结肠上皮细胞组成的粘膜屏障,障碍促进微生物入侵肠道流明和诱发肠道炎症的发展。 EP4受体是调节前列腺素(PG)的保护作用2在胃肠道; 然而,在肠上皮EP4病理生理学的确切作用仍然未知。 在目前的研究中,我们旨在调查的角色在维持结肠上皮EP4体内平衡的肠道上皮特异性特征EP4击倒(EP4cKO)老鼠。 老鼠窝藏上皮EP4删除显示显著降低结肠隐窝深度和低数量的分泌细胞谱系,以及结肠上皮细胞受损。 有趣的是,EP4-deficient结肠上皮细胞显示出更高的凋亡细胞的数量。 一致的缺陷在粘膜屏障功能结肠上皮细胞和分泌细胞谱系,EP4cKO结肠基质显示增强的免疫细胞浸润,伴有炎性细胞因子的增加产量。 此外,EP4-deficient冒号是容易全身的葡聚糖硫酸酯钠(DSS)结肠炎。 我们的研究首次表明上皮EP4损失导致生理条件下潜在的“炎症”状态。 这些发现提供了洞察上皮铂族元素的至关重要的作用2/ EP4轴在维持肠道内稳态。
肠道内稳态是由上皮细胞和间质细胞之间的相互作用,包括免疫细胞、成纤维细胞和血管细胞,发生与膳食营养和微生物之间的相互作用。 前列腺素E2是一个关键的介质在肠道内稳态的复杂的相声。 铂族元素2由环氧酶1和2合成,作用是通过四个铂族元素结合受体(EP1, EP2 EP3和EP4)。 在这些EP受体,EP4是结肠上皮细胞中表达1在固有层细胞,如TH17细胞2和幼稚的CD4+T细胞3.。
铂族元素2在结肠病理生理学中起着关键作用,如炎症和癌症4,5,6,7,8。 实际上,多个研究人员报道铂族元素的保护作用2和EP4小鼠实验性结肠炎或人类和炎症性肠病(ibd)9,10。 例如,EP4全球敲除小鼠(KO)显示,更严重的全身的葡聚糖硫酸酯钠(DSS)相对于小鼠结肠炎缺乏其他EP受体亚型9。 据报道,政府与EP4受体激动剂改善结肠炎小鼠实验模型中通过抑制炎性细胞因子的生产从免疫细胞浸润9。 结果EP4-selective受体激动剂的2期临床试验证明其对溃疡性结肠炎病人潜在的有益影响10。 然而,尽管铂族元素2/ EP4信号会影响许多细胞类型,包括上皮和间质细胞,调节免疫系统的多效性的方式,这些以前的研究并没有澄清的作用的EP4上皮特异性功能在生理条件下维护结肠内稳态。 上皮EP4本身是否参与了镇压的肠道炎症,炎症性肠病等尚未探索。 在这里,我们调查了结肠粘膜上皮特异性EP4击倒(EP4cKO)小鼠和显示,缺乏肠隐窝上皮EP4导致变化的体系结构和导致炎症在生理和病理条件下表型。
与之前的报道一致,几乎无处不在的表达EP4观察在小肠和结肠表面浓缩技巧1,11(补充图。S1A)。 阐明上皮的作用EP4维持结肠上皮细胞的体内平衡,我们交叉Villin-Cre和EP4液氧/液氧小鼠产生Villin-Cre; EP4液氧/液氧老鼠(EP4cKO)(无花果。1)12。 结肠上皮细胞被隔绝EP4cKO老鼠,证实了EP4删除存在(无花果。1 b, C).EP4cKO老鼠肥沃的、和他们的寿命与控制Villin-Cre老鼠。 此外,EP4cKO老鼠从宏观上难以区分Villin-Cre小鼠的体重和结肠长度(补充图。S1B-D)。 然而,在组织学,远端结肠隐窝的深度显著降低EP4cKO的老鼠比控制Villin-Cre老鼠(图。1 d, E)。 此外,表面上皮细胞位于顶部的隐窝是较小的,不规则的,更多的混乱EP4cKO老鼠相比在控制老鼠(无花果。1 d, F)。 铂族元素2耦合EP4受体刺激cAMP-dependent粘蛋白胞外分泌的结肠13,14。 因此,我们接下来研究的影响上皮EP4删除在结肠上皮分泌细胞谱系。 有趣的是,阿尔新蓝染色结果显示,杯状细胞的数量下降了大约50%EP4cKO的老鼠相对于控制老鼠(无花果。1 g H).EP4cKO老鼠被发现有一个显著降低结肠上皮细胞表达Muc2(无花果。1 i, J)。 此外,enteroendocrine和簇细胞的数量明显下降EP4cKO老鼠基于免疫组织化学结果chromogranin A和Dclk1,分别(无花果。1 k - n)。 与上面的结果一致,存在分析表明表达下调表达的水平Chromogranin一和Dclk1在EP4cKO冒号(无花果。1 l, N)。 总的来说,这些表型建议隐窝上皮EP4维持结构的关键作用和结肠分泌细胞谱系。
结肠上皮EP4-deficient老鼠体内平衡受损。 (一个)模式的重组Villin-Cre; EP4液氧/液氧老鼠。 (B)代表微观的孤立的隐窝。 = 100μm规模。 (C)中存在的分析EP4信使rna水平Villin-Cre(n = 5)EP4cKO (n = 5)结肠隐窝老鼠在8周的年龄。 (D)苏木精和伊红(H,E)染色的结肠Villin-Cre和EP4cKO老鼠。 = 50μm规模。 (E)地下室长度Villin-Cre和EP4cKO(n = 4)。 (F)细胞大小的结肠上皮细胞位于顶部的结肠隐窝Villin-Cre和EP4cKO老鼠(n = 3)。 (G,H在冒号)阿尔新蓝染色和量化Villin-Cre和EP4cKO老鼠在8周的年龄(n = 3)。 = 50μm规模。 (我)Muc2染色的冒号Villin-Cre和EP4cKO老鼠在8周的年龄。 = 50μm规模。 (J)中存在的分析Muc2信使rna水平Villin-Cre和EP4cKO老鼠(n = 5)。 (K)Chromogranin染色的结肠Villin-Cre和EP4cKO老鼠在8周的年龄。 = 50μm规模。 (l)量化的(K)(n = 3)和mRNA的表达水平Chromogranin一在Villin-Cre和EP4cKO老鼠(n = 4)分析了存在于结肠隐窝。 (米)Dclk1染色的结肠Villin-Cre和EP4cKO老鼠在8周的年龄。 = 50μm规模。 (N)量化的(米)(n = 3)和mRNA的表达水平Dclk1在Villin-Cre和EP4cKO结肠隐窝(n = 4)分析中存在。 结果显示为±SEM。 * * *P< 0.005。
确定的潜在机制受损的结肠上皮EP4损失体内平衡,我们接下来研究细胞凋亡和增殖状态EP4cKO结肠上皮细胞。 有趣的是,免疫组织化学裂解半胱天冬酶3显示凋亡细胞的数量的增加,特别是在结肠上皮细胞的支架表面EP4cKO老鼠(图。2 a, B)。 此外,单链DNA TUNEL染色,染色结果显示凋亡细胞数量显著增强,在裂解半胱天冬酶3(图。2 a, B)。 重要的是,凋亡基因的信使rna表达水平,包括贝克,报价,荡妇,伯灵顿明显调节,而抗凋亡的因素bcl - 2中表达下调EP4cKO鼠标冒号(无花果。2 c, D)。 符合观察凋亡基因的改变,他们的角色在一个线粒体细胞色素c-mediated细胞凋亡通路,电子显微镜分析显示更少的线粒体变性和不规则的顶端细胞表面异常细胞极性EP4缺乏结肠上皮细胞(图2 e)。 另一方面,Ki67染色显示增殖没有明显改变EP4cKO鼠标冒号(补充图。S2A B)。 与这个结果一致,没有观察到显著差异的β-catenin疣状上皮增生中扮演关键的角色在肠道和的表达水平Myc(原癌基因编码)和Ccnd1(编码细胞周期蛋白D1),代表目标基因的Wnt /β-catenin通路(补充图。S2C D)。 这些结果也符合之间没有显著性差异的结果Villin-Cre和EP4cKO老鼠的表达式Lgr5就和Sox9,完善的标记(isc)肠道干细胞或祖细胞,也称为Wnt /β-catenin目标(补充图。S2D)。 这些结果表明上皮隐窝细胞生存EP4的重要性但不是结肠上皮细胞的增殖。
细胞凋亡增加EP4cKO冒号。 (一个,B)染色(一个)和量化(B)裂解半胱天冬酶3(上),TUNEL(中间)和单链DNA染色(底部)Villin-Cre和EP4cKO冒号(n = 3)。 = 50μm规模。 (C)凋亡标记的信使rna表达水平Villin-Cre和EP4cKO结肠隐窝(n = 4)分析中存在。 (D)mRNA抗凋亡因子的表达水平bcl - 2在Villin-Cre和EP4结肠隐窝(n = 4)分析中存在。 (E)代表电子显微镜表面上皮细胞的观点Villin-Cre和EP4cKO。 不规则的顶端细胞表面(箭头),异常细胞极性,减少线粒体(箭头所指),线粒体变性(圈)EP4cKO冒号。 规模酒吧= 10μm(上),500海里(底部)。 结果显示为±SEM。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.005。
为了进一步验证EP4删除在上皮细胞凋亡的影响,我们孤立WT小鼠结肠上皮细胞和执行3 d-spheroid文化有或没有管理EP4拮抗剂,l - 161982。 在政府与EP4拮抗剂后48小时,我们观察到显著缺陷球体增长EP4 antagonist-treated集团(无花果。3 a, B)。 符合的结果在活的有机体内系统,阿尔新蓝的数量——(无花果。3 a, C(图)或Muc2-positive细胞。3 d, E)代表分泌细胞谱系在老鼠EP4拮抗剂治疗显著降低。 此外,裂解半胱天冬酶3染色显示更多的凋亡细胞球状体EP4拮抗剂处理时,而Ki67-positive增殖细胞的数量没有改变(图。3 d, E)。 与这些结果一致,产生的球状体EP4cKO小鼠结肠上皮细胞显示明显受损的增长相比得到控制Villin-cre老鼠(图。3 f, G)。 综上所述,我们的研究结果清楚地表明,上皮细胞生存和需要EP4维护结肠上皮细胞内稳态。
细胞凋亡增加3 d-spheroid文化EP4cKO冒号。 (一个)代表结肠球状体的图像处理或不EP4拮抗剂48 h。 3 d-culture图像(左),(H,E)(中)和阿尔新蓝染色(右)。 比例尺条= 200μm(左、中),50μm(右)。 (B)治疗或没有EP4拮抗剂球状体直径为48 h (n = 29)。 (C)量化阿尔新blue-positive细胞(一个)(n = 3)。 (D)代表染色Muc2 /钙粘蛋白(左),裂解Caspase3(中间)和Ki67(右)在治疗或没有EP4球状体拮抗剂48 h。 = 50μm规模。 (E)量化Muc2,裂解半胱天冬酶3,Ki67染色(D)(n = 3)。 (F)时间进程的图像生成的球状体Villin-Cre和EP4cKO结肠隐窝。 = 200μm规模。 (G)量化的第二天在球状体(F)(n = 50)。 结果显示为±SEM。 *P< 0.05,* * *P< 0.005,* * * *P< 0.001。
彻底理解的表型EP4cKO小鼠结肠在生理条件下,我们进行了互补脱氧核糖核酸微阵列分析比较控制之间的基因表达谱Villin-Cre和EP4cKO结肠组织。 与增加细胞凋亡中观察到一致EP4cKO上皮细胞、基因片段的富集分析(GSEA)披露重大浓缩的基因参与apoptosis-related通路EP4cKO冒号(无花果。4)。 此外,KEGG通路分析的结果为注释,使用数据库可视化和综合发现(大卫)功能注释工具显示显著富集的通路基因特异表达的细胞凋亡EP4删除(图。4 b)。 然而,更重要的是,KEGG通路分析的结果表明,炎症反应通路是高纯度和显示超过一半的前20名通路相关免疫反应(无花果。4 b)。 这些研究结果表明,升高引起的粘膜屏障功能缺陷上皮细胞凋亡和减少分泌细胞谱系导致增强EP4-deficient结肠粘膜的炎症活动。 支持这一概念,基因本体论(去)分析结果表明,生物过程,如免疫系统过程中,先天免疫反应,病毒防御反应,炎症反应,免疫反应,是丰富的EP4cKO鼠标冒号(无花果。4摄氏度)。 另一方面,microtubule-based运动,胶原原纤维组织,细胞粘附抑制EP4cKO鼠标冒号(无花果。4 d)。 此外,GSEA结果显示积极的浓缩的基因签名与炎症和免疫反应有关EP4cKO老鼠(图。4 e)。 这些路径分析与观察到的倾斜高度一致地下室建筑和建议的强有力的炎性表型EP4cKO结肠。
基因表达分析显示潜在的炎症状态EP4cKO冒号。 (一个从微阵列)GSEA转录组数据EP4cKO与Villin-Cre冒号。 (B)KEGG途径积极丰富EP4cKO鼠标冒号分析与大卫。 (C)生物过程(去)积极丰富EP4cKO鼠标冒号分析与大卫。 (D)生物过程(去)负强化EP4cKO鼠标冒号分析与大卫。 (E)GSEA情节浓缩的表示基因签名EP4cKO与Villin-Cre冒号使用“标志”编译从分子签名数据库(MSigDB Broad研究所)。 NES,规范化浓缩分数; 罗斯福,错误发现率。 (F)EP4表示IBD的mRNA水平数据集。 盒须图表明第25和第75百分位数,中值与最小和最大值的极端胡须。 *P< 0.05,* *P< 0.01。
评估我们的发现对人类患者的相关性,我们比较了基因改变的EP4消耗92 IBD-associated基因小组最近被报道15。 有趣的是,共有29个基因显示EP4-deficient冒号的表达模式发生改变(log2褶皱变化> 1)包含在IBD-associated基因面板(补充表S2)。 这些重叠基因编码的分子,如细胞因子(Il1b、Il21 Il33,肿瘤坏死因子)、趋化因子(亚兰、Ccl2 Cxcl9,Cxcl10),免疫细胞表面或衍生的分子(Cd4、Cd86 S100a8 S100a9,Nos2),细菌sensing-associated基因(Nod2和Lcn2)、胞内信号分子(Gata3和Stat1),补充系统的组件(C3和Cd55),粘附因子(Icam1)。 符合上述发现,人性IBD数据集分析的差别明显对这些表现出来的EP4信使rna表达水平在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者样本相对于健康对照组(图。4 f)。 综上所述,EP4-deficient冒号存在与增加细胞凋亡相关基因改变和增强炎性表型。
为了更好地描述的炎症反应EP4cKO结肠,我们首先研究了免疫细胞的渗透通过免疫组织化学分析。 F4/80的数量+巨噬细胞和CD4+T细胞是高的EP4cKO鼠标冒号,而CD8的数量+T细胞和Gr-1+中性粒细胞没有显著不同于控制Villin-Cre老鼠(图。5 a、B)。 此外,存在分析还显示调节的结果F4/80,CD4和CD8a信使rna表达水平EP4缺乏冒号(无花果。5度)。 这些数据表明,删除EP4导致结肠上皮细胞影响基质和潜在的炎症状态。 符合这个概念,信使rna表达水平的炎性细胞因子和趋化因子被删除的EP4结肠上皮(无花果。5 d, E).
免疫细胞浸润EP4cKO冒号。 (一个,BF4/80)染色,CD4、CD8和Gr-1 (一个在冒号)Villin-Cre和EP4cKO老鼠和量化(B; n = 3)。 酒吧= 50μm规模。 (C)表示基因的信使rna表达水平Villin-Cre和EP4cKO冒号分析中存在(n = 4)。 (D)mRNA表达的炎性细胞因子水平Villin-Cre和EP4cKO冒号分析中存在(n = 4)。 (E)mRNA表达的趋化因子水平Villin-Cre和EP4cKO冒号分析中存在(n = 4)。 结果显示为±SEM。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.005。
考虑到潜在的炎症状态EP4cKO结肠,我们接下来检查DSS-induced结肠炎模型。 引起结肠炎,老鼠注射2% DSS 7天,随后分析了结肠镜检查,其次是宏观和组织学分析(图。6).EP4cKO老鼠开发DSS的5天治疗后血便(无花果。6B)。 此后,大多数DSS-treatedEP4cKO老鼠总出血,而hemoccult观察控制是最严重的条件Villin-Cre老鼠接受DSS(图。6摄氏度)。 鼠标结肠镜检查结果证明在DSS-treated多个侵蚀或溃疡EP4cKO鼠标冒号(无花果。6 d)。 7天,解剖冒号的宏观检验表明,结肠长度明显缩短EP4cKO老鼠(图。6 e, F)。 组织学检查EP4cKO鼠标冒号显示更严重破坏上皮和广泛的肠道溃疡相对于控制Villin-Cre鼠标冒号(无花果。6克)。 此外,在组织学损伤分数高EP4cKO冒号(无花果。6小时)。 与炎症细胞浸润,尤其是F4/80-positive巨噬细胞和cd8 + T细胞,在更加突出EP4cKO老鼠(图。6 i, J)。 因此,除了潜在的炎症状态在生理条件下,EP4cKO老鼠容易DSS开发严重的结肠炎和管理。
炎症严重恶化EP4cKO老鼠DSS-colitis模型。 (一个实验治疗结肠炎有2% DSS)策略。 (B)代表的宏观视图在第五天开始DSS治疗后小鼠肛门。 黄色虚线圆圈表示积极出血EP4cKO老鼠。 (C在表示时间点)Hemooccult分数Villin-Cre(n = 8)EP4cKO老鼠(n = 7)。 (D的远端或中间冒号)结肠镜检查图像Villin-Cre和EP4cKO老鼠。 箭头表示纵向侵蚀,箭头表示溃疡,虚线轮廓炎症粘膜,圆是纤维化的地区。 (E,F)代表宏观图像(E)和长度(F结肠)Villin-Cre和EP4cKO老鼠在DSS开始治疗后第七天。 (n:Villin-Cre= 8,EP4cKO老鼠= 7)。 (G)的冒号)染色Villin-Cre和EP4cKO老鼠在DSS开始治疗后第七天。 虚线轮廓溃疡。 = 50μm规模。 (H)Histlogical损伤分数Villin-Cre(n = 8)EP4cKO老鼠(n = 7)后第七天开始DSS治疗。 染色(F4/80, CD4、CD8和Gr-1冒号Villin-Cre和EP4cKO老鼠在DSS治疗开始后第七天,和量化(J)。 = 50μm规模。 (n:Villin-Cre= 8,EP4cKO老鼠= 7)。 结果显示为±SEM。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.005。
我们目前的研究结果表明,肠道epithelium-specific EP4删除导致倾斜地下室结构和增加结肠上皮细胞的凋亡,导致一个潜在的炎性表型实验结肠炎易感性较高的相关联。 这些结果阐明上皮EP4维持结肠内稳态的关键功能,抑制炎症的发展。
我们没有观察到总控制之间改变肠道的外观Villin-Cre和EP4cKO老鼠; 然而,远端结肠隐窝的深度明显降低EP4cKO老鼠。 肠道上皮细胞的特点是其快速细胞营业额之间保持平衡,隐窝细胞扩散和表面上皮细胞凋亡。 在目前的研究中,删除上皮EP4并不影响结肠隐窝细胞增殖。 与此一致的是,调节隐窝细胞增殖的因素,如β-catenin、原癌基因、细胞周期蛋白D1,显示没有明显的信使rna表达水平或蛋白质定位的变化。 这些发现也符合,没有明显改变(尽管观察轻微下降的情况Lgr5就ISC标记等)的表达式Lgr5就和Sox9EP4-deficient和足够的冒号之间。 然而,由于有一个梯度EP4表达式与浓缩在表面技巧比肠上皮隐窝底和其他显示1,11上皮EP4可能影响更多的损失比干细胞区上方的墓穴。 考虑到Villin-cre鼠标线是一个适当的模型研究上皮细胞生物学,进一步研究EP4选择性失活的干细胞或祖细胞群使用ISC-specific Cre鼠标定位等Lgr5就和Sox9将必要的强劲理解EP4 ISC功能的作用。 而扩散并不改变,凋亡细胞的数量明显高于EP4-deficient冒号的表面上皮细胞。 这可以解释为改变线粒体细胞色素c-mediated细胞凋亡通路诱导上皮EP4的删除,建议EP4需要抑制这个途径,尽管EP4调节这个途径的详细机制仍有待探讨。 此外,我们的研究结果表明,增加细胞凋亡可能导致地下室缩短,即使保存细胞增殖潜力EP4cKO老鼠。 这个概念是由我们的球体实验表明一个EP4拮抗剂治疗并不影响球面扩散,但增加细胞凋亡,导致受损的球体的增长。
我们的其他发现在活的有机体内和体外模型是epithelial-EP4损失导致分泌细胞的数量减少的血统包括杯状,丛生,enteroendocrine细胞。 分泌细胞中央控制肠道生物学及其功能障碍会导致炎症等病理条件。 由杯状细胞分泌粘液,形式层分离的大部分从肠道上皮细胞腔的内容,而肠道簇细胞调节2型免疫反应在一个反应使用IL13 ILC2s分泌16。 与我们的结果一致,最近的报告显示了铂族元素的重要性2/ EP4轴粘蛋白分泌在应对使用IL13杯状细胞17。 从力学上看,铂族元素的绑定2在结肠EP4受体刺激cAMP-dependent胞外分泌。 此外,铂族元素2诱导营地反应元件结合蛋白/ ATF1磷酸化,进一步激活Muc2结肠上皮细胞的转录18。 另一方面,铂族元素2/ Cox2 Dclk1轴显示下一簇细胞功能的一个重要中介bacterial-induced结肠炎通过增强上皮修复反应19。 我们在这里提出了新的潜在机制铂族元素2/ EP4调节分泌细胞比例可能通过抑制细胞凋亡。 考虑到分泌细胞谱系和铂族元素的重要功能2/ EP4信号通路抑制结肠炎,我们的研究提供了一个有力的证据表明链接这两个重要的监管机构控制肠道炎症的发展。
除了增加上皮细胞凋亡,微阵列分析证明了删除上皮EP4增强免疫和炎症反应。 同意的粘膜屏障功能缺陷EP4-deficient冒号由于增加上皮细胞凋亡和减少分泌血统,我们观察到在结肠基质伴随着更多的免疫细胞渗透调节炎性细胞因子的表达EP4cKO老鼠即使老鼠与WT老鼠总值外观与正常体重和基础条件下的寿命。 这些发现表明,上皮EP4-deficient冒号是倾向于炎性表型。 这个潜在的炎症小鼠上皮EP4-deficiency体现了DSS等治疗炎症刺激。 我们的观察与先前的研究一致表明全球EP4KO小鼠显示表达下调基因的表达与组织防御,重塑,免疫抑制,IFN-γ引起的调节基因的表达和处理DSS时显示强烈的炎症9。 因此,我们首次表明,肠道上皮细胞缺乏对EP4已经在pre-inflammatory条件和上皮EP4损失单独能充分引起表型在鼠标冒号。 虽然还需要进一步的研究来确定基质EP4在肠道的作用,极有可能是炎症刺激的预备状态是与增加上皮细胞凋亡有关EP4cKO老鼠。 即EP4-deficiency引起的上皮细胞凋亡、肠道屏障,导致缺陷可能先于潜力和听不清炎性微环境中的地位。 如果是这样,这也是合理的EP4cKO老鼠非常容易DSS治疗。 先前的研究表明,全球EP4击倒或政府EP4拮抗剂加剧DSS-induced结肠炎9。 在这些实验中,EP4受体被删除或抑制上皮细胞和基质细胞。 在上皮细胞,激活EP4信号促进粘蛋白和碳酸氢盐分泌上皮细胞13,14。 在基质细胞,激活EP4信号抑制细胞增殖和Th1细胞因子的生产孤立固有层单核细胞9。 事实上,EP在天真的CD4受体表达+T细胞3.,EP4是最丰富和强大的EP在Th17细胞受体表达2。 我们目前的研究结果表明,上皮细胞生存和需要EP4 EP4删除在上皮细胞参与的起始和/或维护肠道炎症。 这些发现,连同我们的生物信息学分析的结果对人类IBD数据集,可能有助于更好的理解如何EP4人类IBD产生一种保护作用10,20.。
总之,我们的研究是第一个展示了潜在的和潜在的炎症引起的状态在冒号epithelial-specific EP4删除在生理条件下。 值得注意的是,破坏上皮EP4信号足以产生这样的表型。 这些数据为我们提供了一个线索理解机制维护结肠内稳态。
Villin-Cre老鼠从杰克逊实验室(# 004586)21,EP4液氧老鼠产生如前所述12。 动物被安置在特定的无菌条件下动物设施的京都大学。 八周大的老鼠。 所有实验动物研究委员会批准京都大学,按照日本政府规定执行。
小鼠结肠组织和4%多聚甲醛缓冲溶液固定,石蜡包埋,切片厚度(5µm)。 部分是deparaffinized、水化和苏木精和伊红染色())或阿尔新蓝。 免疫组织化学,部分被孵化主要抗体室温2 h,然后用生物素化的二次抗体1 h在室温下; immunoperoxidase与亲和素、生物素标记是可视化复杂(VECTASTAIN精英ABC设备; 向量的实验室,伯林盖姆,CA,美国),部分彩色diaminobenzidine衬底(美国Dako,圣克拉拉,CA)和苏木精复染色。 免疫荧光,部分被孵化主要抗体2 h与PBS在室温和清洗。 洗部分与荧光孵化dye-conjugated二级抗体(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 1 h在室温下,沾染了赫斯特染料10分钟在室温下,甘油和嵌入式为50%。 为定量分析,细胞数量统计在至少五个随机大功率领域从每个基因型的三种动物。 主要抗体用于本研究获得指定的供应商:兔子anti-Dclk1 (ab31704 Abcam),兔子anti-Chromogranin (ab15160 Abcam),鼠anti-Ki67(652402年,BioLegend),兔子anti-Muc2 (SC15334, Santa Cruz),兔子anti-cleaved半胱天冬酶3(9664年代,细胞信号技术),鼠标anti-E-cadherin(610182年,BD转导实验室),兔子anti-F4/80 (ab6640 Abcam),鼠anti-CD4 (14-0041-85, eBioscience),鼠anti-Gr1 (14-5931-85, eBioscience),鼠标anti-Ctnnb1 (610153 BD生物科学),鼠anti-CD8(550281年,eBioscience)和兔anti-EP4 (ab133170 Abcam)。 TUNEL染色进行使用原位细胞死亡检测装备,咯红(罗氏)。
分析结肠炎的严重性,老鼠牺牲后7天2% DSS。 结肠分为近端,中间,和远端部分。 组织学损伤如前所述20.。 两个参数测定:炎症的程度(0,没有; 1、轻微; 2、温和; 3,严重)和地下室损害的程度(0,没有; 1、基底1/3部分受损; 2、基底三分之二部分受损; 3,整个地下室受损但表面上皮完整; 4,整个地下室和上皮细胞失去了)。 每个分数确定结肠炎的严重程度。
根据之前的协议结肠隐窝是孤立的22。 总之,切除结肠组织中孵化TrypLE™表达酶(1 x)和酚红(# 12605036)为30分钟37°C。 孵化后,上皮是由剧烈的摇晃,其余肠组织将被放置在一个新的集合管后续分数。 在隔离之后,隐窝细胞颗粒状,通过100年µm细胞过滤器。 然后,结肠隐窝收集球体文化或RNA分析。
l细胞条件培养液的线分泌Wnt3a R-spondin3,‘诺金’(L-WRN厘米)是如前所述准备的23。 L-WRN细胞从写明ATCC购买(写明ATCC; CRL3276)。 孤立的近端结肠隐窝是嵌入在基底膜基质(BD生物科学)。 球体文化的正常上皮、50% L-WRN厘米补充5µM y - 27632 (Tocris生物科学)被添加到每个。 EP4拮抗剂实验,从控制生成的球状体(Villin-Cre)小鼠治疗或没有特定EP4-antagonist L161,982(100µMσ)48 h,然后分析。
使用RNA提取的总RNA随后迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。 RNA是处理芯片或定量逆转录聚合酶链反应(存在)。 长串互补DNA合成(互补)使用Transcriptor合成第一链cDNA工具包(罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士)。 执行中存在使用SYBR绿色我主(罗氏应用科学)和一个光周期计480(罗氏应用科学)。 所有反应都是在重复执行,mRNA的表达水平是归一化比较3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的mRNA。 引物设计使用MGH底漆银行,引物序列描述的补充表S1。
总rna从Villin-Cre和Villin-Cre; EP4液氧/液氧鼠标整个结肠组织(分别为n = 3)受到SurePrint G3鼠标GE v2 8×60 K微阵列(安捷伦)。 处理信号强度被全球标准化的扩展方法。 削减意味着探针强度决定通过消除2%的低和高的探针强度计算比例系数。 规范化的信号强度是然后从目标强度计算每个数组使用这个因素,这样每个数组的削减意味着目标强度是任意设置为2500。 数据分析来识别基因探针显示超过一个双重的改变。 完整的微阵列数据的数量加入报告摘要GEO: GSE 135859。
KEGG,鼠标微阵列数据分析(见上文“微阵列分析”)是由大卫上传数据。 基因集富集分析(GSEA)进行使用GSEA 3.0软件(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp使用信噪比)与1000的基因簇排列gene-ranking h.all.v6.1指标的集合。 符号(H), c2.all.v6.1。 符号(C2),或者c5.all.v6.1。 符号(C5)。 原始基因表达数据炎症性肠病样本数据集(GSE36807、GSE38713 GSE13367)直接访问通过地理(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).
小鼠结肠组织被放置在4%多聚甲醛2%戊二醛至少12 h,并切成1毫米厚冠状部分。 接下来,部分被你找找1.0%锇tetraoxide在100毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7.4,在室温下2 h,脱水在一系列的粒级乙醇的解决方案。 沉浸在丙烯氧化后,样本沉浸在混合(1:1)氧化丙烯和Epon812 (luveac - 812, Nacalai Tesque,日本)为1.5 h。 样本然后沉浸在一个混合物(1:3)氧化丙烯和Epon812 1.5 h,最后只沉浸在Epon812 12 h。 浸泡后,样本嵌入Epon812树脂根据倒梁胶囊过程和聚合60°C 3天。 组织样本被切成超薄部分(70海里)的EM UC6超微切片机(德国徕卡)。 超薄部分检查与H7650电子显微镜(日立、日本)。
分析严重的结肠炎小鼠结肠,我们使用一个高分辨率小型内窥镜系统24,25,26。 这个系统是由一个微型刚性内窥镜,氙气光源,三重芯片高分辨率CCD相机,和一个操作鞘3 Fr.仪器通道和注水灯泡来调节小鼠结肠的通货膨胀从卡尔Storz(所有)。 内窥镜图像被认为与高分辨率平板彩色监视器。
所有值都呈现意味着±SEM。 组间显著差异确定使用学生的t测试(双尾未配对),当数据满足正态分布检验达测试。 如果数据不符合这个测试,Mann-Whitney测试使用。 是统计显著性水平的测试P< 0.05。
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