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四倍体性导致acentriolar小鼠胚胎染色体不稳定

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发表时间：2019-10-24 10:46作者：武汉新启迪Xinqidi来源：www.qidibio.com

四倍体性导致acentriolar小鼠胚胎染色体不稳定

摘要

Tetraploidisation被认为是公共事件发展的染色体不稳定(CIN)癌细胞。当前模型对四倍体性驱动器CIN在哺乳动物细胞的中心粒的数量翻倍伴随基因组加倍事件导致多极纺锤体形成和染色体分离错误。利用鼠标卵裂球的不寻常的情况,缺乏中心粒,直到~ 64 -细胞阶段,我们表明,四倍体性可以开车CIN的一个完全不同的机制。四倍体的卵裂球组装双极纺锤波由微管组织中心,和多极纺锤波是罕见的。相反,kinetochore-microtubule营业额是改变,导致微管附件缺陷和后期染色体分离错误。由此产生的卵裂球成为染色体不稳定,表现出显著增加整个染色体非整倍性。我们的研究结果揭示一个意想不到的机制四倍性驱动CIN,的收购chromosomally-unstable tetraploidisation后微管动力学导致染色体分离错误。

介绍

细胞分裂是由有丝分裂和胞质分裂。在有丝分裂期间,双极纺锤体是由两个中心体,每个组成一对中心粒pericentriolar材料包围。主轴将附件姐妹染色单体的动粒微管,产生力量的染色单体分离1,2。在中期染色体排列之后,姐妹染色单体在后期被隔离。在大多数细胞,胞质分裂发生与此同时导致细胞质被分割成两个子细胞的新种族隔离的染色体3.,4。缺陷过程可以影响基因的忠诚。而在有丝分裂染色体mis-segregation会导致整个染色体的收益或损失,称为非整倍性,胞质分裂失败导致一个完全复制的基因组,称为四倍体性5,6。

重要的是,四倍体性可以引发持久染色体mis-segregation(也称为染色体不稳定; CIN),因此驱动非整倍性5,6。的确,四倍体性被认为是一个常见的踏脚石肿瘤发生和可能导致癌症的高水平的CIN5,7,8,9,10,11。具有里程碑意义的研究描述了机制支撑这一现象,在胞质分裂失败原因所产生的过剩的中心粒多极纺锤波在随后的有丝分裂。这些集群多极纺锤波可以额外的中心体形成一个双极纺锤体后期之前,但在这样做增加隔离错误的可能性和whole-chromosome异倍性9,11,12,13。这是唯一的机制是否四倍性促进CIN是未知的。

老鼠胚胎早期缺乏中心粒。而在大多数哺乳动物受精的精子提供中心粒14,在鼠标消除在卵母细胞和精子,这样最初的几个有丝分裂发生在没有完整的中心粒,和新中心粒最终制造新创~ 64 -细胞期胚胎15,16,17。这里我们利用这一极不寻常的场景来调查四倍性的影响在染色体隔离在一个acentriolar设置。通过广泛的成像方法,我们表明,生活在acentriolar老鼠胚胎,四倍体性迅速导致独立于额外中心体CIN的机制。

结果

四倍体小鼠胚胎染色体不稳定

探索四倍性的影响,我们暂时阻止了胞质分裂使用肌动蛋白depolymerising代理Latrunculin B 4-8-cell过渡,从而获得胚胎有四个双核卵裂球(无花果。1,参见“方法”)。这里我们指的是下一个细胞分裂,四个双核的卵裂球划分成为八mono-nucleated卵裂球有双细胞核的分裂,以及随后部门作为“第二个四倍体分裂”(图。1)。在一些体细胞,四倍体性导致p53-dependent细胞周期检查点,阻止进一步的细胞分裂18,19。评估四倍性在胚胎的影响,我们允许有双细胞核的胚胎体外培养和计数细胞数量12和24小时后使用fixed-cell binucleation分析。胚胎发展的双核4个阶段成为桑椹胚拥有17.9±1.15 (±SEM,nbinucleation = 23胚胎)细胞24小时后,确认没有严重阻碍细胞分裂(补充图。1 a, b)。接下来,我们使用PCNA: EGFP想象细胞周期进展20.。增殖细胞核抗原:核EGFP焦点在mid-interphase瞬变明显有双细胞核的分裂和第二个四倍体,类似于控制胚胎,象征成功的进展通过S期(补充图。1 c, d)。因此,着丝粒的数量,所观察到的着丝粒在metaphase-arrested胚胎免疫染色,在Latrunculin-treated胚胎相比翻了一番控件(补充图。1 e, f)。因此,正如前面提出的21,22,23,胚胎植入前的小鼠胚胎无法发起tetraploidy-induced细胞周期检查点和继续开发基因组翻了一番。

我们想知道四倍性的影响在胚胎染色体隔离。分析染色体隔离在生活H2B动力学:RFP-expressing胚胎双核部门透露,而82%的部门控制胚胎正常,没有明显缺陷,隔离缺陷在四倍体胚胎是很常见的,只有33%的分歧发生没有可观察到的缺陷(图。1 b, c)。胚胎也显示隔离缺陷时胞质分裂失败被诱导细胞松弛素B或Blebbistatin(补充图。2 a, b)。此外,胚胎发生有丝分裂继续存在的肌动蛋白抑制剂Latrunculin几乎没有错误(补充图。2汉英),证实肌动蛋白解聚不负面影响老鼠胚胎的染色体隔离富达,我与小鼠卵母细胞减数分裂的情况下24。在一起,这些实验确认错误是由于观察到四倍体胚胎的状态,而不是诱导四倍体性的方法。引人注目的是,第二个四倍体部门透露表型分析非常类似于双核的部门,而stage-matched控件显示一些明显的缺陷(图。1 d, e)。增加了大量的微核,染色体分离错误积累的一个标志25也观察到在固定细胞实验,排除的可能性增加的错误数量在某种程度上与生活相关成像(补充图。3.)。重要的是,染色体的倍数性分析利差在早期胚泡阶段显示68.2%的32-cell阶段控制胚胎染色体包含40,而31.8%的人染色体收益或损失(图。1 f, g),染色体数量从38岁到42(补充图。4)。相反,我们发现,只有24%的四倍体胚胎16-cell阶段保持一个完美的四倍体基因组染色体(80)(无花果。1 f, g),染色体数量从77年到83年(补充图。4 b)。综上所述这些实验显示,四倍体小鼠胚胎继续分裂,但在接下来的几个细胞分裂成为染色体不稳定。

CIN并非归因于额外中心体

在四倍体体细胞胞质分裂失败造成的,多余的中心体导致暂时性的多极纺锤波的形成,促进种族隔离错误9,11。胚胎植入前的小鼠胚胎缺乏中心粒直到~ 64 - 4细胞之间的细胞阶段,但实现主轴总成和32-cell阶段acentriolar microtubule-organising中心(MTOCs)26。因此我们打算同时观察MTOCs,纺锤波,在四倍体胚胎染色体动力学,使用CDK5RAP2: GFP27,28先生,微管蛋白29分别和H2B:招标书。在间期,大多数正常二倍体胚胎显示为一个清晰MTOC接近原子核(无花果。2; 补充图。5度和补充电影1)。核膜破裂的发病(NEBD)新的MTOC组装,这样大多数二倍体胚胎显示一个明确的CDK5RAP2: GFP-labelled MTOC在每个轴杆在中期(无花果。2; 补充图。5 d和补充电影1)16,17。类似地,在双核部门4细胞的双核胚胎通常显示一个明确的MTOC每个原子核在间期(无花果。2 b; 补充图。5 a和c; 补充的电影2)。 NEBD后不久,两个新的MTOCs通常是这样,大多数的双核组装胚胎显示四个MTOCs在有丝分裂期间(无花果。2 b和补充图。5 a, d; 补充的电影2)。有趣的是,这四个MTOCs通常形成两极的两个完全独立的双极纺锤波(无花果。2 b和补充图。5 a、b; 补充的电影2,3.)。这两个纺锤波迅速走向相互融合形成一个双主轴前后期(补充电影2,3.)。我们测量和跟踪两个纺锤波之间的角度从他们第一次建立了联系,直到他们完全融合(图。2摄氏度)。接触时,纺锤波融合一起通过滑动或旋转向对方取决于初始接触角,直到他们最终成为一个双极纺锤体(图。2 b, c; 补充图。5 a、b; 补充的电影2,3.),如Fmn2中观察到−−/小鼠卵母细胞30.,非洲爪蟾蜍提取纺锤波紧密附着31,在小鼠受精卵32。然而,特别是没有关系的初始角纺锤波相互联系和发展中染色体分离错误(图的可能性。2摄氏度)。此外,多极纺锤波等特性在体细胞与多中心粒,和与隔离错误,是罕见的在4细胞的双核(部门)的18.4%和8芯控制胚胎分裂(11.4%)。重要的是,我们使用3分钟收购的间隔,这允许我们自信区分轴融合事件和多极化。值得注意的是,即使在更极端的例子垂直主轴融合,在融合两个纺锤波保持区分没有邻近的两极连接通过微管包(补充图。5 a、b; 补充的电影3.).

接下来,我们分析了主轴动力学在第二个四倍体划分,重要的是,从一个形态正常核包含四倍体的基因组。类似于8芯和16-cell控制,这些细胞通常只拥有一个主要MTOC毗邻细胞核和第二个主要MTOC聚集在NEBD启用双极纺锤体(图的生成。2 d, e; 和补充图。5 e, f)。虽然一般主轴形态没有明显改变比二倍体控制,四倍体的卵裂球拥有更广泛的中期板,大概是由于染色体的两倍(补充图。5克,)。主轴部件是否则形态区别二倍体或16-cell为胚胎,尽管显著增加隔离错误(无花果。1 d, e)、多极纺锤波的又非常罕见(16-cell控制:9.6%的部门; 四倍体为:16.6%的部门)。综上所述,这些观察结果显示,CIN中观察到四倍体小鼠胚胎不能归咎于多余的中心粒或多极纺锤波。

纺锤体组装检查点(SAC)不是废除四倍体性

拥有大部分细胞信号通路称为囊,防止染色体分离错误通过推迟后期直到所有染色体是一致的中期板和动粒微管33,34。值得注意的是,最近的研究表明,在早期胚胎,尽管偏差/着丝粒染色体也招募囊蛋白质,如Mad1 Mad2,囊信号不够有力执行中期逮捕35,36,37。我们想知道是否错误的更高的利率四倍体胚胎可能归因于囊的进一步削弱,因此在四倍体胚胎囊着手调查活动。值得注意的是,四倍体性长时间的有丝分裂,增加NEBD-anaphase观察到持续时间(图。3 a, b),这表明囊激活。囊抑制使用Mps1抑制剂阿兹3146年减少的持续时间有丝分裂导致控制和四倍体有一个类似的有丝分裂期持续时间,表明长期的有丝分裂的四倍体可归因于囊(无花果。3 a, b)。囊蛋白免疫荧光分析Mad2透露,大部分的着丝粒表现出明显Mad2染色后不久NEBD失去了作为染色体排列,类似于控制(图。3汉英)。同样,生活共同表达H2B的四倍体胚胎的成像:RFP和MAD1:2EGFP清楚显示MAD1:2EGFP招聘NEBD后不久,着丝粒和逐渐失去信号30 - 40分钟内染色体中期板(图一致。3 f, g)。在正常二倍体小鼠胚胎一样36,四倍体的卵裂球经常未能等到全部染色体排列在后期出现之前,突显出之前报道效率低下的囊鼠胚胎(补充图。6)。尽管如此,四倍体性引起了大量的有丝分裂SAC-dependent延长。因此,尽管我们不能排除这种可能性小的影响四倍性囊,我们的实验没有发现明显削弱囊的四倍体可能解释种族隔离的高速率的错误。

四倍体性扰乱中期染色体排列

进一步研究如何四倍性导致落后染色体和染色体分离错误,我们进行有丝分裂的着丝粒时空行为的综合分析。胚胎共同表达H2B: RFP,着丝点标签MajSatTALE: mClover38在三维成像在75年代间隔,和每一个着丝点对跟踪在第二次四倍体。我们的分析显示,着丝粒速度没有区别后期开始之前或在后期染色体向极运动(无花果。4 a、b),或者紧张的中期板(图4 c, d),表明总体上大多数染色体的行为不是在四倍体的不利影响。然而,有趣的是,我们观察到控制和四倍体的卵裂球显示染色体,先前被对齐,流离失所的中期板成为对齐(无花果。4 e)。在控制,这些位移事件持续了平均6.32±1.43分钟(n= 16位移事件; 无花果。4 h)在此期间着丝粒通常在1.7和10.74之间移动µm中期板,然后返回完整的对齐。重要的是,在控制卵裂球,染色体成为流离失所的中期板回到完全对齐前后期出现在几乎所有的情况下(图。4 e, f和h)。另一方面,在四倍体胚胎染色体位移事件大幅持续时间更长(13.57±2.11分钟,n= 14位移事件),在很多情况下染色体未能完全重新排列前后期发作(无花果。4 e, g, h)。偏差的染色体在四倍体胚胎后期开始观察,几乎所有导致染色体,以前一致,成为中期期间流离失所。符合我们之前的结果,大部分的四倍体胚胎显示落后染色体。重要的是,所有后期落后者源于先前metaphase-aligned染色体,显示的高频率滞后染色体在四倍体胚胎不是归因于没有对齐(补充图。7).

综上所述,这些研究结果表明,虽然整体染色体着丝粒行为和congression在四倍体胚胎在很大程度上是不变的,缺乏在维持染色体排列导致在后期染色体错位的可能性增加。然而,这些偏差染色体似乎并没有四倍体胚胎的染色体滞后的主要原因。相反,类似于体细胞39和癌症细胞40落后染色体来自染色体正确对齐的中期板前后期出现。

四倍性影响动粒微管

在纺锤体组装一些merotelic附件中着丝粒对形式单一的着丝粒同时接触微管(MTs)从两个纺锤体两极。建立正确的(amphitelic)染色体附件修正前后期发生的以前mis-attached着丝粒,这一过程取决于在着丝粒太营业额41,42。在癌细胞,CIN与减少kinetochore-microtubule(国民党)营业额,促进错误包括merotelic附件导致落后染色体非整倍性43。我们直接分析国民党营业额在第二次四倍体的部门使用荧光耗散光活化后photoactivatable-GFP-tubulin (PAGFP-tubulin)在中期纺锤形如前所述43,44,45先生,使用微管蛋白选择面向细胞纺锤波的平面成像(无花果。5 a - c)。引人注目的是,国民党半衰期是大幅增加四倍体胚胎相比,控制(图。5 a - c),表明国民党营业额下降。值得注意的是,这种增加类似于观察到当比较染色体不稳定和体细胞染色体稳定43。 Non-kinetochore太半衰期的速度向极微管与PAGFP-tubulin通量测量,以及微管的速度增长事件由EB1: EGFP成像,四倍体和控制之间都保持不变(补充图。8 a e),显示太动力学的变化是国民党营业额非常具体。重要的是,在太营业额比较没有差别与先生Tubulin-free卵裂球Tubulin-stained卵裂球,排除的可能性增加,国民党半衰期在四倍体胚胎可能是引起MT-stabilising的潜在影响微管蛋白爵士(补充图。8 f-h)。高度符合国民党营业额缺陷,直接比较稳定的国民党附件在胚胎经典冷休克方法显示更大比例的mis-attachments四倍体胚胎比控制在中后期前中期/中期(无花果。5 d, e)。而横向/ merotelic附件在二倍体卵裂球非常罕见(0.9%),7%的附件中观察到四倍体misattached卵裂球,至少一个着丝粒在每个misattached四倍体胚叶细胞检查。这是高度一致认为一个merotelically附加着丝粒足以引起missegregation39和相关利率升高滞后染色体观察到四倍体(无花果。1中).

能力维护着丝粒的主要决定因素太正确misattachments营业额是招聘的微管depolymerising蛋白质有丝分裂centromere-associated驱动蛋白(MCAK)46,47。我们想知道MCAK是否足够招募了着丝粒/着丝粒在四倍体胚胎。用免疫荧光我们发现MCAK明显弱势在四倍体胚胎的着丝粒相比控制(图。5 f, g)。这表明,减少太营业额可能无法招募足够的下游MT-turnover-sustaining因素。符合这个概念,超表达MCAK: GFP显著和显著降低利率四倍体胚胎的染色体分离错误相比,四倍体胚胎表达GFP(图。5 h,我),也一直在癌细胞ectopically表达MCAK48。综合这些数据表明,在四倍体胚胎,国民党营业额减少抑制和纠错机制,允许merotelic附件的积累,进而导致落后染色体,可以通过引入异位MCAK获救:GFP。

讨论

我们的数据表明,小鼠胚胎不拥有四倍性检查点但继续分裂,成为染色体不稳定后立即tetraploidisation(无花果。1)。为什么老鼠胚胎未能山四倍性检查点的关键作用尚不清楚,但可能与中心粒在检查站调停,RPE1所示细胞19。四倍体性的描述机制导致CIN在哺乳动物细胞收购额外中心粒/中心体导致危险的形成多极纺锤波,从而诱导隔离错误5,7,9,11。可能有其他手段四倍性可能导致CIN中提到四倍体的研究酵母与正常中心体数字,在CIN可能是因为在主轴几何单元尺寸的影响49。在这里,我们表明,老鼠卵裂球,acentriolar,变得高度染色体不稳定在tetraploidisation由于国民党动力学改变。值得注意的是,这种机制是不同的酵母,四倍体的纺锤波改变微管动力学49。 MCAK我们的数据表明,着丝粒减少招聘,一个特征明显太depolymerising驱动蛋白,为减少提供至少部分解释着丝粒太营业额支撑misattachments和四倍体的卵裂球隔离错误。为什么MCAK弱势的着丝粒还有待确定。有多余的染色体基因表达变化相关50,着丝粒的两倍,可以招募MCAK呈现一个过重的负担能力。另外,四倍体性可能会影响上游信号MCAK所需招聘的着丝粒51,52,或影响着丝粒的结构本身。

我们的着丝粒和染色体跟踪数据显示,四倍体性引入了两种类型的后期的缺陷。首先,我们观察到后期染色体滞后,源自完全一致中期染色体,并且经常导致微核。而在体细胞微核来自落后染色体经常吸收在接下来的细胞周期,这可能形成chromothripsis机械的依据53,我们先前已经表明,在小鼠胚胎微核是很少融入主核和重复的微核继承必然推动非整倍性25。值得注意的是,微核也单方面继承在四倍体胚胎(补充图。9),因此落后染色体似乎肯定会导致老鼠四倍体胚胎马赛克异倍性。其次,我们观察到染色体不能对齐在后期出现。在某些情况下,的距离偏差染色体中期板,配上成像分辨率限制阻止我们决定这两个姐妹染色单体是最终正确的隔离。然而,在至少一个例子,我们标记染色体的着丝粒住成像,两个偏差姐妹染色单体被迁移到相同的轴杆(补充图。7)。因此,尽管正式区分这两个不同的缺陷的比例贡献非整倍体胚胎实验的挑战,都可能导致非整倍性的提升速度的四倍体胚胎。

四倍性是常见的肿瘤发生的早期阶段,并可能导致CIN和非整倍性与某些癌症有关5,6,7,8,9,54。基因组加倍被认为收购CIN提供一个宽松的环境,如染色体损失更容易容忍与多个染色体拷贝54。重要的是,我们的数据不反对认为中心体加倍可以CIN的主要因素,而是添加改变微管动力学作为一种独特的机制,也可以赋予tetraploidisation后立即CIN。在四倍体体细胞,额外的中心粒丢失后重复段落9,55,还有待观察是否有类似的适应与微管动力学可能发生。然而我们的数据添加修改太动力学额外中心体作为两个单独的缺陷,出现迅速开车CIN tetraploidisation后在第一个细胞周期。

方法

胚胎培养和显微镜下注射

按照指南的所有实验动物实验的拉西Institutionnel de保护des Animaux (CIPA)。所有实验中心de说是研究中心批准Hospitaliaire de因为学校蒙特利尔(CRCHUM)拉西Institutionnel de保护des Animaux (CIPA)。协议编号:IP18034GFs。胚胎是从超数排卵CD1雌性老鼠(Crl: CD1 (ICR)查尔斯河实验室)和CD1雄鼠交配时,核自组织映射聚类中(EmbryoMax和培养®表示; 微孔,先生- 020 p - 5 - f) 5%股份有限公司2在37°C。信使rna制造使用Ambion mMessage机T3 (AM1348)或T7 (AM1344)根据制造商的指示。质粒是H2B: RFP pRN4(亚历克斯·麦克杜格尔的礼物),PCNA: EGFP在pcDNA3.1 +聚(A) (Kazuo山形的礼物),CDK5RAP2: GFP在pGEMHE(礼物Tomoya Kitajima),α-tubulin-human: PAGFP在pIRESHyg2 (Addgene,质粒# 12296),EB1: EGFP在pcDNA3.1 +聚(A) (Lynne Cassimeris的礼物),在pIVT MAD1:2EGFP (Michael兰普森礼物),MajSatTALE: mClover在pTALYM3 (Addgene,质粒# 47878)和MCAK: GFP(从Addgene购买pEGFP-C1向量,# pYOY152和subcloned pcDNA.3.1 / myc-His (-))。两个胚胎microinjected使用picopump(世界精密仪器)和显微操纵器(Narishige)安装在徕卡DMI4000倒置显微镜45。在图的实验。3 f,胚胎microinjected 4细胞阶段。实验在无花果。3.g和5 h,胚胎microinjected晚4细胞的双核阶段(相当于8阶段)。

药物治疗

诱导binucleation,相间4细胞期胚胎后期(~ 64 h post-hCG)治疗~ 10 h Latrunculin B(5µM; EMD微孔,428020)。胚胎没有显示四个卵裂球两个可见核年底潜伏期被排除在外。同时,控制胚胎处理1:1000 DMSO(西格玛奥德里奇,D2650)。潜伏期后,核自组织映射聚类媒体胚胎被彻底清洗和培养。实验的补充图。2 a, b细胞松弛素B(5µg /毫升; Sigma-Aldrich C6762)或Blebbistatin(100µM; Calbiochem /微孔,203391)被用来诱导binucleation。补充实验无花果。1 e, f,5克,; 无花果。1f, g;5 f, g,胚胎处理25µM 132毫克(Calbiochem 474790)诱导中期被捕。着丝粒计算的补充图。1 e, f中期被捕后,胚胎治疗200µM Monastrol (Calbiochem, 475879)诱导单极纺锤体的形成,并允许更好的可视化个人着丝粒。囊抑制治疗在无花果。3 a, b,胚胎live-imaged 3146年阿兹的存在(Calbiochem,目录# 531976)。实验涉及PAGFP:微管蛋白实时成像,胚胎在中期使用100µM APCin被捕(Tocris, 5747)。光漂白控制实验中,信息产业部鸡蛋被live-imaged存在10µM紫杉醇(紫杉醇; 西格玛奥德里奇,T402)。轴标签在活胚胎进行2 h孵化先生在300纳米微管蛋白(细胞骨架Inc .)、CY-SC002)。实验的补充图。8 f-h,胚胎暴露于1µM先生DNA(细胞骨架Inc . CY-SC007)仅为3 h或300海里的先生微管蛋白2 h后3 h先生接触1µM DNA。

染色体的利差

使用一个用电吹风方法染色体进行传播56。中期逮捕32-cell二倍体和16-cell四倍体胚胎暴露于1%柠檬酸钠为15分钟,随后转移到舒服的幻灯片。三滴甲醇:乙酸(3:1)直接应用在胚胎和幻灯片被风干。染色,风干幻灯片与赫斯特33342年co-labelled(西格玛奥德里奇,H6024 1:50 0)和DRAQ5(热费希尔科学,62254,摘要)装载在FluorSave™试剂(Calbiochem, 345789)为了不同标签染色体着丝粒区域。

冷休克疗法

评价国民党附件的图。5 d, eH2B: RFP-expressing胚胎暴露于10分钟冷休克疗法在冰冷的M2媒体(西格玛奥德里奇M7167) 35分钟后观察NEBD实时成像,然后立即修复。

免疫荧光和实时成像

胚胎和4%多聚甲醛固定(PFA) PBS 40分钟紧随其后10分钟透化作用在PBS使用0.25% Triton X,和阻止3%牛血清白蛋白(BSA)在PBS57。波峰抗体在哪里使用,胚胎被固定为2% PFA在PBS 30分钟。 MAD2抗体在哪里使用,胚胎与PBS PFA 2%固定15分钟。主要抗体使用:波峰反(礼物马文j . fritzl 1:10 0),β-tubulin anti-mouse(西格玛奥德里奇目录# T4026 1:1000), MCAK anti-rabbit (Duane康普顿的礼物; 1:1000),pericentrin anti-mouse (BD生物科学目录# 611814 1:50 0),α-tubulin anti-rabbit (Abcam目录# AB18251 1:1000)和MAD2 anti-rabbit (Biolegend目录# 924601; 施用)。赫斯特33342(1:1000)用于DNA标签。 Alexa-labelled二级抗体(1:1000)从ThermoFisher购买。

Alexa萤石®555年Phalloidin-conjugated抗体(1:200)从英杰公司购买(A34055)。免疫荧光成像进行一个徕卡SP8共焦显微镜配备了一个63×1.4石油客观数值孔径或莱卡SP5共焦显微镜配备了一个100×1.4数值孔径石油客观和海德拉巴探测器。活细胞成像和FDAP进行莱卡SP8共焦显微镜装有20×0.75数值孔径空中目标和海德拉巴探测器和胚胎核自组织映射聚类媒体,成像在放置在加热阶段前孵化器有限公司为5%2供应37°C。现场成像实验进行补充图。1,胚胎在蔡司成像Axio观察者,配有Axiocam Apotome和20×0.8数值孔径空气客观和LED灯。 EB1: EGFP实时成像,胚胎成像每2.578年代2分钟63×1.4石油客观数值孔径。实时成像的紫杉醇(光漂白的存在控制在无花果。5 a - c)或Latrunculin(补充图。2 c, d),胚胎活成像在Ibidi micro-insert井安装在玻璃盘与蒸馏水和设置被修改为适当的有限公司2供应58。

荧光耗散光活化后

光敏化是由短暂暴露利益定义矩形区域定位在中期纺锤体的一侧405 nm激光。实时成像是在30年代间隔15分钟。荧光衰减曲线和半衰期分析,测量每个胚叶细胞的荧光强度衰减的绘制与时间和拼装成双指数曲线f(t)=一个×exp (−k1t)+B×exp (−k2t使用MATLAB cftool。43,59,60。在这个方程,t代表时间;一个,non-kMTs越不稳定;B,国民党和稳定k1和k2代表的衰减率一个和B,分别。每个太人口计算的半衰期ln 2 /k。光漂白是纠正每个测量的成像信息产业部蛋暴露于10µM MT-stabilising代理紫杉醇,那里太营业额是最小的。向极通量计算速度是通过确定主轴上的荧光标记之间的距离在每个时间点和相应的轴杆45,60。

成像分析和统计

所有的图像处理和分析使用ImageJ /斐济61。没有阈值或屏蔽应用于图像和附近地区亮度线性变化。着丝粒跟踪在无花果。4 a、b、手动执行跟踪使用“TrackMate手动跟踪”功能的TrackMate插件62在斐济。无花果的中期板宽度测量。4 c, d,两条线之间的距离在每一方的中期板测量。行了基于MajSatTALE: mClover荧光信号和分隔的区域被对齐的染色体。三维重建(补充图。5 b; 补充的电影1- - - - - -3.)和表面呈现(补充图。5 b和补充电影3.9.3)生成使用伊万里瓷器。在无花果MCAK荧光强度分析。5 f, g,background-subtracted荧光强度值从100动粒分析从10胚胎(每组10动粒/胚胎),统计分析了作为inter-embryo使用每个胚胎的平均荧光强度比较。所有测量分析在这项研究来自不同样本和样本不重复测量。数据分析使用GraphPad棱镜7软件(GraphPad软件、拉霍亚CA、美国、www.graphpad.com)。 Shapiro-Wilk正常测试应用在适当的和未配对的双尾t测试或双尾Mann-Whitney测试应用。统计学意义是考虑P< 0.05。