阿霉素，雌二醇和肿瘤坏死因子α联合治疗乳腺癌衍生细胞系的调控串扰
ESR1网络监管提出了一种新的模型分析的基础上阿霉素,雌二醇,TNFαMCF-7联合治疗。 我们使用阿霉素治疗代理,TNFα标记和中介炎症微环境和17β-estradiol (E2)作为雌激素受体的激动剂,hormone-driven乳腺癌的诱发因素,其药理抑制降低乳腺癌复发的风险。 基于转录组分析的结果,我们发现71个差异表达基因的特定组合治疗阿霉素+雌二醇+ TNFα相比,单引号或双治疗。 三重治疗的反应被qPCR检查7基因,其中6例验证,然后扩展到四个额外的细胞株不同p53和/或状态。 微分调节浓缩分析的结果突出ESR1网络的作用,其中包括36 71具体差异表达基因。 我们建议联合激活p53和NF-kB转录因子显著影响ligand-dependent, ER-driven转录反应,也ESR1基因本身。 这些结果提供了一个模型的协调互动TFs解释阿霉素,E2和TNFα诱导压迫机制。
癌细胞进行控制的扩散和基因组不稳定由于正常细胞的诱导或抑制的监管机制1。 研究基因表达谱造成signal-activated转录因子之间的相互作用是一种有效的方法,更好地理解复杂的、不稳定的和适应基因调控网络系统的癌症细胞2。 在这项研究中,我们比较下MCF-7细胞的转录组与阿霉素联合治疗,17β-estradiol (E2)和TNFα用单引号或双治疗。 阿霉素,一线化疗剂,通过DNA损伤反应促进p53的活动,这是与细胞周期阻滞和细胞程序性死亡3.,4。 雌二醇是雌激素受体的激动剂配体(呃,主要由ESR1 ERα编码基因,而且ERβESR2编码的基因,和更难以捉摸的Estrogen-related受体犯错误),并促进癌细胞的扩散3.。 雌激素和孕激素受体表达增加的癌症细胞可以促进肿瘤细胞的生长和存活。 多动症的ER可以减少监管机制的有效性镇压ESR1表达式作为hormone-driven乳腺癌的诱发因素5,6,7,8。 TNFα是一个重要的炎性细胞因子可以调节细胞毒性和增长促进乳腺癌的影响9,10。 一些研究表明,双治疗MCF-7 TNFα和E2有敌对的影响细胞增殖和生存11,12。 虽然TNFα的抑制效应的分子机制在雌激素MCF-7扩散不是很好理解,发表的两项研究已经提供了一些线索:(1)下调ESR1通过PI3K / AKT信号引入E2-mediated细胞增殖的抑制机制MCF-7 TNFα11; (2)p53野生型和p53-mutated MCF-7细胞雌激素和TNFα治疗的反应不同1。 然而,报告不同,TNFα和其他细胞因子被激活,独立于E2配体的存在13,14。 例如,TNFα影响ER适配器激活的蛋白质TAB2 NCoR / SMRT辅阻遏物,呃,和引发损失的抗增殖反应15。 在先前的研究中,我们分析了不同监管之间的交互途径,以应对与阿霉素+ TNFαMCF-7的双重治疗,DT)或阿霉素+ E2 (DE),识别和报告的添加剂和增效基因表达调制2,16,17。 在这项研究中,我们关注的是合并后的三重治疗阿霉素+ TNFα+ E2 (DTE)相比,单引号或双治疗。 我们使用基于网络的功能分析转录组配置文件来识别组合治疗的细胞的影响,预计将导致p53的激活,呃,NF-kB转录因子。 功能分析的差异表达基因转录组数据通常是由浓缩(度)预定义的参考基因集指标不同的生物过程18。 了解监管机制运作基因表达的改变,基因调控推理方法构建基于网络监管度之间的交互19。 其他算法使用先验知识分子之间的相互作用,例如,基于PPI网络20.。 我们开发了一个工具NASFinder网络拓扑和功能分析与组学数据21。NASFinder是一个两步过程:(1)它测试一个完整的通用网络识别重要的子网与它们相关的拓扑结构和转录因子与度的表达式; (2)它在功能上分析了确定子网和排名的表达式褶皱的大小变化通过使用网络活动评分指数(NAS -请查看方法部分)的精确定义。 我们使用这个方法来理解监管机制运作基因表达的变化由于同时联合治疗导致激活p53、ER和NF-kB MCF-7乳腺癌细胞系的转录因子。
本研究的主要结果是一个新的模型,ESR1网络镇压独家MCF-7响应的基因表达程序组合与阿霉素治疗,TNFα和E2。 此外,我们研究了关键调控分子和模块集成网络的差异表达基因,作为癌症治疗的潜在目标。 实验设置和转录组数据中详细介绍了我们两个以前的研究集中于之间的串扰阿霉素+ E2或阿霉素+ TNFα之间2,17。
MCF-7细胞1.5μM阿霉素治疗,10−9 米E2和5 ng / ml TNFα和总RNA提取10小时后处理。 全球进行了基因表达分析中描述17。 所有数据都存放在地理(GSE24065和GSE50650)。 筛选差异表达基因在6条件(单并与阿霉素联合治疗、雌二醇和TNFα)表示独家度在不同的条件下,称为上下文相关的度(CS-DEGs)(无花果1和2)(补充文件1)。 数量和表达模式(或衰减)的差异表达基因数据集包括异构(补充文件1)。 监督多变量分析(PLS-DA)为了集群组执行度。 PLS-DA模型配备6组件和样本投影到由前两个组件张成的子空间。 从PLS-DA情节,我们观察到一个清晰的分离的单,双,三联体治疗(图。1 b)。 这些结果表明,度的表达模式以应对不同的治疗方法是不同的。 因此,它是推测CS-DEGs可能被视为关键调控分子对阿霉素,TNFα,雌激素暴露。
差异表达基因的分布(度)和上下文相关的差异表达基因(cs-DEGs)六项研究与治疗相关的MCF-7乳腺癌细胞系。 (一个)情节代表度的频率和CS-DEGs的治疗。 CS-DEGs被数的提取基于成对比较阿霉素+ E2 (10−9米),阿霉素+ E2 (10−9米)+ TNFα,阿霉素+ TNFα,阿霉素和E2 (10−9米)。B)聚类的样本使用PLS-DA度的矩阵表达式。 信心椭圆为每个集群突出强度的歧视(置信度95.4%)。
列表和表达模式的上下文相关的度在转录组的MCF-7细胞系的Doxo + TNFα+ E2治疗相比,单引号和双治疗。 褶皱的负价值变化意味着下调和积极的值表示上调。
网络分析的三重治疗的影响,上下文相关的列表度下的有源网络通路被用于识别受体的监管控制。 主动网络根据网络活动成绩排名(NAS)和44例联合治疗显著假定值(< 0.0001)相比,单引号或双治疗(补充文件2)。 细节和参数用于此分析方法中所描述的部分。 CS-DEGs编码细胞骨架,免疫系统,如预期和跨膜运输蛋白,并代表潜在的信号转导标记在乳腺癌治疗药物反应。 网络相关的细胞死亡、增殖和细胞内信号转导丰富组织(图中是很常见的。3.)。 激活网络应对TNFα治疗是重要的细胞凋亡的调节下雄激素受体(AR)和双治疗阿霉素+ TNFα顶部结果转向信号响应细胞周期进程(无花果。3.)。 正如所料,NAS得分高的网络监管的回应与阿霉素和雌二醇治疗细胞凋亡的阿霉素和雌二醇的反应,分别。 阿霉素+ E2治疗诱导相关的通路调节细胞增殖(无花果。3.).NASFinder确定26监管网络通路(调整假定值≤0.05)对阿霉素治疗相结合,雌二醇,TNFα主要与细胞周期和相关流程(图3.)(补充文件2)。 发现ESR1是上下文相关的调节模块度的三重治疗(补充文件2)。 这些发现表明,CS-DEGs响应中发挥重要作用的乳腺癌的治疗方法。 在接下来的步骤中,我们结合这些拓扑信息和功能的发现与上下文相关的表达模式的度研究的影响的分子机制阿霉素+ TNFα+ E2治疗细胞过程。
活跃的网络响应不同化疗药物的治疗。 丰富通路通过上下文相关的基因集富集分析每个数据集度。通路上下文相关的注释度获得NASFinder。 颜色尺度网络活动分数成正比(NAS)值。 NAS认为选择的细胞过程的影响在实验环境。 Doxo和E2是阿霉素和17β-estradiol 10的缩写−9 米分别为(补充文件2).
网络的拓扑路径构造使用NASFinder上下文相关的集度的阿霉素+ TNFα+ E2治疗相结合。 综合网络丰富基因337(58抑制性和279激活)的交互形成186度包括36间CS-DEGs(无花果。4)(补充文件3.)。 网络的节点度分布具有无标度拓扑(R2= 0.843),显示中心的存在22。 节点的中心通过网络是化验和信息流ESR1收到中心高分数的上下文相关的差异表达基因(压力中心= 6851,中间性中心= 0.105),紧随其后TP53和HIF-1(补充文件3.)。 基于大部分的衰减模式(43 71)CS-DEGs,和down-modulation ESR1记录本身(褶皱变化三重治疗=−1.6,p < 0.0001),我们假设与阿霉素和TNFα相关的交互反应诱导ligand-dependent ER-mediated压迫机制(图。2)。 一个反馈回路,ER可以压制自己的转录之前提出,据报道,ER可以调节目标基因的转录镇压,虽然在很大程度上仍难以捉摸的机制23。 分析差异表达基因的褶皱变化之间的相关性之间的双重和三重治疗还显示更多的衰减度之间的差异(图。5)。 多元线性模型回归指定阿霉素+ TNFα和阿霉素+ E2作为阿霉素+ TNFα+ E2的重要预测因子,方差分析模型介绍了阿霉素+ E2作为主要组件以适应模型(f值= 12771,p值< 0.0001)。 接下来,我们分析了CS-DEGs在正常乳腺组织的表达模式。 平均归一化表达的基因显示跨基因上调表达的主导模式(无花果。6)(补充文件4)。 浓缩在度分析表明,CS-DEGs的三重治疗明显针对正常乳腺组织和丰富基因过表达(差异)(补充文件4)(图。6)。 这些结果强调CS-DEGs的显著抑制表达式模式之间的联系和联合治疗。 尽管实验使用协议,同时介绍了联合治疗和检查产生的转录变化在稳定状态,即在一个相对较晚的时间点,预计每个代理可能扰乱细胞转录组具有不同的动力学。 特别是,E2-mediated反应可以更快速而Doxorubicin-driven p53激活。 鉴于ER的浓缩目标在71度独有的三重治疗,因此,这些发现表明参与镇压的监管机制的组合三重治疗。
综合网络丰富基因相关与阿霉素联合治疗MCF-7, TNFα和E2。 分子的中心通过网络信息流是基于中间性中心索引。 较低的节点介数值有av小圆和明亮的颜色。 边的高亮度的色彩呈现低边中间状态值。 网络的节点度分布符合幂律22。
广义双块常见的褶皱变化之间的相关性不同调控基因的两倍和三倍与阿霉素治疗,雌二醇和TNFα。 下调基因主要调解MCF-7应对阿霉素/雌二醇/ TNFα联合治疗。
浓缩度集condition-specific分析差异表达基因(CS-DEGs)与GTEx一般组织类型包括乳腺癌基因集。 浓缩度集分析表示,上调的主要表达式模式CS-DEGs在正常乳腺组织,并下调是一种特定的后果三与阿霉素治疗,雌二醇和TNFα。 (一个)富集分析CS-DEGs和GTEx一般组织类型基因集。 极大地丰富度集(Pvalue≤0.05和日志褶皱变化≥0.58)以红色突出显示。 表达式的值显示正常组织的平均表达基于GTEx数据库。 (B)基因表达热CS-DEGs地图。 表达式值的热图显示平均归一化表达的基因(零意味着跨样本)在正常组织基于GTEx(版本6)数据库。
我们选择7个基因进行验证qPCR(无花果。7 a、B)。 5 mammary-gland-derived细胞株不同p53和/或ERα状态进行了测试,比较阿霉素+ TNFα+ E2三重治疗(DTE) E2 (E)治疗。循环流化床,CXCL12,CXCL14选为高度上调丰富基因主要参与免疫反应的调节24,25。 循环流化床在所有的细胞系表达明显上调,因此独立于p53和ER的地位。 CXCL12由终端设备确认为诱导治疗,尤其是当p53功能是维护(MCF-7, zr - 75 - 1和MCF10A p53野生型,无花果。7一个)。 相反,我们无法证实的感应CXCL14在MCF-7虽然其他四个细胞系的基因表达显著上调,特别是MCF10A。 下调的基因包括RNF43,SSBP2、ΔN-p63 ESR1(无花果。7 b)。 RNF43确认压抑的三重治疗MCF-7这结果是扩展到所有其他的蜂窝系统除了zr - 75 - 1。 只在T47D SSBP2反而有点压抑。 ΔN-p63又强烈压抑,除了zr - 75 - 1。 镇压的ER确认三个ER阳性细胞株在RNA(图。7 b(图)和蛋白质水平。7 c)。 然而,减少不明显在高度ERα积极zr - 75 - 1细胞。 免疫印迹证实了稳定p53野生型p53的MCF-7, MCF10A, zf - 75 - 1细胞反应的治疗资料。 p21在所有的细胞系诱导,尽管在低得多的程度上在p53突变细胞,如预期。 ΔN-p63的镇压是证实蛋白质含量在T47D MCF10A和部分也。 蛋白质是不容易检测由于低丰度在其他细胞系,一致的水平相对较低的内生成绩单,衡量qPCR(没有显示)。
基因表达数据的验证qPCR和免疫印迹。 所选的细胞系p53和/或ERα地位不同,所述部分的方法。 qPCR结果表明基因和五个细胞系的小组,由变化的方向观察到的微阵列实验:(一个)差异,(B)抑制。 平均褶皱变化的情节对阿霉素+ TNFα+ E2 (DTE)治疗相比,E2(设置为1,虚线)。 误差线画出两个生物复制的标准偏差。 (* p < 0.01; * * p < 0.05,学生学习任务)。 GAPDH基因和YWHAZ用作参考。 (C)免疫印迹显示的相对表达p63 ERαp53、p21在各种细胞系的影响测试和阿霉素+ TNFα+ E2 (DTE)治疗。 Alpha-Actinin被用作加载控制。 整个屁股给出补充图。1。 提出了两种生物进行了复制,获得类似的结果。 看到信息的方法部分治疗条件。
我们表明,组合激活p53, NF-kB和ER在MCF-7转录因子诱导排斥基因表达程序。 我们报告三阿霉素治疗,TNFα,E2导致大幅下降的表达ESR1相比单引号和双治疗。 监管网络控制ESR1显示其下调p53的含义和免疫反应通路。 阐明在回应的差异表达基因的影响同时激活p53, NF-kB ER转录因子,转录组分析完成NASFinderomics-driven数据分析工具的功能模块用于转录组的分析资料21。 功能富集分析显示不同调节基因的激活p53, NF-kB和ER主要导致网络通路与细胞凋亡有关的规定,免疫反应和基底转录因子。 的验证循环流化床,CXCL12,CXCL14差异基因在应对终端设备治疗表明炎症反应的激活,在CXCL12可以直接依赖于p53激活。 在抑制基因我们验证RNF43和TP63。RNF43是负的WNT信号调节器吗24,25及其下调最近与增强扩散和增长25。TP63p53-related转录因子的影响可能不同亚型的表达相对水平26。 我们确认ΔN-p63压抑了三重治疗在大多数细胞模型测试,至少qPCR。 相反,TA-p63似乎并未调制的联合治疗至少在MCF-7细胞(数据未显示)。 这表明p63肿瘤抑制功能可以通过三重刺激治疗和可能参与剩余感应p21的表达。 我们也证实了下调ESR1应对三重治疗由qPCR和免疫印迹。 一致,我们的转录组数据显示,联合治疗,尤其是三重治疗阿霉素+ TNFα+ E2强烈减少的输出E2治疗MCF7细胞(补充图。2)。 的比较单一的监管作用,双重和三重治疗化合物确定了上下文相关的差异表达基因。 我们构建了综合监管网络的阿霉素+ TNFα+ E2治疗获得更多的了解丰富独家度网络通路。 结果提出了一个重要的角色ESR1作为监管至关重要的独家差异表达基因TP53下游和ER通路。 先前的研究显示,E2对p53 TNFα细胞定位和细胞的敏感性1,11,27。 治疗与E2 MCF-7 p53的转录因子活性降低运输到细胞质中,随后,减少敏感TNFα诱导肿瘤抑制效果28。 总之,这些发现表明,阿霉素的联合治疗,E2和TNFα可能参与减少的表达和活性ESR1,有可能提高雌激素受体阳性乳腺癌的化疗疗效。 阿霉素的影响可以调制的雌二醇水平,能使用他莫昔芬和水平的免疫细胞渗透导致TNFα释放。
完整的转录组数据可通过地理数据库在NCBI GSE24065和GSE50650加入数字。 阿霉素的分析/ TNFα和阿霉素/ E2治疗报告2,17在这项研究中,我们关注MCF-7人类乳腺癌的综合治疗与阿霉素cancer-derived细胞系,E2和TNFα相比,单引号或双治疗。
我们应用安捷伦设计026652号注释数据(芯片HsAgilentDesign026652) R对象映射和制造商之间的基因符号标识符。 度被选应用基于秩统计检验产品通过使用RankProd Bioconductor包(pfp < 0.05,绝对log2褶皱变化> 2)29。 每一个治疗相比,模拟上下文。
我们应用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)集群的六个治疗类,因为它更好的性能比一个无监督主成分分析30.。 的分类性能PLS-DA模型评估使用5倍交叉验证与十个组件(重复10次)。 的性能结果,我们选择6组件符合最终的模型。
我们使用了COSBINASFinder转录组数据的拓扑和功能分析的工具21。 的过程NASFinder之前达到结果如下(图。8):输入:输入变量是一个差异表达基因列表,fold-difference表达水平,功能相关的基因集的列表。NASFinder利用定向和un-weighted交互网络的拓扑和受体在这个网络的列表作为常数输入。NASFinder同时访问的存储库交互数据集改善背景的网络和存储库的完整性参考路径功能分析(MSigDB 6.2中,所有的基因集)31。 处理:首先,NASFinder网络上的背景地图感兴趣的分子,然后遍历网络从受体(源节点)。 它一个信息基于理论的方法适用于计算的重量边缘的强度之间的关系感兴趣的分子。 在下一步中,该算法识别受体与最高水平的相关分子的兴趣。 作为结果,它提供了一个子包括最短路径连接感兴趣的分子受体。 最后,李子选择感兴趣的受体和分子之间的子网络,应用网络活动的功能分析和计算分数。 输出:输出主要有拓扑连接分子感兴趣的主要监管机构,浓缩的结果分析和网络活动得分(NAS)。 NAS描述不同监管网络的通路的影响实验背景下基于差异表达基因的数量选择的参考途径,意思是规范化的褶皱变化,选择大小的参考途径21。
基于网络的基因集富集分析过程的总结。 主要的输入是转录组数据,后台网络,监管机构的名单。NASFinder应用于套功能相关基因识别的生物环境(拓扑),感兴趣的分子连接在一起,他们的主要监管机构(如受体)。 然后,重要的子网用于通路功能分析和计算网络活动得分。
提取的监管网络TP53和ESR1具体差异表达基因不同组合与阿霉素治疗,雌二醇,和TNFα治疗药物,我们使用了NASFinder工具21。 功能分析是基于1-neighborhood连接网络通路使用的放大功能分析选项NASFinder。 可视化的集成网络,节点度分布符合幂律,和计算的压力和中间性中心的节点,我们使用了“网络分析仪”Cytoscape插件22。 进行了统计分析和可视化r .方差分析模型中的零假设没有双重和三重治疗和备择假设之间的关系是双重和三重治疗之间的关系。 通过F统计,我们考虑的强度对零假设的证据。
组织特异性测试使用定义为每个组织的差异表达基因。浓缩度集分析丰富的感兴趣的分子差异表达基因(度)为每个正常组织定义集。 差异表达基因(度)集选择30一般通过执行一个双边组织类型t检验规范化(为)表达式值(调整假定值≤0.05和绝对日志褶皱变化≥0.58)从GTEx数据库(第6版)。浓缩度集分析CS-DEGs,我们使用所有分子通路网络的拓扑结构的输出NASFinder。 我们使用FUMA的工具浓缩度集分析基于公开信息GTEx 30正常组织类型的数据库27。
我们选择五个不同的乳腺gland-derived细胞系,四个从乳腺癌患者和一个不灭的正常乳腺上皮细胞系MCF10A (Silvia Soddu博士慷慨的礼物,Regina Elena国家癌症研究所,罗马,意大利)。 MCF7、zr - 75 - 1和T47D(腔的乳腺癌模型)被选为雌激素受体阳性(ER +)细胞,而mda - mb - 231(三阴性乳腺癌模型)和MCF10A ER - (ER−)。 MCF7、zr - 75 - 1和MCF10A p53野生型细胞,而T47D和mda - mb - 231表达突变型p53(分别L149F和R280K)。 MCF7从Interlab细胞系收集购买银行(意大利热那亚),而zr - 75 - 1和mda - mb - 231分别获得从塞Zippo博士和教授亚历山德罗Provenzani(部门CIBIO、特兰托大学、意大利),当T47D乌尔里希菲博士的礼物(IRCCS Ospedale亲自到圣马蒂诺,热那亚,意大利)。 MCF7和mda - mb - 231生长在DMEM,而zr - 75 - 1和T47D RPMI(康宁,西格玛奥德里奇、米兰、意大利)。 手机媒体补充10%的边后卫(康宁),2毫米谷酰胺(康宁),和1 x青霉素和链霉素(康宁)。 对于mda - mb - 231和zr - 75 - 1,分别1%非必需氨基酸(生活技术,ThermoFisher科学、米兰、意大利)和1%的Na丙酮酸(Lonza、米兰、意大利)补充道。 MCF10A培养如前所述28。 细胞培养在37°C公司为5%2在湿润的气氛中。 美国新泽西州蒙茅斯阿霉素(MedChemExpress结)使用μM 1.5的浓度。 TNFα从西格玛奥德里奇和使用浓度的5 ng / ml MCF7和MCF10A T47D细胞和10 ng / ml, zr - 75 - 1和mda - mb - 231被证明是减少响应细胞因子。 西格玛奥德里奇17-β雌二醇(E2)的浓度1海里。 细胞收获16小时后药物的管理。 在之前的实验中,我们展示了类似的结果与10个小时和16个小时的治疗计划2,28。
总RNA提取使用RNeasy®迷你包(试剂盒、米兰、iat),转换成与PrimeScript互补TMRT试剂盒(意大利安科纳,豆类,Diatech实验室)和执行RT-qPCR 25 ng模板cDNA 384年培养板(BioRad、米兰、意大利)使用qPCRBIO SyGreen 2 x混合(PCR生物系统,Resnova、安科纳、意大利)与CFX384实时检测系统(BioRad)。 YWHAZ和GAPDH是用作参考基因获得相对ΔΔCt褶皱变化的方法如前所述29。 引物设计使用Primer-BLAST在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/),检查特异性和效率。 qPCR引物序列可按照客户要求定制。
由溶解细胞总蛋白提取得到使用缓冲区里帕补充和蛋白酶抑制剂(罗氏、米兰、意大利)和蛋白质被BCA法量化(皮尔斯,ThermoFisher科学); 30 - 50μg的蛋白质被加载到12%聚丙烯酰胺凝胶和sds - page, HyClone转移蛋白质硝化纤维素膜(Amersham Euroclone,意大利米兰),探讨了一夜在4°C与特定的抗体稀释1%脱脂奶- pbs - 0.1%补间解决方案:ERα(a300 - 4984, Bethyl实验室、特马Ricerca,博洛尼亚,意大利),p53(我,sc - 126,圣克鲁斯生物技术,米兰,意大利),p21 (EPR362、ab109520 Abcam,装饰Gianni,米兰,意大利),p63 (4 a4, sc - 8431,圣克鲁斯生物技术),α-actinin (H2, sc - 17829,圣克鲁斯生物技术)。 检测是由发射极耦合逻辑(通用电气医疗集团,Euroclone)使用ChemiDoc XRS + (BioRad)成像系统。
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