自噬调节脂肪干细胞在LPS诱导的肺微血管屏障损害中的治疗潜力
脂肪干细胞(ADSCs)已被证明是有益的在某些肺部疾病,和旁分泌作用的主要机制是ADSC-based疗法。 自噬起着至关重要的作用在维持干细胞体内平衡和生存。 然而,自噬的作用在调节ADSC旁分泌作用尚未完全阐明。 我们检查是否ADSCs参与脂多糖(LPS)全身的肺微血管内皮细胞(PMVEC)屏障损伤以旁分泌的方式和照明自噬的作用在调节ADSC旁分泌作用。 PMVECs和ADSCs有或没有自噬抑制cocultured没有细胞间接触,和微血管屏障功能是有限合伙人治疗后评估。 ADSC旁分泌功能是通过检测评估基本为内皮细胞生长因子。 体内实验,ADSCs有或没有自噬抑制被移植到LPS-induced肺损伤小鼠,与肺损伤评估。 ADSCs显著缓解LPS-induced微血管屏障损伤。 此外,ADSC旁分泌VEGF水平,FGF,由有限合伙人和EGF诱导治疗,尤其是在coculture条件。 抑制自噬削弱了旁分泌功能和ADSCs在微血管屏障损伤的保护作用。 此外,ADSC移植减轻LPS-induced肺损伤,抑制自噬明显削弱了治疗ADSCs对肺损伤的影响。 在一起,这些发现表明ADSC旁分泌作用发挥LPS-induced肺微血管屏障损伤的重要保护作用。 自噬是一个积极的旁分泌的调节因素的过程。 这些结果有助于照亮ADSC旁分泌的作用和机制的影响和发展有效的疗法在急性肺损伤。
急性肺损伤(ALI)仍然是一个主要贡献者高发病率和死亡率的内部和外部的医院。 这种综合症的主要病理特征之一就是内皮研究导致肺部炎症和损伤1。 来自革兰氏阴性细菌内毒素脂多糖(LPS)被认为是主要的诱发因素激活的炎症通路诱导肺动脉内皮渗透性在阿里的发展2。 近年来,许多研究已经建立了探索和了解阿里的发病机理; 然而,治疗效果尚未明显增强,总体死亡率仍然很高。 因此,迫切需要开发新的疗法。
干细胞疗法已成为近年来普遍接受。 脂肪干细胞(ADSCs),人口的间充质干细胞在脂肪组织中,可以很容易地收获和最小的侵袭性条件下迅速扩散。 先前的研究已经表明,ADSCs有优越的抗炎和regeneration-enhancing属性,因为他们可以分泌生物活性因子比骨骨髓来源干细胞(msc)3.。 旁分泌作用而不是分化转移被认为是主要的干细胞的作用机制防止组织损伤和促进组织修复和维修。 越来越多的证据表明,ADSC移植是有益的,特别是在肺部疾病4,5。 然而,ADSCs的作用及相关机制和旁分泌功能在维护肺微血管屏障完整性LPS-induced阿里迄今尚未完全阐明。
自噬是一种细胞self-degradative过程受损细胞器和蛋白质变性是隐藏在自噬体和交付给最终降解溶酶体。 基底自噬是至关重要的角色在维持细胞内稳态和重塑在正常发展。 功能失调的自噬与各种肺部疾病有关,包括阿里、肺动脉高血压,慢性阻塞性肺疾病6,7,8。 许多最近的研究已经证明了一些autophagy-related基因的角色及相关通路在调节维护、扩散和各种干细胞的分化9,10。 然而,自噬是否介导ADSCs预防肺微血管屏障损伤下阿里仍然遥遥无期。
本研究的目标是检查的功能(1)ADSCs cocultured与LPS-challenged PMVECs维持肺微血管内皮屏障的完整性,(2)移植的疗效ADSCs LPS-induced阿里,和(3)自噬的影响函数的ADSCs肺微血管内皮屏障损伤和阿里在LPS处理条件下。
有限合伙人(从大肠杆菌)(l - 2630)和FITC-dextran(53379)从Sigma-Aldrich购买。 内皮细胞生长培养基(ECM, 1001)从ScienCell购买。 针对autophagy-related短发卡RNA基因7 (shATG7)质粒,ATG7 shRNA慢病毒粒子和抗体针对ATG7买来圣克鲁斯生物技术(sc - 41448 sh sc - 41448 v,和sc - 376212)。 第二抗体,包括anti-microtubule-associated蛋白质1-light链3 (LC3) B (3868), anti-sequestosome 1 / p62蛋白质(p62) (5114), anti-GAPDH(2118)和anti-rabbit免疫球蛋白(7074),从细胞信号技术购买。 mRFP-GFP-LC3得到运载体从汉生物技术有限公司(HanBio、上海、中国)。 Anti-zonula occludens-1 (ZO-1)和anti-claudin-5买来Abcam (ab216880和ab131259)。 Rhodamine-conjugated phalloidin从英杰公司购买(分子探针,R415)。 下面的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自研发系统:肿瘤坏死因子(TNF) -α(MTA00B)、白介素(IL) 1β(MLB00C), IL - 10 (M1000B)、血管内皮生长因子(VEGF) (MMV00),纤维母细胞生长因子(FGF) (MFB00)和表皮生长因子(EGF) (MEG00)。 伊文思蓝(E2129)从Sigma-Aldrich购买。
鼠标ADSCs (Cloud-Clone Corp . CSI031 Mu01) ADSC完全培养基上培养。 时主ADSCs收获了胰蛋白酶已经增长到了大约80%的融合。 然后,这些细胞被镀在新的文化菜~ 6000个细胞/厘米2。 在目前的实验中,自噬是否可能影响ADSC特点,我们构造的ADSC线有或没有自噬抑制通过应用shRNA针对autophagy-related基因(ATG) 7和慢病毒转染实验。 ADSCsshRNA-ATG7和ADSCsshRNA-Con分别代表ADSCs有无自噬抑制(如详细的补充材料和方法).
For in vitro experiments, mouse pulmonary microvascular endothelial cells (PMVECs) (Cloud-Clone Corp., CSI027 Mu01) were cultured in endothelial cell medium. The cells were detached with trypsin/ethylene diamine tetra acetic acid when they grew to confluence (usually 3–5 d), and then they were transferred to new dishes at a split ratio of 1:2 for further propagation. In this study, PMVECs of passages 3–5 were selected for analysis.
In this study, PMVECs were divided into four groups as follows: PMVECs, LPS-challenged PMVECs, LPS-challenged PMVECs cocultured with ADSCsshRNA-Con and LPS-challenged PMVECs cocultured with ADSCsshRNA-ATG7. In the coculture system, PMVEC suspensions were added to the top chambers of the cell-culture inserts (0.4-μm pore size polyester membrane from Corning, Inc.) at a density of 50,000 cells per insert well, and ADSCs were cultured on the bottom at a density of 70,000 cells/well, resulting in coculturing without direct contact. To mimic LPS-induced lung injury, PMVECs were incubated in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 supplemented with 10% fetal bovine serum containing 100 ng/ml LPS and cultured for 6 h. In addition, culture media from LPS-treated PMVECs and normal cultured PMVECs were collected as LPS-treated PMVECs-culture media (CM) and PMVECs- CM, then these media were added into ADSCs culture media, so that to verify the effect of PMVECs on ADSCs autophagy in cocultured system.
When ADSCs had grown to 70–80% confluence, they were washed by PBS and then incubated in serum-free Dulbecco’s modified Eagle’s medium. These cells were separated into two groups, one group of cells was treated with 100 ng/ml LPS and another group of cells was treated with equal volume of PBS for 6 h. After that, the media were collected as LPS-treated ADSCs-CM and ADSCs-CM. These media were added into PMVECs cultured media, so that to make clear the paracrine function of ADSCs on LPS-induced pulmonary microvascular injury.
Adenoviral transfection was carried out when ADSCs reached ~50–70% confluence. The cells were incubated in growth medium with the adenoviruses at an MOI of 100 for 2 h at 37 °C. The cells were grouped as follows: ADSCs, ADSCs cocultured with PMVECs, ADSCs with direct LPS treatment, and ADSCs cocultured with LPS-challenged PMVECs. Using the mRFP-GFP-LC3 adenoviral vectors, LC3B-positive, neutral pH autophagosomes, and acidic pH autolysosomes could be detected as green fluorescence (GFP) and red fluorescence (RFP), respectively. Autophagic structures were detected under a Nikon A1 R laser confocal microscope. Autophagic flux was assessed by evaluating the ratio of yellow puncta to the total number of GFP and mRFP puncta.
ADSCs or PMVECs were homogenized in RIPA lysis buffer, and then the homogenate was incubated on ice for 45 min and centrifuged at 4 °C (12,000 rpm for 5 min). After determining the protein concentration using the BCA protein assay kit according to the manufacturer’s instructions, the supernatant was collected and the proteins were separated in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE) at 120 V for 2 h. The proteins in the gels were transferred onto a polyvinylidene difluoride membrane, which was then incubated with specific primary antibodies, followed by incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies for 1 h. Finally, protein visualization was performed using Pierce ECL western blotting substrate and autoradiography. The following primary antibodies were used: anti-LC3B, anti-p62, anti-ATG7, anti-ZO-1, anti-claudin-5, and anti-GAPDH. Quantity One 4.6 software was applied to analyze the blots, and the data were normalized to GAPDH and expressed as the optical density (OD) integration.
We determined stress fiber formation by detecting F-actin using a rhodamine-conjugated phalloidin molecular probe according to the manufacturer’s instructions. Cells that were treated with 100 ng/ml LPS were fixed with 3.7% paraformaldehyde for 10 min, permeabilized with 0.5% Triton X-100, and finally stained with rhodamine-conjugated phalloidin. The nuclei were labeled with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). The labeled cells were detected under a Nikon A1 R laser confocal microscope. We quantified F-actin conformation by analyzing the percentage of cells containing stress fiber in each experimental group.
In the transwell system, PMVECs and ADSCs were cultured in the upper and lower wells, respectively. FITC-dextran (1 mg/ml, MW 40,000) was added on top of the wells, allowing it to permeate through the PMVEC monolayers. After LPS treatment, the media was collected at 0 and 6 h from the lower compartments of the transwell chambers, and then an equal volume of cell basal medium was refilled. The fluorescence values of FITC-dextran in the upper and lower wells were determined with a fluorescence microplate reader (BioTek Instruments, Inc., FLX800TBID) at an excitation wavelength of 492 nm and a detecting emission of 520 nm. The final values were calculated by subtracting the fluorescence values at 0 h. The results are presented as the percentage of the fluorescence values in the control group.
PMVECs被固定为4%多聚甲醛在室温下30分钟。 这是紧随其后的是几个冲洗PBS和透化作用在特里同x - 100 0.1% 0.1%柠檬酸钠对冰2分钟。 然后,50μl TUNEL染色的解决方案是添加到井,和细胞孵化37°C的暗调湿室1 h。 最后,这些细胞被孵化与DAPI在室温下20分钟。 之后,凋亡细胞检测到荧光显微镜(×200,激发波长:488海里,发射波长:530海里),和凋亡率进行了分析。 细胞含有绿色荧光点被定义为凋亡细胞。
凋亡的检测进一步使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备根据制造商的指示,和细胞用流式细胞分析仪进行了分析。 简而言之,PMVECs与0.25%胰蛋白酶消化,然后用PBS冲洗两次。 然后,这些细胞被resuspended 1×绑定缓冲1×10的浓度6解决方案的细胞/毫升,100µl被转移到5毫升文化管之后,添加5µl膜联蛋白V-FITC和5µl propidine碘。 最终的解决方案是在黑暗中在室温下孵化15分钟紧随其后的400µl 1×绑定缓冲。 凋亡率分析了立即通过流式细胞术(FCM) (BD生物科学,流式细胞仪咏叹调III)。
从coculturing系统中收集和离心机在4°C(15分钟1000 rpm)。 上层清液的收集,VEGF浓度,FGF,并使用鼠标EGF在中测定VEGF, FGF及EGF ELISA板根据制造商的指示。
实时rt - pcr进行确定相对VEGF mRNA水平,FGF, EGF在ADSCs cocultured PMVECs。 总RNA为ADSCs孤立,cocultured PMVECs通过使用GenElute哺乳动物总RNA工具包(σ,圣路易斯,密苏里州)根据手册。 纯化RNA用于逆转录使用rt - pcr一步(豆类)。 中使用的引物PCR反应如下:VEGF,向前:5′-AACGATGAAGCCCTGGAGTG-3′和反向:5′-TGAGAGGTCTGGTTCCCGA-3′; FGF,向前:5′-CCTCTCAGAGACCTACGTTCAA-3′和反向:5′-GGAGGTCAAGGCCACAAT-3′; EGF、前进:5′-GCTGTGACGGTCCTTACAATG-3′; 反向:5′-CAGTTCCCACCACTTCAGGTC-3′或GAPDH:转发:5′-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC-3′和反向:5′-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3′。 循环条件:48°C为1分钟30分钟和94°C,紧随其后的是40周期为15秒94°C, 65°C为30年代和68°C 1分钟。 聚合酶链反应产物与2%琼脂糖凝胶电泳检测和分析凝胶成像分析仪。 目标基因的比例(VEGF, EGF和EGF) OD参考基因(GAPDH) OD在同一个样本计算和视为目标基因mRNA相对含量。 所有的分析都是在重复执行。
在体内实验中,8-10-week-old野生型BALB / c小鼠(动物中心、复旦大学、上海、中国)。 固体食物的动物被饿死,但有免费水前12 h实验。 所有实验协议是复旦大学动物保健委员会的批准。 所有的动物都符合准则处理实验动物保健和使用11。 老鼠被麻醉,然后口头插管与无菌塑料导管和挑战气管内的滴剂2毫克的有限合伙人公斤−1合著ADSCsshRNA-ATG7或ADSCsshRNA-Con(2.5×105细胞,100μl总量)慢慢地通过尾静脉导管注入30分钟后有限合伙人的挑战。 老鼠牺牲后48 h有限合伙人滴注法。
老鼠人道地杀死了有限合伙人的挑战后,和新鲜的左肺组织立即收获和固定在10%福尔马林,嵌入在石蜡,切成4-μm粗石蜡切片。 部分被苏木精和伊红染色())。 肺损伤评估根据四类:间质性炎症、嗜中性粒细胞浸润,充血、水肿。 评估结果显示为分数在0到4点范围内:没有伤害= 0分; 伤害25%的领域= 1分; 伤害50%的领域= 2分; 伤害75%的领域= 3分; 和伤害整个字段= 4分12。 十个微观领域从每个幻灯片进行了分析。 组织幻灯片的金额平均肺损伤的严重程度进行评估。 所有微观部分被一位病理学家得分盲实验团体和协议。
肺部水肿的严重性评估通过确定肺湿/干重量的比值。 简单,测量肺湿重后,相同的肺在56 72°C, h,干和肺湿/干重量比计算。
肺微血管屏障通透性是评估使用伊文思蓝染料。 静脉注射的小鼠注射20毫克公斤−1染料终止前30分钟有限合伙人的待遇。 所有小鼠安乐死有限合伙人的挑战后,和开胸。 血液的灌注肺自由与肝素生理盐水含有500单位5厘米H2o .干肺组织都沉浸在0.5毫升甲酰胺和均质。 然后,匀浆在37°C孵化24 h和离心机在5000 g为30分钟。 上层清液的光密度是spectrophotometrically以620海里。 伊文思蓝的总量是由比较标准吸光度曲线。
BALF的检索,每个鼠标的左将军支气管的结扎,然后正确的肺与0.5毫升PBS灌溉有限合伙人的挑战。 三倍的液体灌洗池。 从每个鼠标总BALF离心机在4°C(15分钟1000 rpm)。 TNF-α的浓度、IL-1β和BALF中il - 10上层清液测定使用鼠标TNF-αIL-1β,il - 10 ELISA包根据制造商的指示。
数据从至少三个独立的实验一式三份。 使用SPSS 13.0软件进行数据处理。 结果显示为平均值和标准偏差(平均数±标准差)。 组间差异分析单向方差分析和事后Bonferroni调整为多个比较。 组织学半定量的分析比较了非参数Mann-Whitney测试。 一个P -值< 0.05被认为是具有统计学意义。
确定ADSCs经历了自噬在LPS-induced肺微血管屏障损伤,我们检测到的自噬水平ADSCs在不同实验小组。 如图所示,我们发现增加LC3-II的表达但减少有限合伙人中p62治疗组。 这些影响是进一步提高当细胞与LPS-challenged cocultured PMVECs(无花果。1 a, b).
一个免疫印迹LC3的形象代表,ADSCs p62。b统计分析LC3的表达式和p62。c代表性的图片暂时ADSCs overexpressing mRFP-GFP-LC3。 中性pH LC3B-positive自噬体(绿色荧光)和酸性pH LC3B-positive自溶酶体(红色荧光)使用共焦显微镜检测。d量化的mRFP+绿色荧光蛋白+(黄色)puncta至少10细胞/组织。e代表免疫印迹图像LC3和p62 ADSCs被PMVECs-culture媒体(CM)或LPS-treated PMVECs-CM。f统计分析LC3的表达式和p62。 结果提出了均值±SD (n= 3)
LC3-II水平可以增加相关增强自溶酶体自噬小体的形成或受损的间隙。 区分上述可能性,我们转染Ad-mRFP-GFP-LC3,一个特定的标志自噬体和自吞噬泡,ADSCs。 我们发现,细胞处理有限合伙人或cocultured LPS-challenged PMVECs GFP-LC3显示一个典型的积累和mRFP-LC3 puncta细胞质和细胞核周围的区域(图。1 c)。 LPS-treated细胞的数量mRFP-GFP-LC3 puncta远远大于在控制细胞,和puncta的数量是最大的ADSCs cocultured与LPS-triggered PMVECs(无花果。1 d).
进一步澄清的效果cocultured PMVECs ADSC自噬,我们发现LC3的表达,从PMVECs p62 ADSCs培养对待媒体。 细胞自噬水平最高的媒体处理LPS-triggered PMVECs。 媒体从正常培养PMVECs没有明显影响的自噬水平ADSCs(无花果。1 e, f).
我们成功地构建ADSC行有或没有自噬抑制使用shrna针对ATG7称为ADSCs或控制成分shRNA-ATG7和ADSCsshRNA-Con分别(无花果。S1a-c)。 流式细胞仪分析表明ADSCs有或没有自噬抑制有相似的表面标记:CD90 (+), CD105 (+), CD44(+)和CD45(−)(图。S2).
确定调节自噬影响的监管功能ADSCs PMVEC屏障的完整性,我们在不同文化条件下检测内皮渗透性。 Cocultured ADSCs有或没有自噬抑制无显著影响的渗透率通常培养PMVECs(无花果。S3)。 LPS处理显著增加PMVEC渗透,有效降低coculturing ADSCsshRNA-Con。 群中的渗透率PMVECs cocultured ADSCsshRNA-ATG7远高于在PMVECs cocultured ADSCs吗shRNA-Con(无花果。2).
一个渗透率的PMVECs通过transwell试验检测。b荧光图像ZO-1和claudin-5 PMVECs cocultured ADSCsshRNA-ATG7或ADSCsshRNA-Con。c免疫印迹的形象代表ZO-1 PMVECs claudin-5。d统计分析的表达式ZO-1 PMVECs claudin-5。 结果提出了均值±SD (n= 3)
评估ADSC的影响在LPS-induced紧密连接损伤,我们进一步评估的表情ZO-1 claudin-5,两个PMVEC紧密连接的重要组成蛋白质。 如图所示,LPS处理破坏了紧密连接完整性和抑制的表情ZO-1 PMVECs claudin-5。 伤害提高了紧密连接的完整性,以及降低ZO-1 claudin-5被ADSCs减毒shRNA-Concoculture。 然而,自噬抑制减弱ADSCs的保护作用紧密连接(图2 b)。 应用免疫印迹分析量化ZO-1和claudin-5的表达。 符合上述发现,有限合伙人挑战显著抑制ZO-1的表达和claudin-5 PMVECs。 然而,这两个蛋白的表达被与ADSCs coculturing有效衰减shRNA-Con。 自噬抑制有限的保护作用ADSCs ZO-1和claudin-5表达式(无花果。2 c, d).
信息连接是由皮质压力f -肌动蛋白纤维,可诱导聚合形成transcytoplasmic电缆。 电缆生成之间的紧张关系和信息枢纽和焦粘连的细胞外基质干扰信息连接,导致paracellular渗透性增加13。 压力在目前的研究中,肌动蛋白纤维形成PMVECs由有限合伙人显著增加,但它明显减弱时,细胞与ADSCs coculturedshRNA-Con。 然而,禁止自噬抑制作用的shRNA-ATG7削弱ADSCs LPS-induced应力纤维形成PMVECs(无花果。3)。 我们进一步量化细胞压力纤维在不同的组。 LPS处理显著增加细胞包含应力纤维的比例。 Cocultured ADSCs有或没有自噬抑制有效降低细胞包含应力纤维的百分比。 然而,自噬抑制作用,在一定程度上,减少了ADSCs对应力纤维的形成的影响PMVECs(无花果。3 b).
一个应力纤维的形成与f -肌动蛋白染色发现,核与DAPI染色。b统计分析的细胞包含应力纤维的比例(n= 3)
细胞凋亡是LPS-induced内皮损伤的主要原因之一。 在这项研究中,我们审查的影响有限合伙人PMVEC凋亡和ADSCs是否会受到影响。 在一个实验中,我们通过FCM检测细胞凋亡率的变化。 有限合伙人治疗PMVEC凋亡率从4.35±0.87%增加到29.32±1.45%。 ADSCsshRNA-Concoculture减少LPS-induced PMVEC凋亡率为10.81±1.01%,而ADSCsshRNA-ATG7只有降低了凋亡指数(图23.34±1.66%。4 a、b).
一个,b典型的流式细胞术为凋亡PMVECs象限图和相应的统计数据。 左上角,右上角和右下角情节代表坏死细胞和末和早期凋亡细胞,分别。c,d代表荧光图像和相应的统计分析TUNEL染色的细胞凋亡。 结果提出了均值±SD (n= 3)
在另一项实验中,TUNEL分析应用于测量细胞凋亡水平。 LPS-treated细胞的细胞凋亡率显著增加(26.72±1.88%),并减少在PMVECs cocultured ADSCsshRNA-Con(10.52±1.69%)和PMVECs cocultured ADSCsshRNA-ATG7(20.34±1.67%)与空白相比,控制细胞(4.17±0.89%)(图。4 c, d).
体内的组织学评估分析表明LPS刺激一个引人注目的多形核白细胞涌入到肺泡空间,以及肺组织明显充血和水肿。 移植ADSCsshRNA-Con有效的减毒LPS-triggered肺损伤。 然而,移植的ADSCs的保护作用shRNA-ATG7是比ADSCs更糟shRNA-Con(无花果。5)。 通过半定量的分析使用肺损伤肺部分的分数,我们发现LPS-induced肺损伤是减毒ADSCs的移植shRNA-Con,抑制ATG7表达明显减弱的治疗疗效ADSCs LPS-induced肺损伤(无花果。5 b).
一个代表肺组织病理学切片苏木精和伊红染色())。b显微损伤的肺在统计学上得分。c肺水含量是由计算肺湿/干重比。d评估肺微血管通透性检测每克伊文思蓝的含量的肺部组织。e浓度的肿瘤坏死因子(TNF) -α,白介素(IL) 1β和IL - 10在支气管肺泡灌洗液(BALF) LPS-treated老鼠肺部。 结果提出了均值±SD (n= 24个/组,6)染色和病理评分; 湿/干重比6; 6的伊文思蓝含量检测; 6 BALF收集和酶联免疫吸附试验)
在另一个实验中,我们评估在肺组织中细胞凋亡。 LPS诱导显著的细胞凋亡,这是有效地减毒ADSCs的移植shRNA-Con。 抑制ATG7表达,然而,明显削弱了功效的ADSCs LPS-induced细胞凋亡(无花果。S4).
此外,肺部水肿是评估通过检测肺湿/干重比。 有限合伙人挑战诱导显著增加肺湿/干重比。 ADSC移植肺血管渗漏和肺部水肿减毒活疫苗LPS-challenged老鼠。 然而,在LPS-induced ADSCs肺部水肿的抑制作用明显削弱了ATG7抑制(无花果。5度).
此外,泄漏指数确定使用伊文思蓝染料,进一步阐明肺血管泄漏的严重程度。 伊文思蓝泄漏在LPS组显著增加,它被ADSC移植显著减弱。 然而,shRNA-ATG7干预的保护作用明显减少ADSCs LPS-induced肺部水肿(图。5 d).
过度炎症反应是LPS-associated阿里的原因之一。 评估炎性反应,我们测量的水平BALF中细胞因子,调节炎症。 有限合伙人显著增加促炎细胞因子的生产TNF-αIL-1β但减少的抗炎细胞因子il - 10。 移植ADSCsshRNA-Con减毒的生产TNF-αIL-1β但有效地促进了il - 10的生产。 之前抑制自噬的能力削弱ADSCs调节这些炎性细胞因子的生产(无花果。5 e).
澄清是否ADSC旁分泌作用影响LPS-induced PMVEC渗透率,我们应用培养媒体ADSCs PMVECs。 媒体单独培养ADSCs有效缓解PMVEC渗透率。 相比之下,媒体LPS-treated ADSCs显示更显著的功效降低LPS-induced PMVEC渗透率(无花果。6).
一个渗透率的HPMVECs通过transwell试验检测。b,c典型的流式细胞术对凋亡PMVECs象限图和相应的统计数据
的旁分泌作用ADSCs PMVEC凋亡是证明了治疗PMVECs ADSCs培养媒体。 培养媒体ADSCs有效缓解PMVEC细胞凋亡。 然而,与媒体控制ADSCs相比,媒体从LPS-preconditioned ADSCs显示更重要的影响抑制LPS-induced PMVEC细胞凋亡(无花果。6 b, c).
等生长因子VEGF、FGF和表皮生长因子,维持内皮细胞的生存和发展至关重要。 以前的研究已经表明ADSCs可以产生和分泌VEGF, FGF EGF,然后这些因素发挥旁分泌作用14,15。 自噬是否可能影响ADSCs的旁分泌作用,我们发现三个生长因子的浓度培养基的不同群体。 VEGF在正常培养条件,低浓度,FGF, EGF在中只包含PMVECs检测到。 在正常培养条件,cocultured ADSCsshRNA-Con或ADSCsshRNA-ATG7对VEGF的含量没有显著影响,FGF和EGF coculture介质(无花果。S5)。 有限合伙人治疗减少上述生长因子的浓度。 与LPS-treated ADSCs cocultured PMVECs说VEGF的含量增加,FGF和EGF coculture媒介。 然而,抑制自噬的释放生长因子影响cocultured ADSCs(无花果。7一个)。 在体内实验中,我们评估了VEGF浓度,FGF,从不同的老鼠组BALF中EGF。 上述生长因子的浓度LPS-treated肺组织BALF是最低的,并且有效地提高了移植ADSCs。 然而,抑制自噬削弱ADSCs生长因子水平的促进作用LPS-challenged肺BALF(无花果。7 b).
一个VEGF浓度,FGF和EGF coculturing ADSCs媒介和PMVECs LPS处理检测到。bVEGF浓度、FGF和BALF中EGF实验老鼠发现。c,dFGF mRNA的表达VEGF, EGF ADSCs和PMVECs coculturing条件下。 结果均值±SD (n= 3)
阐明VEGF的起源、FGF EGF coculture系统,我们量化ADSCs mRNA表达和cocultured PMVECs。 有限合伙人治疗降低了上述的mRNA表达生长因子在PMVECs和ADSC coculture提升PMVECs mRNA的表达。 然而,这种ADSCs被显著地抑制自噬抑制的效果。 同样,coculturing系统,三个生长因子mRNA表达的野生型ADSCs显著高于autophagy-inhibited细胞。 那些PMVECs相比,信使rna表达水平上述生长因子在cocultured更高ADSCs。 因此,ADSC旁分泌作用发挥更主要的作用比PMVEC自分泌的影响,尽管PMVEC自分泌作用和共现ADSC旁分泌影响LPS-treated coculturing条件(图。7 c, d).
尽管ADSCs已被证明在阿里有保护作用,自噬是否参与调解的影响ADSCs LPS-induced肺微血管屏障损伤仍然未知。 我们体外结果表明LPS-induced PMVEC微血管屏障损伤减轻了ADSC coculture。 我们的数据表明,ADSCs自己经历了自噬在有限合伙人治疗和改善抑制自噬的影响削弱ADSCs PMVEC微血管屏障的完整性。 体内数据显示ADSC移植有效降低LPS-induced肺损伤,所反映的减轻微血管渗漏和炎症反应。 然而,自噬抑制对阿里的ADSCs的保护作用有限。 基于ADSC旁分泌作用的重要作用抵抗组织损伤,我们发现自噬的影响的旁分泌作用ADSCs cocultured与LPS-treated PMVECs。 我们发现,抑制自噬ADSC VEGF的分泌减少,FGF, EGF。 我们的研究表明,自噬的抑制作用有助于ADSCs LPS-induced损伤肺微血管内皮细胞,至少部分由积极调节生长因子分泌,维持肺微血管屏障的完整性。
在LPS处理条件下,肺微血管通透性高的主要原因之一是损伤紧密连接16,17。 在目前的研究中,有限合伙人治疗抑制ZO-1和claudin-5的表达,两个重要的参与者PMVEC紧密连接复杂。 ADSC coculture部分抑制减少表达式ZO-1 claudin-5,这可能归因于ADSCs的旁分泌功能。 ADSCs旁分泌因子,特别是一些生长因子,调节已报告的完整性和功能细胞连接。 FGF-associated信号起着至关重要的作用在维持内皮adherens和紧密连接的完整性。 阻塞FGF信号解离VE-cadherin / p120-catenin复杂然后拆卸adherens紧密连接,从而诱导内皮屏障功能受损18。 另一项研究报道,IGF-I治疗显著降低脑微血管内皮细胞的通透性接触OGD再氧化19。 尽管VEGF的作用和EGF在增加内皮渗透性已经验证,FGF保持紧密连接的保护作用可能部分抵消这一现象。 在这项研究中,我们发现增加浓度的FGF coculture媒体ADSCs PMVECs。 此外,ATP是至关重要的维持内皮细胞连接的完整性20.和一些研究人员报道,一些生长因子的关键角色调解三羧酸循环活动21ATP生产,这是至关重要的。 这些发现支持的重要性ADSC旁分泌生长因子在维持内皮细胞的完整性。
内皮细胞凋亡是LPS-induced内皮细胞屏障损害的另一个重要原因。 与先前的研究一致,我们的研究结果显示,ADSC coculture减毒的细胞凋亡比例LPS-challenged PMVECs。 过度炎症反应是一个重要的细胞凋亡的诱导物。 ADSCs不仅调节一些抗炎细胞因子的表达在某些免疫细胞也分泌多种细胞因子和抗凋亡、抗炎作用,如il - 1022,23,24。 此外,一些细胞凋亡活化剂,如伯灵顿proapoptotic因素,高度,但bcl - 2或诱导骨髓白血病细胞分化蛋白(mcl1),两个著名的线粒体凋亡蛋白,抑制LPS处理下。 因此,细胞凋亡之间的不平衡发生抗病诱导剂和抑制剂诱导内皮细胞凋亡。 伯灵顿和差别的一项研究表明,对这些upregulation mcl1发现在休息或IL-8-activated中性粒细胞与msc在孵化25。 我们推断ADSCs可能调节PMVEC凋亡调停巴克斯之间的平衡和bcl - 2 LPS-challenge条件下。 进一步的研究是必要的确认的效果和机理ADSCs在bcl - 2 /伯灵顿系统LPS-induced肺微血管损伤。
干细胞的治疗效果已部分归因于生物活性旁分泌的因素。 生长因子是至关重要的效应分子ADSC旁分泌功能的组织损伤和促进恢复。 LPS-induced肺损伤过程中,过度的炎症反应最终导致PMVEC凋亡和紧密连接损伤。 VEGF是至关重要的维持内皮细胞生存和增殖。 在目前的研究中,ADSCs明显提高VEGF的浓度在中从LPS-triggered PMVECs。 一方面,ADSCs可能分泌VEGF作为旁分泌因子促进PMVEC生存和减少细胞凋亡在有限合伙人的待遇。 另一方面,ADSCs有助于促进内皮细胞自分泌VEGF,内皮细胞生存所必需的26。 此外,一些生长因子被发现抑制细胞凋亡。 增加血管内皮生长因子(VEGF)培养基阻塞LPS-induced在内皮细胞凋亡27。 补充外源性VEGF和EGF与staurosporine proapoptotic行动的人脐静脉内皮细胞的主要文化28。 除了VEGF, ADSCs已被证明蛋白质释放其他种类的增长,包括FGF, IGF和EGF的关键多种细胞生理和病理条件下生存14,29。 这些数据占改善生存率PMVECs ADSC孵化。
在目前的研究中,抑制自噬的治疗效果显著影响ADSCs LPS-triggered肺微血管内皮屏障的损害。 基于ADSC旁分泌作用的至关重要的作用在防止组织损伤,我们研究了自噬在调节ADSC分泌的作用。 在中从ADSC PMVEC coculture系统,抑制自噬的ADSCs明显下降的浓度三个重要的生长因子,VEGF, FGF, EGF,有限合伙人的条件下。 此外,在PMVECs ADSCs的保护功能,包括紧密连接的减少损伤和细胞凋亡率,自噬抑制后被削弱。 这些发现表明,自噬参与,直接或间接地调节ADSC分泌过程。 在最基本的层面上,干细胞的有效的旁分泌作用会发生只有足够数量的剧烈的干细胞被激活和动员受伤的靶器官。 干细胞被激活,动员受伤器官将不可避免地遭受同样的压力作为靶器官。 自噬是重要的过程在维持干细胞生存和活力在一定压力条件下,如缺血和缺氧30.,31。 在目前的研究中,我们检测到一种改进的自噬水平ADSCs cocultured PMVECs LPS-challenge条件下。 此外,自噬被证明在干细胞分泌有直接的监管职责。 在皮肤的伤口愈合,自噬可以扮演一个角色在促进MSC分泌VEGF调节血管化32。 抑制自噬msc TGF-β1分泌的减少,而促进pf自噬的雷帕霉素预处理引起TGF-β1 msc分泌更多33。 据报道,5和7 autophagy-related基因可能直接溶酶体与质膜融合参与溶酶体极化分泌34。 此外,自噬可能直接或间接地影响一些等离子体膜蛋白的走私通道调节本构和非传统分泌通路35。 这些数据表明,自噬可能参与从ADSCs一些细胞因子的分泌过程。 然而,在目前的研究中,我们没有描绘监管机制自噬ADSC旁分泌因素的影响,这就需要在将来的研究中进一步说明。
我们表明,有限合伙人挑战ADSCs旁分泌因子水平大大增加,这是有利于维持肺微血管屏障的完整性。 抑制自噬的旁分泌能力和保护作用减弱ADSCs维持肺微血管内皮屏障的完整性在有限合伙人的条件下。 这些结果提供新的见解的作用和机制调解ADSC LPS-induced阿里和旁分泌效应表明,自噬的调节可能是一个潜在的战略调制ADSCs在肺损伤的治疗效果。
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