胞因子高OT-1细胞非特异性地通过旁观者效应，因为两者都是CD1d。威汤哥OT-1和CD1d高在此实验环境下，将OT-1细胞混合在一起。提示活化的CTL与iNKT细胞之间的相互作用与CD1d-TCR的相互作用有关。CTL激活的iNKT细胞通过与CTL密切的物理接触在局部可溶性因子(主要是干扰素-γ)介导的CTL功能中发挥作用。

aOVA与OT-1细胞共培养257–264-卸载或加载CD1d高DCS在有无iNKT细胞的情况下。刺激12h后，加入所指示的阻断单克隆抗体，再孵育24h，用细胞内流式细胞仪(FACS)检测细胞内IFN-γ的水平。b相等数目的Ly5.1+Ly5.2+CD1d威汤哥OT-1和Ly5.2+Ly5.2+CD1d高OT-1 CD8+T细胞与K混合刺激。b卵细胞是否存在iNKT细胞。刺激2d后，用细胞内流式细胞仪测定细胞内IFN-γ水平。bCD1d细胞内IFN-γ水平的MFI威汤哥OT-1或CD1d高Ly5.1上门控的OT-1细胞+(CD1d)威汤哥或Ly5.1−(CD1d)高OT-1)Vα2+CD8+T细胞所有数据代表至少三个独立的实验。数据为平均值±扫描电镜。*p≤0.05，**p≤0.01，*p≤0.001。采用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较检验进行统计分析。

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直接相互作用促进CTL介导的抗肿瘤作用

我们先前的研究表明，处于稳态状态的iNKT细胞可以增强ctl介导的抗肿瘤活性。20...在此，我们研究了CTL与iNKT细胞之间的直接相互作用是否增强了CTL介导的抗肿瘤反应。排序天真CD1d高OT-1细胞或CD1d威汤哥将Ot-1细胞转移到野生型C57BL/6小鼠，体内存在内源性iNKT细胞，然后注入E.G7肿瘤细胞。CD1d威汤哥OT-1细胞能有效地控制肿瘤细胞的生长。然而，CD1d高OT-1细胞抑制肿瘤生长的效果不如CD1d。威汤哥OT-1细胞(图1.6A)。进一步证实iNKT细胞增加CD1d威汤哥Ot-1细胞介导的抑制肿瘤生长的实验，我们在Jα18上进行了同样的实验。高受体小鼠，缺乏iNKT细胞。结果表明，iNKT细胞的缺失消除了CD1d介导的主要肿瘤消退。威汤哥OT-1细胞(图1.6B)。因此，iNKT细胞通过CTL与iNKT细胞的直接相互作用，部分增强了CTL的抗肿瘤作用。

CD1d威汤哥OT-1 CD8+T细胞或CD1d高OT-1 CD8+T细胞经静脉转移至野生型(a)和Jα18高NKT细胞缺陷(b)小鼠(n=5)。每2~4天监测一次肿瘤生长。所显示的数据代表了两个独立的实验，结果相似。数据为平均值±扫描电镜。**p < 0.01, ***p < 0.001; two-way ANOVA with Bonferroni’s multiple comparison test

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NKT细胞具有先天免疫功能和适应性免疫功能，具有抗肿瘤作用。它们也能抑制感染。10,11,12...人们普遍认为iNKT细胞介导的ctl活性的调节是通过dc的间接调节来实现的。9...iNKT细胞被树突状细胞所呈现的CD1d-糖脂复合物激活，进而诱导DC成熟为跨质CD8。+T细胞然而，CD1d的表达并不局限于APC。CD1d在CD8中的表达+T细胞活化后升高，提示CD1d在CD8上表达。+T细胞可能在iNKT和CD8之间的串扰中起作用。+T细胞在目前的研究中，我们发现iNKT细胞也能促进CD8。+T细胞以不依赖DC的方式活化，即使在没有外源抗原的情况下也是如此。1)。使用CD1d高OT-1细胞，我们发现iNKT细胞与CD1d直接作用于CTL，促进CTL合成干扰素-γ，促进细胞增殖和细胞毒性。2)。此外，我们还发现CD1d在活化的CD8上的表达上调。+提呈内源性抗原的T细胞在一定程度上激活iNKT细胞分泌IFN-γ，这可能在增强细胞因子功能方面起一定作用。此外，我们发现这种直接相互作用增强了CTL的增殖和CTL介导的体内抗肿瘤免疫，并建立了肿瘤模型。3还有无花果。5)。因此，iNKT细胞对CD8的直接作用+T细胞免疫部分解释了iNKT细胞的生理作用.

多项研究表明，内源性脂类抗原可激活外周iNKT细胞。22,24,25,26...摘要iNKT细胞内源性脂类抗原具有多样性，一般分为鞘脂类和磷脂类。16,25,27...已经提出了几种内源性脂类抗原，包括异氯三己基神经酰胺(IGb 3)。16，β-葡萄糖基神经酰胺(β-GlcCer)24,28，α-糖基神经酰胺27，过氧化物酶衍生醚键合物溶血磷脂酰乙醇胺(Plpe)和溶血磷脂酸(Elpa)。29...所有这些被实验认为参与NKT细胞活化的脂类自身抗原都是由APC(DC和巨噬细胞)提出的。CTL也可能提供这些脂质候选来激活iNKT细胞。事实上，我们发现CD1d威汤哥CTL可激活iNKT细胞，而CD1d可激活iNKT细胞。高CTL不能激活iNKT细胞，提示CTL可以通过表达内源性抗原来激活iNKT细胞。4).

此外，诱导CD1d可能对增强弱内源性抗原激活NKT细胞有重要作用。30...如图所示。2ACTL显示TCR介入后CD1d表达短暂升高。CD1d水平较高的启动CTL可促进iNKT细胞产生IFN-γ，提示CD1d的上调可能通过IL-2和IFN-γ等细胞因子的额外合成促进内源性抗原向iNKT细胞的表达。4A)。CTL与CD1d的结合促进了IFN-γ的产生，但不能促进iNKT细胞产生IL-4(如图所示)。4A)。这种温和的激活作用与DC间接激活iNKT细胞是一致的。23.

iNKT细胞在促进适应性免疫细胞因子的快速产生中起着重要作用。6,7...因此，我们研究了CTL激活的iNKT细胞产生的细胞因子是否增强了CTL功能.如图所示。5A阻断IFN-γ，而不阻断IL-4或IL-12可阻断iNKT细胞诱导的CTL中IFN-γ水平的升高.但CTL本身也产生IFN-γ.因此，我们使用cd1d生成了一个特定的细胞因子环境。威汤哥OT-1细胞激活的iNKT细胞及CD1d高在iNKT细胞存在的情况下，将这两种类型的OT-1细胞共培养成OT-1细胞.如图所示。5B，iNKT细胞不仅增强CD1d威汤哥OT-1细胞产生的干扰素-γ，但CD1d也有轻微的促进作用。高提示iNKT细胞介导的CTL效应功能增强是由CD1d依赖的细胞接触引起的.CD1d对IFN-γ产生的影响高共培养系统中的OT-1细胞被认为是iNKT细胞产生的细胞因子的旁观者效应。图形5A，b提示在iNKT细胞产生的细胞因子中，IFN-γ最有可能增强ctl的效应功能，包括CTL的活力和细胞毒性。31.

iNKT细胞与CD1d分子相互作用17...这不仅导致iNKT细胞活化，而且还可诱导CD1d磷酸化、细胞内信号转导和细胞因子的释放。32...因此，与iNKT细胞相互作用后，CD1d表达T细胞的细胞内信号可能增强。

加在一起，我们的发现表明CD8+T细胞通过识别APCs或靶细胞上的特异性抗原而被激活，从而导致活化CTL上CD1d的上调。iNKT细胞能直接与CTL上表达的CD1d相互作用，并通过上调IFN-γ的产生、细胞增殖和细胞毒性而促进CTL的功能，提示CD8的作用。+T细胞可以通过双重机制达到最大的反应性，这一机制首先涉及到APC的参与，然后与iNKT细胞相互作用(如图所示)。7).

CD8+T细胞在识别同源抗原(1)后，其表面CD1d表达上调。iNKT细胞与CD1d在抗原识别的CD8上的相互作用+T细胞活化(2)并进一步刺激CD8+T细胞依次(3)。CD8+T细胞达到最佳活化水平，下调CD1d在细胞表面的表达(4)

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