α-突触核蛋白逐步聚集显示帕金森病早期突变的特征 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

淀粉样蛋白的形成过程涉及到相互转化蛋白质种类，并导致有毒的寡聚体和纤维。聚集型α-突触核苷(αS)参与神经退行性疾病的发生，但对αS聚合反应的早期阶段和遗传αS变异体多态性的认识还不多见。在此，我们区分了αS齐聚物和原纤维在硫代乳酸T聚合反应中的相互转化。这一结果支持了将成核聚合和核转化聚合模型相结合的假设，以解释野生型和A53T突变体的不同行为。冷冻电镜直接检测显示αS纤维由遗传的A30P、E46K和A53T点突变形成的多态性。通过显示A53T能迅速成核，在种子数量不断增加的情况下不断拉长纤维，并克服生长所需的野生型表面要求，我们的发现使A53T具有可能解释家族性帕金森病患者早期发病的特征。

导言

α-突触核苷(α-S)聚集参与了帕金森病(PD)、多系统萎缩和路易体痴呆等神经退行性疾病的发病过程，但对哪些机制引发聚集、神经元细胞丢失和变性尚无共识。αS聚集体形成毒性低聚物和淀粉样细丝，命名为Lewy小体。1,2..引起多系统萎缩的特定αS株的存在3、播种行为及特异αS株的扩增4在神经变性中占主导地位5.

虽然大多数合并核病病例是散发的，但PD病史显示αS的家族变异(例如A30P、E46K和A53T)导致了早期帕金森病的发生。6,7以及对其生长动力学的独特影响8..A53T突变首次在意大利的一个家族和三个不相关的希腊家族中被报道，常染色体显性遗传的pd。6..A30P是在三个德国血统的人身上发现的。7..所有患者的发病时间都在30多岁到50多岁之间。αS的无序性质为探讨长丝形成的环境条件提供了一个框架。研究评价了pH、螯合剂、离子强度和金属对αS淀粉样形成的调节作用。9,10,11,12..轻度的改变会影响淀粉样蛋白的转换和疾病相关多态的结构特征。因此，在淀粉样生长的早期阶段形成的瞬时寡聚体的性质增加了理解淀粉样物质背后的大量事件的难度。αS的异构聚集性仍然对淀粉样蛋白的形成提出了挑战：是否存在淀粉样蛋白形成的一般机制？它转换的细胞触发器是什么？一个特定的疾病相关菌株是如何形成的？中间物种和最终产品之间有什么关系吗？

淀粉样蛋白的形成是一个涉及蛋白质相互转化的过程，有两个理论可以解释生长的早期阶段：成核聚合和成核转化聚合模型。13..第一种假设认为αS单体采用类似于成熟纤维结构的β片状结构。在这里，反应进行的限速步骤是将小的β多层膜融合，形成能够自我组装的最小模板。第二种观点假设单体αS分子内和分子间疏水性崩溃，最终形成无序寡聚体，这些低聚物以缓慢的速度逐渐演化为有能力的β-片状寡聚物种。一些研究支持成核转换模型。14,15..这两种理论都预测了一种初级成核步骤，在此过程中，可溶性物种被固定为不同大小的低聚物和β-片状物，通过单体的加入逐渐生长成原纤维，从而形成成熟的淀粉样纤维。二次过程，如纤维碎裂和表面催化成核，也可能发生在聚集过程中。16..淀粉样蛋白的形成动力学通常被看作是一个包含两个主要物种(单体和成熟纤维)的一步过程，而低聚物和原纤维形成的可互换的微观事件只能通过解析解来解释。17,18..硫代乳酸T(Tht)与寡聚体和纤维的结合具有不同的量子产率。19，但在动力学测量中，这些物种的区别还没有实现。

不同αS多态性的鉴定20,21,22,23,24而成熟纤维内部的长期变异性是获得成熟αS纤维结构信息的障碍。然而，头淀粉样蛋白和Aβ肽的近原子分辨率图是用cryo-EM报告的。25,26..在αS中，直和扭曲的长丝支持寄存器内并行β片的构象。27，但是缓冲条件可以调节它们的扭曲。28..通过固体核磁共振，Tuttle和共同作者报告了一个单一的αS原丝结构。29..最近，cryo-EM报道了含有不同第四纪排列和交错原丝的αS多态性。30,31,32..据我们所知，在由遗传PD变异形成的αS细丝上，没有关于冷冻水合显微照片的比较。然而，包括小角度X射线散射在内的结构方法揭示了含有遗传突变的αS的一些共性和结构差异。33,34.

我们进行了一系列的生化、动力学和结构研究，以了解αS聚合的早期阶段和可遗传的αS变异体的多态性。我们系统地研究了早期发病的PD患者(A30P、E46K和A53T)在离子强度作用下所观察到的野生型和三个家族性αS变异体的动力学。我们为区分齐聚物和原丝在动力学过程中的相互转化以及成核-聚合和成核-转化-聚合模型的协调提供了证据，从而解释了野生型αS和A53T突变体的不同动力学行为。我们为研究淀粉样蛋白转换的早期阶段提供了一个框架，并将A53T定位于具有可能有助于解释家族性PD病例早期发病的特征。

结果

离子强度对αS动力学轨迹的影响

我们设计了不同浓度NaCl的动力学实验。1A-d和补充图。1A-d)与Na的生理梯度一致+跨神经元膜观察35..在反应结束时(~90 h)，我们对最终产物进行了透射电镜(图1)。1E)和其余可溶组分的吸光度测定(如图所示)。1F-I)。此外，我们还观察了可溶性物种的TEM(补充图)。2)并评估最后的荧光强度(如图所示)。1J-m)。由于αS倾向于形成高阶物种，质量检查在附图中提供。3.

在聚合反应过程中，Tt的荧光显示了不同变体的不同行为。我们观察到随着离子强度的增加，斜率值增加(补充图)。1E)说明NaCl促进淀粉样蛋白的生长。A30P和E46K在1和10 mm盐存在或不存在的情况下发生反应时，A30P和E46K表现出两步跃迁，涉及三个主要物种系综(图1)。1B，c)。随着离子强度的增加，相应的可溶性组分呈下降趋势。1g，h)。在100 mm的盐浓度下，所有的变体都表现出一步转变和更快的聚合，减少了一半的时间(T)。50%，补充图。1F)。在这种情况下的两个主要物种是单体在开始和成熟的纤维作为最终产品(图一)。1A-d、蓝色痕迹)。令人惊讶的是，在没有盐的情况下，野生型和A53T出现了三步转变，即四种主要的物种群被区分开来(图1)。1A，d(黑色痕迹)多步跃迁被评估为数据重现性(补充图)。4A，b)。与αS单体相比(图1)。1F，i这些变异体的可溶组分随着离子强度的增加而突然单调下降(图1)。1F，i)。动力学后用TEM观察到的低聚物最有可能代表所有最终产物的可溶性组分，很少有用低聚物修饰的原丝(附图)。2)。很难区分可溶低聚物对纤维材料的形成所起的作用。令人费解的是，它们是否代表了非途径物质，还是参与了减缓动力学轨迹或通过充当生长中的纤维的单聚体的来源来加速其运动轨迹。

最终产物的TEM没有显示出明显的纤维形态差异，而是在长丝长度上表现出明显的差异。长丝长度随离子强度的增加而减小，最易被观察到的是无盐条件和100 mm条件下的野生型和A53T(图1)。1E).

星号如图所示。1E表示为进一步分析而选择的条件。这些长的淀粉样纤维是由两个交织在一起的原丝形成的，就像其他淀粉样纤维一样。25,26,27..虽然A30P和E46K长丝在没有盐的情况下被成像(如图所示)。1E)，在搜索过程中很难检测到这些纤维代表一个小群体。此外，在独立运行结束时，还保留了合理的可溶分数(图1)。1g，h(黑条)，表明淀粉样物质在这些条件下是不受欢迎的。

为了将荧光强度作为一般结构变化的定量测量，我们校准了其发射的线性范围。36(补充图。1g)。在没有盐的情况下，野生型和A53TαS的结合量相似，平均值和标准误差为~8000±500(n=16)和~7475±245(n分别=18)计数(图1)。1J，m黑棒)在没有盐的情况下，A30P。1K在相同的条件下，这些水平可能与野生型和A53T相似，但A30P的可溶性分数在其他条件下表现出更大的比例(比较图)。1g黑棒上有图。1F，i黑棒)在不含盐的情况下，E46K的可溶性组分与A30P成正比(图1)。1g，h但E46K的水平至少是两倍(图1)。1K，l黑棒)在没有盐的情况下，野生型和A53T的低Tt计数在1mm时基本相同(图1)。1J，m(红条)在含10毫米盐的情况下，A53T纤维的含量大约是野生型的两倍(如图所示)。1J，m但同样地，在100毫米盐的含量上也出现了突然的增加(如图1所示)。1J，m蓝条)A30P和E46K在1mm盐下的结合程度不同，平均为12，380±793。n=17)和58 720±3414(n分别=16)计数(图1)。1K，l(红条)在野生型/A53T之间所观察到的不同值(图1)。1J-mA30P(图1)。1K和E46K(图1.1L红棒)并不是由于大量的纤维物质造成的，因为我们测量到了类似浓度的可溶性物质(~1mg mL)。−1)在所选择的条件下处于平衡状态(如图所示。1F-I星号)。其他条件下，我们没有实现类似的可溶分数测量，可能是受到影响的低聚物的形成，没有贡献的纤维伸长，或非晶聚集体，不适当地转移单体从淀粉样生长。

支持在αS变体中形成结构不同的细丝(如图所示)。1E从蛋白酶K(PK)消化分析中发现，野生型和A53T花丝之间有相似的条带。2A)。相反，A30P和E46K长丝的消化方式不同(见图)。2A)，证实了野生型和A53T丝具有相似的构象，而A30P和E46K在结构上是不同的。纤维材料的CD数据显示淀粉样的典型β-片状结构，在218 nm处有负带，195 nm处有阳性带。A53T纤维显示了一个由π-π引起的正带错位。∗酰胺基电子跃迁从195 nm到200~205 nm(图1)。2B).

αS可遗传变异体形成明显扭曲的细丝

我们进行了冷冻-EM，以阐明αS纤维含有遗传突变(图一)。1E，星号)在结构上是不同的(图中所示)。3)。与A30P和E46K不同的是，野人型和A53T在冷冻水合显微照片的视觉观察基础上表现出相似的形态(图一)。3A)和提取丝的功率谱评价(图一。3B，c)。提取的长丝的傅里叶变换(功率谱)允许测量长丝的间距，即绕灯丝轴移动360°所需的距离。纤维间距的不同提供了第四纪结构水平多态性的证据。与预期的跨β体系结构一样，我们观察到了不变量1/4.7−1沿纤维轴的αS链间距(图)。3B)。A30P和E46K长丝的功率谱显示，在赤道附近有额外的低分辨率层线，对应于~1/398。−1和~1/1460−1，分别(图1.3C和信息)。它直接通知一半的螺距值的研究纤维。对于野生型和A53T，在赤道附近没有观察到更多的层线(图)。3C)，支持这些细丝的长节周期(如图所示。3A)。野生型和A53T的冷冻水合显微图在没有的情况下都表现出相似的形貌(图1)。3A)或1毫米盐的存在(附图)。5A，b)。研究结果证实，与A30P和E46K不同的是，野生型和A53T型纤维具有第四纪结构相似性，而不考虑离子强度的细微变化(高达1mMNaCl)。

离子强度对αS纤维长度和构象的影响

为了支持增加离子强度，减少纤维长度，我们测量了在没有和存在100毫米盐的情况下生长的长丝的长度分布。4A-f)。随着离子强度的增加而出现较短的长丝(见图)。4C，d)，加上增加的坡度值(附图)。1E)，较短的滞后相和高盐加速动力学(图一)。1A-d和补充图。1F)，支持盐对αS生长动力学的影响。目前尚不清楚纤维断裂是否也会发生，并可能促进αS的生长，但一些较短的纤维的形态很可能与破碎的成熟纤维相一致(图1)。4F).

为了研究离子强度对αS丝结构的影响，我们对在不加盐或不加盐的情况下形成的野生型和A53T长丝进行了PK消化。5A-d和补充图。6a，b)。我们观察到在没有盐的情况下生长的野生型和A53T花丝与在100毫米盐中形成的野生型和A53T丝状物相比，PK消化带有一个明显的剖面(图1)。5A，c，以及附图。6)。说明盐可能导致αS纤维构象的差异。为了证实这一点，我们设计了一个受控的PK消化结合电喷雾电离质谱(ESI-MS)来评估野生型和A53T纤维在没有盐和有盐的情况下的肽特征。我们检测到的多肽高达4KD，并发现在所有运行中，序列覆盖率都高于80%(补充图)。7)。从残留物20到30的区域从来没有被观察到，大概是因为它很容易被消化(附图)。7A-d)。最丰富的物种来自C端，由90至140个残基组成，这些物种可能是较难消化的肽。我们展示了突出的削减(补充图)。7)，主要发生在L 113和Y 125。Venn图显示了在没有盐和盐存在的情况下形成野生型和A53T丝时所识别的独特肽集的比较。5E，f)。用αS序列对这些独特的多肽及其丰度进行定位，结果表明，当野生型和A53T丝在NaC l的影响下形成时，构象有明显的差异。

此后，我们将注意力转向野生型和A53T的动力学痕迹，试图了解A53T在熟悉的PD早发病例中的表现。

A53T拉长种子，克服表面生长需要

为了了解盐对αS淀粉样蛋白形成的影响，我们研究了在无100 mm盐和无种子的情况下，野生型和A53T的静态动力学。可溶性组分的可溶组分数量与初始单体的含量相似(图1)。6A)。结果表明，在所研究的时间范围内(~90 h)，成熟的αS纤维很少发生聚合，需要较长的潜伏期。在没有盐的情况下，Tt荧光对野生型和A53T没有结合作用，但在无盐的情况下，对野生型和A53T的结合信号较低，而A53T则有较大的增加(图二)。6B)。我们观察到，在中性pH的静止条件下，使用预制种(附图)。8A)，A53T形成淀粉样纤维(图1)。6C)。结果表明，该突变体在中性pH条件下可能发生二次成核，但由于A53T没有明显改变αS的电荷状态，所以我们保守地将二次成核完全归因于在中性pH条件下观察到的动力学轨迹。沉降也可以解释观测到的影响。尽管如此，这还是很有趣的，因为只有在温和的酸性条件下，αS才能通过二次成核聚集。11，揭示了该突变体在生理pH条件下的潜在优势。

αS聚集的主导二次过程是通过纤维表面的单体成核而不是纤维碎裂发生的。37..为了评价表面对αS聚集的影响，我们用标准聚丙烯(PPP)管和低粘着度聚丙烯(PPP)管进行了野生型和A53T动力学研究，并对可溶性和纤维组分进行了定量测定。6d)。与野生型不同，A53T能够拉长纤维，即使在低粘着表面生长也是如此(见图)。6d、箭)。通过使用TEM图像(图1)。6E)，我们证实了A53T纤维的存在，表明A53T克服了野生型αS表面生长的要求。

在摇动条件下增加种子质量，通过比较野生型和不含100 mm盐的A53T，我们检测到了明显的不同行为。7A-h)。当种子数量增加时，观察到的多步跃迁逐渐被抑制。7A，c)。在使用较多的种子后，观察到了指数爆破和完全抑制滞后期的现象(图一)。7A，c)。在不含盐的情况下，可溶性和原纤维组分显示，野生型和A53T具有消耗可溶性物种和形成更多纤维的作用，并以类似的方式增加种子。7E，g下降和上升的黑棒)。虽然由于振动而产生碎裂，但晶种反应表明二次成核事件可能对αS的生长动力学有一定的影响。

在100毫米盐的存在下，种子反应的性质及其可溶和纤维的分布发生了巨大的变化。7b，d)。野生型可溶性组分随种子量的增加而增加(图1)。7F上升黑棒)，但反应显示没有实质形成新的纤维随着种子数量的增加(图一)。7F，不变黑条)。值得注意的是，随着种子数量的增加，A53T突变体的纤维质量容易增加。7H、上升的黑色酒吧)。野性可溶组分增加(图1.7F)表明所添加的单体或种子在反应中均未被消耗。对照试验表明，完全由种子组成的溶液在可溶组分和原纤维组分中含有相似数量的物种(附图)。8B，c)。然而，种子溶液中可溶部分的穗状形态与从可溶部分中得到的寡聚形态的差异最大，通过实验评估了添加种子的野生型动力学(图1)。7F和补充图。8D)。它支持在图中观察到的野性可溶性物种数量的增加。7F最有可能的是由添加的单体形成的低聚物，而不是添加种子的积累。综合来看，这些数据可以帮助解释带有遗传A53T突变的PD患者的早期发病特征。在种子数量增加的情况下，与野种不同，A53T能够在生理相关离子强度的存在下增加纤维质量(图1)。7F，h)。此外，A53T在中性pH条件下在静止状态下通过二次成核过程形成淀粉样纤维(图1)。6C)和克服野性表面属性的增长(图一。6d，e).

A53T快速成核的淀粉样生长敏感物种

为了更好地理解为通配型和A53T捕获的多步动力学行为，我们设计了图中描述的过程。8A..在运动过程中，在每一次观察到的跃迁的一半时间，都采取了类似的方法(图1)。8B)并接受超离心。上清液组分随后立即由A-SEC评估(图1)。8C，d)并为TEM做好准备(图1)。8B用透射电镜观察颗粒。8B和补充图。9)。虽然αS单体在时间上占主导地位，但如图所示。8C，d标记M)，在大的和小的寡聚体之间有一个很小但很明显的分离(嵌入图)。8C，d分别标为LGO和SMO)。在动力学实验之前，野生型和A53T单体的A-SEC显示了与少量SMO的稳态平衡(图)。8C，d；T0)。在整个野生型动力学实验中，SMO含量减少，LGO含量增加，而A53T对SMO无明显影响，而LGO未被检测到(inetts图g)。8C，d)。相反，A53T的时间A-SEC运行显示了一个显著的峰值在~11毫升，这是无法解决的野性类型(图一)。8D；多用户(MTS)。αS单体的无序性质解释了在超糖6中洗脱的原因，估计分子量为68 kD。A53T的突出峰对应于89 kD的物种，最有可能代表A53T构象多倍体(图1)。8D；MTS)。动力学6h后用透射电镜测定的可溶性组分证实了不同尺寸的多形性野生型齐聚物的富集种群。我们在肉眼检查的基础上定义了至少三种不同的寡聚体，并根据它们的大小和染色倾向对它们进行分类。SMO占主导地位，呈白色。生长的寡聚体(GOS)的大小是中等的，而LgO的染色更消极(图1)。8E和补充图。9a，b)。用透射电镜观察到其余的LgO在46 h后的野生型动力学(图1)。8B)，并与A-SEC观察到的LGO峰增加相一致。8C(T46h)。由于A-SEC和TEM在每一时刻的可溶性脂肪被划分，所以我们将A-SEC分离的LgO和SMO归因于用TEM表征的相同的LGO和SMO。结果表明，在没有盐的情况下，αS形成的一些LGO在动力学反应中积累，而一些有能力的SMO最有可能被消耗来启动纤维池。对于A53T来说，缺乏LGO和SMO与较小的多用户之间的稳态平衡，可以满足快速形成纤维组分的连续相互转化物种的要求。动力学运行10 h和20 h后，纤维组分呈生长原纤维，46h后主要观察到成熟纤维(图1)。8B和补充图。9C(小球)

我们提供证据证明，野生型和A53T动力学之间的差异产生于在聚集早期形成的明显不同的中间物种(图五)。8和9)。这种不同的行为对最终产物没有影响，但确实影响了生长速度，因为在没有盐的情况下形成的野生型和A53T成熟的长丝根据荧光计数是无法区分的(图一)。1J，m；黑条)，PK消化曲线(图1)。2A)和傅立叶分析(图1。3和补充图。5)。相反，当盐浓度较高时，构象多样性就会出现(图中所示)。5)，延伸率发生得更快(如图所示)。1A，d黑色和蓝色的痕迹)，纤维变得更短(图。4A-f但是，与野种不同的是，A53T在预成形种子的存在下不断增加纤维质量(见图)。7F，h)和克服表面属性的增长(图一。6d，e).

讨论

淀粉样蛋白的形成对于解释毒性寡聚体和纤维的形成及其在神经变性中的作用至关重要。我们扩展了我们的知识，以区分齐聚物和原丝相互转化，并提供了一个假设，使成核聚合和成核-转化-聚合模型相协调，以解释野生型αS和A53T突变体的不同动力学行为。

αS依赖于包括聚合物-水界面在内的非均匀成核过程。37,38，空气-水界面39脂水界面40..我们证明，与野生型不同，A53T在低粘附表面孵育时会拉长纤维。结果表明，A53T具有克服野战型聚合物-水界面要求的能力。的确，A53T可以通过加速气水界面的初级成核来补偿这一点，但这还有待进一步的探索。

淀粉样物质的转换通常是从荧光探针的时间历程测量得到的，但解释仅限于直接从乙状结肠行为中提取的参数。41..相反，主方程的应用为理解淀粉样生长和碎裂的微观事件和速率常数提供了支持。17,18..虽然在与交叉β膜结合后荧光增强，淀粉样物质通过寡聚体、原纤维和成熟丝的β片含量的增加而增加，但迄今还没有评估低聚物积累和原丝形成的微观事件对宏观动力学水平的贡献。这些有核物种可以迅速地相互转化，也可能没有形成足够的数量来检测。或者，因为淀粉样蛋白的形成对环境条件的变化很敏感。9,11二次事件有可能支配动力学过程，防止形成足够多的寡聚体和原纤维，以供其检测。我们用不同浓度的NaCl进行了系统的时间演化实验，解决了这个问题。我们确定了在没有盐的情况下，野生型和A53T淀粉样的高度可重复的多步转换(图)。1A-d，以及附图。4)并利用A-SEC对每个阶段进行了表征。8C，d)和TEM(图1.8B和补充图。9)。二次成核是通过单体在纤维表面的成核来控制αS的聚集，而不是纤维碎裂。37..我们认为，在100 mm盐和搅拌下，碎裂也可能有助于αS的生长动力学。野生型和A53T纤维在NaCl诱导下的构象多样性(见图)。5)由红外数据支持，显示在不同的盐浓度下，从平行到反平行的β片。42..在没有盐的情况下生长的A53T纤维的远紫外光谱显示了π-π的错位。∗与平行β片的存在相一致的电子跃迁43..由于并行β片材的H键结构，这种二次结构比反平行片结构更不稳定。这可能允许A53T单体在淀粉样形核的早期阶段更快地筛选出有能力的转化物种。

水化和静电相互作用决定了αS的聚集9..当有碎裂的纤维存在时，新的纤维端可用于单体的掺入，催化伸长步骤。因此，淀粉样纤维的伸长率随离子强度的增加而增大。10..这一观察可以解释指数爆发(图1)。1A-d)和在较高盐浓度下产生较短的成熟纤维(如图所示)。4A-f)，因为新的竞争目标将用于增长。此外，在较高的盐浓度下，观察到的Tt计数增加(如图所示)。1J-m蓝条)可能是纤维间构象差异的结果(如图所示)。5A-f)有利于空间位调节或与反应纤维末端数量的增加结合。

可以想象，Na的作用+和Cl−αS可能具有伸长纤维的作用，包括其直接结合和初始纤维周围的水化干扰，再加上搅拌引起的剪切力，可能在一定程度上有利于纤维断裂。为了支持水分子对纤维稳定性的作用，当甘油优先将水排除在纤维周围的区域时，纤维就会在静水压力引起的断裂中稳定下来。44..因此，在αS的N端和C端存在暴露电荷有利于Na的直接结合。+和Cl−和静电筛选，以启动一个有能力的核生长，一种条件，可能增加生长的长丝的伸长率。

报道证实了纤维长度与其细胞毒作用的关系。45,46..例如，由αS、β2-微球蛋白和溶菌酶形成的较短的纤维具有更强的细胞毒性。45..更值得注意的是，αS纤维的大小与它们作为种子将正常的αS转化为纤维的能力之间存在着某种联系。46..值得注意的是，Na的α3亚基+/K+ATP酶(α3-NKA)是αS纤维的表面伴侣。47影响Na的去除+从细胞内的空间。在静息神经元中，Na的胞内浓度+将提供一个有利的方案，以保持长的αS纤维在细胞内。在神经元活动过程中，Na+波动可能有利于静电筛选，这将加速αS的初级成核和纤维生长速率产生较短的纤维。较短的片段更容易被挤压，从而改变宿主细胞膜的相互作用和细胞内的信号传递，从而提供细胞间的传递和繁殖效应，以保证疾病的发生和传播。3,45,46.

我们检测了齐聚物和原丝在动力学过程中的相互转化。8B)。这对于描述参与淀粉样生长的中间物种以及不同的αS变异体的行为至关重要。低聚物是神经变性相关毒性的主要原因。48，并提出了几种机制来解释毒性效应。49,50,51,52，包括膜微扰53,54..虽然A53T在αS聚集过程中占主导地位55单分子FRET显示了遗传变异体中寡聚体的可能结构差异。56对于野性αS和A53T变体的不同动力学行为，没有机械的解释。通过调节盐浓度的聚合反应，我们找出了野生型和A53T型αS之间生长速度差异的主要决定因素。首先，野生型LgO积累，而A53T型LgO未被检测到。第二，野生型SMO逐渐被纤维蛋白池所消耗，而A53TSMO水平只是微小的变化。最后，在A53T中检测到一个最有可能代表小型构象多用户的显著峰值，但对于通配性类型则可以忽略不计。重要的是，在达到平衡和淀粉样纤维作为最终产物的动力学过程中，观察到了这些差异。此外，初始的αS单体不受冻干或超临界浓度的影响，这在用于表征低聚物的协议中经常被报道。57,58..我们无法确定在测量过程中观察到的αS低聚物是否与先前描述的-A/-A型相同∗和类型-B/-B∗低聚物作为低聚物制备中的小变化，如冻干或添加化合物，可能是异质性的来源。

我们提出了一个假设，以协调现有的淀粉样生长模型：成核聚合和成核-转化-聚合模型。我们强调，淀粉样蛋白的形成并不是一个物种按顺序形成的过程。相反，多个物种的种群加权平均数在每个阶段以不同的比例共存。对于野生型αS，较长的滞后相和SMO的消耗很可能与成核-转换-聚合模型相对应，在这种模型中，无序的低聚物首先被转换成更有组织的β-片状结构，然后开始形成成熟的纤维(如图所示)。9)。这一过程可以解释我们的动力学中较长的通配型转变(如图所示)。1A，d, 8B和补充图。4)。与野生型不同，A53T有一个不断相互转换的多聚体和SMO的池，更适合成核聚合模型，在αS聚合的早期阶段，“现成的”物种迅速形成，并且可以持续地将αS单体结合起来，并保证原丝生长过程中的指数爆发(图1)。8B-d)。作为LGO的野生型单体的固存可能限制了构象单体的可用性，这些单体可以结合到生长的纤维中。由于A53T没有发生对LGO的实质性损失，这并不是A53T动力学生长的一个限制步骤。最近的一项研究表明，αS易于由dityrosin交联引发共价二聚。59..然而，目前尚不清楚观察到的A53T多聚体是否代表了这类αS共价二聚体。到目前为止，通过显示A53T能快速成核生长，在数量不断增加的预制种子存在的情况下不断拉长纤维并克服野生型表面属性促进生长，我们的发现使A53T具有解释家族性PD病例早期发病的特征。

方法

单体αS的制备

αS的重组单体是根据前面描述的协议生长的。60..蛋白纯化采用渗透休克法，对透析步骤和蛋白质储存进行了小修改。50%w/v(NH)的αS沉淀后4)2所以4和离心(25，000×g小球在含1 mm EDTA的20 mM Tris-Cl(pH8.0)溶液中再悬浮15 min(4°C)，隔夜(约16h)用蛇皮透析管(7 KD MWCO)对同一缓冲液中的5L进行透析(Thermo Science，#68700)。用0.22μm聚偏氟乙烯滤池(微孔，#SLGV 033NS)对透析蛋白批次进行过滤，在−80°C下直接冷冻，使用时间不超过6个月。所有的动力学痕迹都是在新鲜样品上进行的，最好是在纯化后1-4周内完成，因为较长时间(2-6个月)的样品很难达到重现性，这可能是由于异常寡聚物种的积累所致。

为了进行动力学和进一步的实验，在冰上解冻了500~700μL(约200~400μM)的Alquot，并在5 mm Tris-Cl(pH7.4)(−NaCl条件)或10 mm Tris-Cl(pH 7.4)和相应的NaCl浓度(1，10，或100 mm)的缓冲液中，对5 mm Tris-Cl(pH7.4)和相应的NaCl浓度(1，10，或100 mm)进行了进一步的透析(约16h)。由于缓冲液浓度为10 mm，1mm NaCl条件对离子强度的影响较小。在这一步中，我们使用了一个滑动-A型微型透析装置，10 kD的MWCO(ThermoScience，#88401).采用相同的5L缓冲容器对所研究的αS变异体进行透析，在选择的条件下，排除所研究结构中缓冲区组成的任何变异性，提高数据的鲁棒性。A-SEC(每次注射250μL，流速为0.7 mL/min)−1)透析后立即用Superdex 200增容10/300 GL柱(GE Lifescience，#28-9909-44)检测单体αS的纯度。3).

动力学实验

透析后，用摩尔消光系数为5960 M，在280 nm处测定单分子αS变异体的浓度。−1厘米−1在所选择的条件下，使用相同的透析缓冲液调节到140μM。我们使用清底96井板(热科学，#265301)，每口井的最终反应量为100μL.我们至少用了两批不同的蛋白质。为了尽可能地排除实验上的变化，我们设计了动力学运行，以确保所有研究的αS变体和缓冲条件都在相同的96井板上进行评估，因此所观察到的影响完全与特定的αS结构和缓冲器组成有关。采用F1-ClipTip多通道吸管(热科学，#4661110 N，#4661130 N)和低保留度小管尖(Thermo Science，#94410310，#94410210)制备平板。

用140个αM(~2mg mL)进行了μS聚合反应。−1)αS单体，用8μM tht(Sigma，T 3516)荧光监测。在我们的动力学痕迹中使用的浓度在染料的线性响应范围内，因此它是推断结构变化的可靠度量(补充图)。1g)。在λ下，每隔4分钟测量一次~90 h的发射。马克斯在450 nm激发时=477 nm。为了提高不同井间的数据重现性，我们使用了1/8“直径的聚四氟乙烯球(聚科学，#17649)。板用透明聚烯烃密封带(热科学，232702)密封，加载到37°C预温化的MaxGemini电磁平板阅读器(分子器件)中。在整个动力学测量过程中，温度为37°C，除非另有说明，否则每次读取时轨道搅拌被设置为10s。光电倍增器增益被设置为低(即每次读取6个闪光灯)，读取设置为从板底部。低粘着聚丙烯管材的表面试验是从美国科学(#1415-2600).

在动力学轨迹的开始和结束时，将该荧光定标到荧光的平台水平，以使离子强度对该跃迁的影响具有可比性(图1)。1A-d)。我们用最后一次跃迁来绘制所有动力学轨迹的斜率变化，因为它代表了荧光中最大的增益，最有可能的解释是纤维质量的增加(附图)。1A-d).

附图中原始数据的异常值。4在五条独立轨迹的平均值中，排除了所有其他的运动轨迹。在Wolfram Mathematica中使用自动截止程序进行数据排除，不影响动力学倾向行为。这一程序是作为一种战略，以捕捉更精细的增长趋势。

排除SMO的小种群对野生型和A53T所观察到的多步动力学行为的影响(图1)。8C，d；T0)，在从尺寸排除运行中收集纯单体αS后，我们立即对野生型和A53T进行了附加的动力学跟踪，并证明了相同的多步曲线表明，SMOs的小种群并不是观察到的行为的决定因素。

为了产生种子，我们用1mg mL的球团。−1使用超声波液体处理器(Misonix，#xl-2000)进行15秒的超声波照射。在超声作用之前，微丸被轻轻地重新悬浮到所选择的条件的200μL中，以保证可忽略不计的单体数量。用直径为3/32‘的微探针，输出功率为15。用TEM(附图)对种子进行了检测。8A)与140μM新鲜单体孵育前进行动力学测定。用于控制实验(附图)。8B-d)种子溶液在室温下保存90h，然后检测可溶性和原纤维组分。

可溶纤维测量

我们测定了50μL样品(贝克曼库尔特，#OptimaMax-TL)在20°C下离心15 min，100，000 rpm后的可溶性和纤维蛋白组分，离心后立即分离上清液和颗粒组分，因为有些条件在管底部产生了柔软的不粘附颗粒。我们从上清液的顶部中心部分吸管，以避免任何与纤维材料的污染。用50μL的5 M胍(usb，50-01-1)对含有纤维的干燥颗粒进行强烈匀浆，以估计胍处理后从纤维中释放出的αS纤维浓度。然后在280 nm处用吸光度法测定可溶性和纤维组分的浓度，摩尔消光系数为5960 M。−1厘米−1使用NanoDrop onec系统(Thermo Science Inc.)。

透射电镜

我们观察到，用水稀释5倍(20μL的终动力产物+80μL的Milliq水)，然后用涡旋器轻轻旋转，使αS纤维更好地在透射电镜网格上传播。在观察到大量可溶物(如A30P和E46K，−氯化钠)的条件下，样品不受稀释。我们制备了可溶组分网格(附图)。2和9A(B)取50μL样品的上清液(4μL)后，在10 0 0 rpm和2 0°C下分别进行15 min和2 0°C。8B和补充图。9C)，我们在50μL的水中重新悬浮沉淀纤维。

动态运行后立即获得TEM图像，以确定在所研究条件下成熟淀粉样纤维的形成(图1)。1E)。对于长度分布测量，图像是在低放大率下拍摄的，以保证长丝两端都能在显微照片中看到。(无花果)4A，b在300目铜栅(EMS，#CF300-Cu-Th)上放置1~2 min，用滤纸轻轻干燥，用2%醋酸铀酰(EMS，#22400)染色10s。在80 kV运行的Philips Tecnai显微镜上对染色呈阴性的样品进行成像。

蛋白水解消化

成熟αS纤维(100μM，~1.4mg mL)−1)在选定的条件下(如图所示)。2和补充图。6)在37°C下用4.4μg mL处理。−1PK(Thermo Science，#EO 0491)。经过0、1、5、10、30和60 min的时间，在变性缓冲液存在下，立即加热至90°C 5 min，中断裂解反应。用20%均相SDS-PAGE(GE Lifesciations，#17-0624-01)对PhastGel体系的裂解反应时间进行了监测。

圆二色性

CD是在装有Peltier温度控制器的Jasco分光谱仪(J-1500)上进行的.在25°C下，用0.2nm台阶、1mm带宽和三个光谱积累得到了260~185 nm的远紫外光谱。在特定条件下生长的纤维材料(63μΜ)在60，000×g分离剩余单体10分钟。球团被轻轻地重新悬浮在一个光学活性较低的缓冲器(15毫米kh)中。2阿宝4，pH 7.0)，允许低波长截止(~185 nm)61..为了消除吸收波长低于200 nm的光的氧，在再悬浮之前对缓冲液进行了广泛的脱气。所有测量均采用0.01cm的可拆卸小槽。平均剩余椭圆度[Θ]2dmol−1用[Θ]=/l.c.10.n，其中Θ是测量到的以毫米为单位的椭圆度，n是肽键的数目，l是路径长度(以厘米为单位)，以及c摩尔浓度。

电喷雾电离质谱

野生型和A53T纤维(~1mg mL)−1在选定的条件下(−NaCl或100 mm盐)，用PK处理10 min，95℃下酶灭活5 min，在80，000 rpm和10°C离心10 min，在−80°C下冷冻。LC-MS系统由热电子Velos Pro OrbitrapETD质谱计组成，该质谱计与15 cm热Fisher 3μm C18简易喷雾柱(通过预柱)相连。

进样1微升(1：5 0稀释，3%醋酸/水)，乙腈/0.1M乙酸梯度洗脱，流速0.3μL/min，流速1.5h，纳米离子源为2.3kV。利用该仪器的快速切换能力进行分析，获得全扫描质谱(ORBITRAP，60K分辨率，AGC 9E5)，测定肽分子量，然后用20个产物离子谱(IT，AGC 8E3)测定序列扫描中的氨基酸序列。与数据相关的设置为重复计数1、重复持续时间30、排除列表400和排除持续时间60。

原始数据文件使用热费舍尔蛋白质组发现器1.4.1使用SEQUEST算法对αS的两个序列数据库进行处理(通配型和A53T，NCBI参考序列：NP_001139527.1)。搜索参数为：亲本质量10 ppm，片段质量1.0 Da，无酶，氧化Met，乙酰化N-末端。所得数据用蛋白质组软件Scaffold 4.8.1显示，滤器为Xcorr(+1>1.8，+2>2.2，+3>2.5，+4>3.5)，肽预言>60%，蛋白质预言>90%，总光谱计数)。

分析尺寸排斥色谱(A-SEC)

在动力学测量过程中得到的可溶性组分(如图所示)。8C，d)直接注入超糖6增加10/300 GL(GE生命科学，#29-0915-96)。所有运行在10 mm Tris-Cl(pH 7.4)下进行，流速为0.7 mL min。−1，在280 nm处用KTA主元系统(GE Lifescies)测定吸光度。用甲状腺球蛋白，670 kD；γ-球蛋白，158 kD；卵清蛋白，44 kD；肌红蛋白，17 kD；维生素B12，1.35kD(Bio-Rad，#151-1901)。

低温电子显微镜和图像处理

动力学测试后获得的成熟纤维在相同的缓冲液中稀释5倍，然后在涡旋器中轻轻均匀化。样品(4μL)应用于莱西碳栅格(TedPella，#01895-F)，之前用Solarus950先进等离子体系统(GatanInc.)放电30 s，用Whatman 1滤纸(Whatman，#1001055)用5次力设定涂抹5s，用维特机器人MarkIV(FEI，Inc.)进行玻璃化。样品装在一个土卫六Krios 300千伏，并与猎鹰III工作在线性模式下，使用1.07单位像素采样。在75，000×使用−1至−3μm的0.5μm级的离焦范围内获得图像，曝光时间分别为2~3s，分别为34和59个等分剂量。总剂量范围为每小时40-50个电子。2..用EPU软件选择目标。利用MotionCor2对图像进行运动校正62，并使用CTFFIND 3软件进行了离焦估计。63..对于对比度差、传递函数估计差和离焦值高于−3μm的图像，未作进一步分析。我们使用Eman套件的e2helixboxer软件对淀粉样丝进行装箱。64..利用Spider脚本进行灯丝提取和功率谱计算。65.

统计与重现性

动力学痕迹用平均±S.E.M表示。几口井中至少有三个独立的平板实验。样本大小被设置为最小的n=5.至少用两批蛋白质进行动力学实验。复制被定义为平板井。

从动力学痕迹的终产物中测定可溶性和纤维组分。数据以平均±S.E.M表示。从几口井中至少有两个独立的平板实验。样本大小被设置为最小的n=9。

冷冻-电镜和阴性染色电镜观察两批纤维.大小排阻色谱和圆二色谱进行了两次。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

本研究中产生的所有数据和生物材料，可根据要求从相应的作者处获得。本文的报告摘要可作为补充文件查阅。图中的源数据。1A-d，f-m, 2b，5E，F，6A-d，7阿-h，8C，d，以及补充图。3A-d，4在补充数据中提供1.