同源结构域蛋白dlx 4与转化生长因子-β细胞抑制程序的关键转录调控机制对抗，并阻断转化生长因子-β的抗增殖作用 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

转化生长因子-β(TGF-β)的抗增殖活性是维持正常组织稳态所必需的，并在多种肿瘤中丢失。转化生长因子-β细胞抑制计划的核心基因反应包括激活细胞周期素依赖性激酶抑制剂p15。Ink4B和p21WAF 1/Cip 1对c-myc的抑制作用。这些基因反应受到一系列转录因子的严格调控，其中包括Smad蛋白和Sp1。这个DLX 4同源盒模式基因编码一种转录因子，在大多数正常成人组织中缺失，但在多种恶性肿瘤中表达，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。在本研究中，我们证明DLX 4阻断了转化生长因子-β的抗增殖作用。DLX 4抑制转化生长因子-β介导的p15诱导Ink4B和p21WAF 1/Cip 1表情。DLX 4与Smad 2和Smad 3结合并阻止Smad 4与Smad 2和Smad 3形成配合物，而与Sp1不结合。而DLX 4对Sp1的DNA结合活性也有抑制作用。此外，DLX 4诱导c-myc的表达与TGF-β/Smad信号转导无关。DLX 4对抗转化生长因子-β细胞静息程序关键转录调控机制的能力部分解释了肿瘤对转化生长因子-β的抗增殖作用的抵抗。

导言

转化生长因子-β(TGF-β)介导胚胎发生和成体组织中的增殖、分化和凋亡等多种过程。Siegel和Massagué，2003年; Massagué，2008年)。转化生长因子-β结合后，转化生长因子-βⅡ型受体磷酸化，激活转化生长因子-βⅠ型受体.转化生长因子-βⅠ型受体磷酸化Smad 2和Smad 3，并与Smad 4和其他dna结合因子形成复合物，激活或抑制转录。Shiand Massagué，2003年; 冯和德因克，2005年)。在大多数正常细胞中，转化生长因子-β通过诱导G细胞阻滞而抑制细胞增殖。1相位。转化生长因子-β细胞抑制计划的核心基因反应是激活细胞周期素依赖性激酶抑制剂p15。Ink4B和p21WAF 1/Cip 1，抑制促进生长的c-myc和ID转录因子(Renisdóttir等人，1995年; Chen等人，2002年; Kang等人，2003年)。细胞静止程序由保护有丝分裂信号的反馈回路紧密结合(Siegel和Massagué，2003年)。例如，tf-β激活p15。Ink4B和p21WAF 1/Cip 1通过sp1和smad蛋白之间的协同作用进行转录，并阻止c-myc对这些基因的抑制。冯等人，2000年, 2002; Pardali等人，2000年; Gartel等人，2001年).

抗转化生长因子β介导的生长抑制是多种肿瘤发病机制中的一个重要特征。Siegel和Massagué，2003年; Massagué，2008年)。在多种类型的肿瘤中，这种耐药性被认为是由于转化生长因子-β信号通路核心成分的突变或缺失所致。60%-90%与微卫星不稳定相关的结肠癌组织中报道了转化生长因子-βⅡ型受体的失活突变。Markowitz等人，1995年; Watanabe等人，2001年)。Smad 4突变或缺失发生在∼50%的胰腺和非微卫星不稳定结直肠癌(Hahn等人，1996年; Woodford-Richens等人，2001年)。相比之下，微卫星不稳定肺癌中未检测到转化生长因子-βⅡ型受体突变。Takenoshita等人，1997年肺癌中Smad 4突变率较低(7%)。Nagatake等人，1996年)。同样，许多乳腺癌和前列腺癌对转化生长因子-β介导的生长抑制具有耐药性，但很少含有转化生长因子-βⅡ型受体或smad突变(Schutte等人，1996年; Takenoshita等人，1998年; Bello-Deocampo和Tindall，2003年)。转化生长因子-β受体突变在12-31%的卵巢癌中发生。Wang等人，2000年; Francis-Thickpenet al.，2001年)，但许多耐转化生长因子-β的卵巢癌被发现表达功能受体(Yamada等人，1999年)。因此，许多肿瘤对转化生长因子-β介导的生长抑制的耐药不能完全源于转化生长因子-β信号通路核心成分的突变或缺失，而可能是由其他异常引起的。

同源框基因编码控制细胞分化的转录因子(麦金尼斯和克鲁姆劳夫，1992年). DLX 4(又报告为BP1) (Haga等人，2000年)是DLX同源盒基因家族，控制胚胎发育的许多方面，包括骨形态发生和骨骼模式(Panganiban和Rubenstein，2002年)。虽然DLX 4在大多数正常成人组织中不存在，但在白血病、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中广泛表达。Haga等人，2000年; Man等人，2005年; Hara等人，2007年; Tomida等人，2007年; Schwartz等人，2009年)。由于DLX 4在不同类型的肿瘤中表达，我们考虑了DLX 4控制多器官部位共同的致病机制的可能性。我们的研究表明DLX 4通过隔离Smad 4和Sp1，并诱导c-myc，从而阻断转化生长因子-β细胞静息程序的核心基因反应。DLX 4的这种阻断活性在一定程度上解释了为什么肿瘤细胞对转化生长因子-β的抗增殖作用具有抵抗力。

结果

DLX 4阻断转化生长因子-β-诱导的、依赖于Smad的反应

为了确定DLX 4是否阻断转化生长因子-β的抗增殖作用，我们最初使用非致瘤性肺上皮细胞株Mv1Lu。mv1Lu是一种成熟的p15诱导模型。Ink4B表达及生长停止(Renisdóttir等人，1995年; 冯等人，2002年)。TGF-β抑制Mv1Lu细胞生长的同时，DLX 4的表达增强了对TGF-β的抗性。图1a)。DLX 4在Mv1Lu细胞中的表达阻断转化生长因子-β诱导p15的能力Ink4B表达(图1b)。细胞周期分析显示DLX 4的表达抑制了G的诱导1转化生长因子-β(图1c)。DLX 4在非致瘤性乳腺上皮细胞株NMuMG中的强表达也能抑制转化生长因子-β诱导的G1逮捕(补充图1)。在反向实验中，我们确定了dlx 4在肿瘤细胞中的敲除是否增加了tft-β介导的生长抑制作用，这种抑制作用是针对肿瘤细胞中不同部位的短发夹RNA。DLX 4(sh90和sh92)。Westernblot证实，短发夹RNA对MCF-7乳腺癌细胞DLX 4有一定的敲除作用。图1d)免疫荧光染色和实时定量PCR(补充图2A和B)。对MCF-7细胞中DLX 4的敲除，可提高细胞活力测定对转化生长因子-β(TGF-)的敏感性(P<0.05)。图1e)，同时也增加了G中细胞的比例。1相(图1f).

因为转化生长因子-β也可以通过与Smad无关的机制抑制生长(Petritsch等人，2000年)，我们用Smad 4缺失的MDA-MB-468乳腺癌细胞系证实DLX 4阻断了Smad依赖性的生长抑制。转化生长因子-β不抑制mDA-MB-468细胞的生长。图1g)。另一方面，Smad 4在这些细胞中的重组增强了对转化生长因子-β(图1g)。这种对转化生长因子-β的反应被DLX 4所废除(图1g)。p21表达WAF 1/Cip 1转化生长因子-β诱导mda-MB-468细胞重组，dlx 4(图1h)。不论Smad 4的缺失或存在，DLX 4的强迫表达均能诱导c-myc水平(图1h)。我们进一步研究了dlx 4在c-myc诱导中的作用。MYC启动子活性c的活动-MYC转化生长因子-β对Mv1Lu细胞的启动子有抑制作用。图2a)。相比之下，DLX 4在Mv1Lu细胞中的表达诱导c-MYC启动子活性与转化生长因子-β信号无关(图2a)。反之，dlx 4在MCF-7细胞中的敲除则抑制c-MYC启动子活性和对转化生长因子-β-介导的抑制的敏感性增强图2b)。这些结果提示DLX 4阻断了转化生长因子-β/Smad依赖的c-myc表达抑制，并诱导c-myc水平与TGF-β/Smad信号无关。

p15的前113 bpInk4B启动子是转化生长因子-β诱导的必需基因，含有两个Smad结合元件；冯等人，2000年)。转化生长因子-β在Mv1Lu细胞中诱导了该启动子区的活性，这种诱导作用被sbes突变所阻断。图2c)。DLX 4在mv1Lu细胞中的表达阻断野生型p15的诱导Ink4B转化生长因子-β的启动子活性图2c)。DLX 4对sbe-突变启动子的活性也有一定的抑制作用。图2c)。为了证实DLX 4阻断了Smad依赖的转录，我们用MDA-MB-468细胞进行了报告。虽然野生型p15Ink4BSmad 4缺失的MDA-MB-468细胞中启动子活性对转化生长因子-β无反应，当Smad 4在这些细胞中表达时，启动子活性增强。当DLX 4共同表达时，这种依赖于Smad 4的反应性被消除(图2d).

转化生长因子-β除了具有抗增殖作用外，还具有诱导上皮向间充质转化的作用；Siegel和Massagué，2003年; Massagué，2008年)。由于DLX 4阻断了TGF-β-介导的生长抑制，DLX 4也可能阻断TGF-β诱导EMT的能力。为了解决这一问题，我们使用了NMuMG细胞株，这是一个建立良好的模型来研究转化生长因子-β诱导的胚胎移植。Smad 4在包括nmuMG细胞在内的多种细胞类型中对转化生长因子-β诱导的上皮细胞移植是必不可少的。Deckers等人，2006年)。转化生长因子-β处理载体控制的NMuMG细胞诱导上皮细胞向成纤维细胞的形态转变补充图3A)，E-cadherin的丢失和N-cadherin的上调(补充图3B和C)。DLX 4的强迫表达阻断了E-cadherin的下调和N-cadherin的诱导(补充图3B、C)。TGF-β处理+DLX 4 NMuMG细胞中上皮细胞形态明显保留。补充图3A)。同时，我们发现DLX 4阻断了转化生长因子-β-介导的、Smad依赖性的生长抑制，表明DLX 4抑制了转化生长因子-β/Smad信号通路的核心成分。

DLX 4阻断转化生长因子-β激活受体调节小分子的转录活性

Smad依赖的转录被控制在多个水平，包括磷酸化和核定位受体调节的Smad(R-Smad)。Shiand Massagué，2003年)。DLX 4不改变Smad 2表达或Smad 2磷酸化水平(图3a)。DLX 4也不影响TGF-β刺激后Smad 2的核易位。图3b)。DLX 4主要定位于细胞核，其定位不受TGF-β刺激的影响。补充图4A和B)。这些发现表明DLX 4可能抑制转化生长因子-β信号通路下游的核事件。

我们确定DLX 4是否抑制转化生长因子-βR-Smad的转录活性.构建了GAL 4 DNA结合区(DBD)与Smad 2(氨基酸173~467)的连锁区和Mad同源性2(MH2)转录激活结构域。该嵌合体在Mv1Lu细胞中共表达，萤火虫荧光素酶报告受5个串联GAL 4结合位点控制。转化生长因子-β诱导GAL4-Smad 2的转录活性，当DLX 4表达时，这种激活被阻断。图3c)。用肝癌细胞株HepG 2(图3c)。DLX 4的表达也阻断了转化生长因子-β介导的嵌合体激活，该嵌合体由GAL4-DBD融合到Smad 3的连接区和mh2结构域(氨基酸133-425)。图3)。另一方面，dlx 4在mcf-7细胞中的敲除增加了转化生长因子-β-介导的GAL 4-Smad 2和GAL 4-Smad 3活性。图3E和f).

Smad 2和Smad 3是转化生长因子-β受体的底物，而其他R-Smad(Smad 1、5和8)则被骨形态发生蛋白(Bmp)和抗穆勒氏受体(Shiand Massagué，2003年; 冯和德因克，2005年)。我们最初用一个由四个串联SBES(pSBE4-Luc)组成的合成启动子来测试DLX 4抑制TGF超家族其他成员诱导的转录的能力。DLX 4阻断转化生长因子-β和bmp-4对该启动子的诱导作用(图3g)。转化生长因子-β-和bmp特异性R-Smad优先结合不同的dna序列(Kusanagi等人，2000年; Korchynskyi和10 Dijke，2002年)。事实上，bmp-4在诱导pSBE4-Luc活性方面不如转化生长因子-β(图3g)。我们使用含有bmp应答启动子的报告质粒进一步测试dlx 4对bmp诱导转录的影响。Id1基因。DLX 4阻断BMP诱导Id1启动子活性(补充图5)。使用一个由两个串联拷贝组成的合成启动子，证实了DLX 4的阻断作用。Id1BMP响应元件(BRE-Luc)(图3h)。由于转化生长因子-β-和bmp特异性R-Smad利用Smad 4作为形成功能转录复合物的共同和必要的伙伴。Shiand Massagué，2003年)，我们的发现增加了DLX 4抑制Smad 4的可能性。

DLX 4防止Smad 4与R-Smad结合

我们随后确定DLX 4是否干扰Smad 4与R-Smads的结合。标记DLX 4或空载体转染HepG 2细胞后，用或不加转化生长因子-β处理HepG 2细胞。Smad 2免疫沉淀，用Smad 4抗体进行免疫印迹分析。当DLX 4表达时，Smad 4与Smad 2的结合受到抑制。图4a)。我们通过免疫共沉淀Smad 4和检测沉淀中的Smad 2证实了这些发现。图4a)。DLX 4还阻止Smad 4与SMAD 3(图4a)。DLX 4没有改变Smad表达水平(图4b)。这些结果提示DLX 4可能通过阻止Smad 4与这些R-Smad的相互作用而抑制Smad 2和Smad 3的转录活性。

Smad复合物与靶基因启动子的结合亲和力和选择性取决于与其他dna结合因子的相互作用。Shiand Massagué，2003年; 冯和德因克，2005年)。最小p15Ink4B启动子包含两个与sbE相邻的Sp1结合位点，转化生长因子-β诱导它的过程包括Smad 4与sp1和R-Smads的结合(冯等人，2000年)。如其他人所报告(冯等人，2000年; Pardali等人，2000年)TGF-β刺激诱导−DLX 4细胞Smad 4与Sp1结合。这种结合不被DLX 4所抑制(图4c)。令人惊讶的是，在没有转化生长因子-β刺激的情况下，我们观察到+DLX 4细胞中Smad 4与Sp1的关联增加。图4c)。DLX 4没有改变Sp1(图4b)。为了确定dlx 4是否改变smad sp1-dna复合物的形成，我们使用含有p15核苷酸−108至−39的生物素化寡核苷酸进行dna下拉试验。Ink4B启动子，包括两个Sp1结合位点和SBE(图4d)。当−DLX 4细胞被转化生长因子-β刺激时，dna-蛋白复合物中的Smad水平增加。图4e)。相反，这种诱导在+DLX 4细胞中被抑制(图4e)。DLX 4也抑制sp1与p15的相互作用。Ink4B启动子(图4e)。为了证实DLX 4在更多生理环境中的阻断活性，我们进行了染色质免疫共沉淀(芯片)检测。如图所示图4f，R-Smads，Smad 4和Sp1与p15的关联Ink4B−DLX 4细胞经转化生长因子-β(TGF-β)处理后，用芯片法检测启动子的表达.相反，Smad和Sp1蛋白与p15相互作用Ink4B+DLX 4细胞(图4f)。这些发现共同提出了DLX 4与Smad和/或Sp1结合的可能性。

DLX 4直接绑定Smad 4

为了初步研究DLX 4与Smad 4在细胞中的联系，采用表达标志DLX 4的HepG 2细胞提取物进行免疫沉淀试验。在TGF-β刺激缺失和存在时与Smad 4相关的DLX 4图5a)。用MCF-7细胞提取物进行免疫沉淀试验，检测内源性DLX 4与Smad 4的相关性。图5b)。当DLX 4在这些细胞中表达短发夹RNA(图5b).

为了确定DLX 4是否通过直接结合与Smad 4相互作用，我们测试了离体翻译35S标记DLX 4与GST-Smad 4蛋白结合。GST-下拉试验表明DLX 4直接结合Smad 4(图5c)。DLX 4也绑定了Smad 2，尽管更弱(图5c)。我们试图通过检测截短的gst-dlx 4融合蛋白的结合能力来鉴定dlx 4的smad 4结合区。离体翻译35S标记Smad 4(图5d)。删除DLX 4的C端尾只会弱地影响其结合Smad 4的能力(图5e)。而DLX 4 DNA结合同源结构域的缺失则明显抑制其Smad 4结合能力。检测到DLX 4同源结构域与Smad 4的结合，但不像全长DLX 4所观察到的那样强(图5e)。我们还通过检测gst-dlx 4蛋白的结合能力，研究了smad 4的哪些结构域与dlx 4相互作用。离体翻译部分Smad 4蛋白(图5d)。DLX 4直接结合到Smad 4 Mad同源性1(MH1)结构域，而不是MH2结构域(图5f).

DLX 4也直接绑定sp1。

因为DLX 4直接绑定Smad 4(Smad 4也绑定Sp1)，所以我们确定DLX 4是否与Sp1交互。用转染HepG 2细胞的裂解物进行免疫沉淀试验，发现DLX 4与Sp1(图6a)。这种关联不依赖于转化生长因子-β的刺激。我们用MCF-7细胞提取物证实了内源性DLX 4在免疫沉淀实验中与Sp1相互作用的能力。图6b)。直接结合到离体翻译35S标记Sp1(图6c)。虽然DLX 4的N端结构域没有与Sp1结合，但强烈地检测到由同源结构域结合的情况(图6c)。我们还测试了gst-dlx 4蛋白直接结合的能力。离体翻译35s标记的sp1部分(图6d)。DLX 4不结合Sp1的N端结构域(氨基酸1-557)，但与其C端DBD(氨基酸557-778)结合；图6e)。在dlx 4存在下，与p15相关的配合物中sp1水平下降。Ink4B基因启动子在寡核苷酸下拉和芯片分析中的应用(图4E和f)。在凝胶移位实验中，我们观察到dlx 4与p15没有结合。Ink4B启动子序列，但阻止Sp1与启动子结合(图6f)。这些观察结果与dlx 4部分抑制sbe突变体p15活性的能力是一致的。Ink4B启动子包含完整的Sp1结合位点(图2c)。DLX 4的强制表达也抑制了由串联Sp1结合位点组成的合成启动子的活性(图6g)。相反，DLX 4的敲除刺激了Sp1驱动的启动子活性(图6g)。这些结果表明DLX 4对p15有抑制作用。Ink4B除阻止Smad 4与R-Smad的相互作用外，还通过隔离Sp1进行转录。

讨论

转化生长因子-β细胞静息程序是维持正常组织稳态所必需的，并受到包括smad蛋白、sp1和c-myc在内的转录因子网络的严格调控。Siegel和Massagué，2003年; Massagué，2008年)。在本研究中，我们报告了DLX 4，一种在多种恶性肿瘤中表达的同源结构域蛋白，通过对抗TGF-β细胞抑制程序的关键转录调控机制，阻断了TGF-β的抗增殖作用。

我们的研究表明DLX 4通过几种机制使转化生长因子-β细胞静息程序的转录调控失活。一种机制是隔离Smad 4，防止Smad 4与R-Smad结合。Smad相互作用也可能通过DLX 4与R-Smads的结合而被阻止，尽管我们观察到DLX 4与Smad 2的结合很弱。因为Smad 4和R-Smad通过它们的MH2域相互作用(Shiand Massagué，2003年)，我们发现DLX 4绑定Smad4MH1域是令人惊讶的。一种解释可能是DLX 4与MH1结构域的结合导致构象变化，以致Smad 4的MH2结构域无法与R-Smad进行交互。

同源盒基因编码的转录因子的特征是它们的螺旋dna结合同源结构域(麦金尼斯和克鲁姆劳夫，1992年)。我们发现DLX 4与Smad 4的结合部分是通过其同源结构域介导的，这就提出了特异性问题。事实上，Hoxc 8通过其同源域与Smad 1进行交互(Yang等人，2000年)。据报道DLX 1绑定Smad 4，但它的绑定区域和机制尚未定义(Chiba等人，2003年)。虽然同源性结构域在同源盒基因家族中是保守的，但家族成员对不同Smad和不同Smad结构域的特异性是显著的。DLX 3与Smad 6绑定，但不绑定Smad 4(Berghorn等人，2006年)。Hoxc 8与Smad 1(Yang等人，2000年)，而Hoxa 13结合Smad 1、Smad 2和Smad 5的MH2结构域，但不绑定Smad 4(Williams等人，2005年)。在同源结构域中，第三螺旋的残基是最保守的。第一和第二螺旋的保守残基可能支配优先结合到特定的Smad蛋白或Smad结构域。虽然其他同源结构域蛋白可能通过结合Smad来阻断TGF-β介导的生长抑制，但这种抑制的特异性在很大程度上取决于它们的表达情况。虽然大多数同源盒基因是以高度组织特异性的方式表达的，但DLX 4在不同的恶性肿瘤中都有表达(Haga等人，2000年; Man等人，2005年; Hara等人，2007年; Tomida等人，2007年; Schwartz等人，2009年)。目前还没有其他同源盒基因在肺、乳腺、卵巢、前列腺和血液学起源的肿瘤中普遍表达。因此，DLX 4对TGF-β-介导的生长抑制的干扰可能是多器官部位共同的机制之一。

Smad复合物与靶基因启动子的结合亲和力和选择性主要取决于与其他dna结合因子的相互作用。Shiand Massagué，2003年, 冯和德因克，2005年)。同样，据报道，几种同源结构域蛋白的结合亲和力和选择性受到与其他转录调节剂相互作用的调节(沈等人，1999年; Boogerd等人，2008年)。我们的研究是第一个证明同源结构域蛋白与Sp1直接相互作用并调节Sp1活性的报告。我们的发现表明DLX 4直接结合了Sp1的DBD，削弱了Sp1的DNA结合能力，但不阻止Sp1与Smad 4的结合。因为DLX 4与smad 4和sp1结合，我们推测dlx 4抑制p15。Ink4B转录，部分地，通过形成一个不活跃的DLX4-Smad-Sp1复合物。因为p21的转录WAF 1/Cip 1转化生长因子-β也通过sp1与smad蛋白的协同作用而诱导。Pardali等人，2000年)，DLX 4可能抑制p21WAF 1/Cip 1通过类似的机制转录。

我们的发现，DLX 4诱导c-myc的表达独立于转化生长因子-β信号，有两方面的意义。首先，c-myc的诱导提供了与TGF-β细胞抑制程序相竞争的有丝分裂信号.其次，dlx 4诱导的c-myc表达可能导致p15表达下调。Ink4B和p21WAF 1/Cip 1，因为这些基因的转录受到c-myc的抑制(冯等人，2002年; Gartel等人，2001年)。对p15的压制Ink4Bc-myc的转录与我们观察到的DLX 4有显著的相似之处.冯等人同样地，c-myc不与Sp1竞争，以获得与Smad的交互作用(冯等人，2002年)。这些作者推测c-myc与Sp1和Smad蛋白形成不活跃的复合物.然而，与我们对DLX 4的发现相比，c-myc并不抑制Smad 4和R-Smads之间的相互作用，也不抑制R-Smads的转录活性。本身 (冯等人，2002年)。此外，与dlx 4不同，c-myc不影响sp1与p15的结合。Ink4B启动子(冯等人，2002年)。因此DLX 4可能会抑制p15。Ink4B和p21WAF 1/Cip 1通过增加c-myc的表达，直接干扰Smad4-R-Smad相互作用和Sp1 DNA结合活性，实现转录.

同源盒基因在胚胎发育过程中对细胞分化具有重要的调控作用。越来越多的证据表明，肿瘤中特定同源盒基因的异常表达可以解除细胞生长的调控。例如,HOXA 5调剂p53乳腺癌的转录和沉默(Raman等人，2000年)。过度表达HOXB 7和HSIX 1卵巢肿瘤和乳腺肿瘤分别诱导成纤维细胞生长因子-2和细胞周期蛋白A1的表达。Naora等人，2001年; Coletta等人，2004年)。同源盒基因在肿瘤中的异常表达被认为是一种不恰当的胚胎路径重组(阿巴特-沈，2002年; Samuel and Naora，2005)。DLX 4阻断转化生长因子-β信号传导的能力可能与其功能有关。DLX控制骨形态发生和骨骼形态形成的基因Panganiban和Rubenstein，2002年)。这些过程受到TGF超家族成员的严格控制。由于DLX 4与Smad 4结合，DLX 4也可能阻断TGF超家族其他受体发出的信号。事实上，DLX 4抑制BMP-4(图3g和h; 补充图5)。据报道，BMPs和BMPS之间有几种交叉调节的相互作用。DLX正常细胞分化过程中的基因。bmp-2激活DLX 3转录(Park和Morasso，2002年)，而BMP信号的拮抗剂Smad 6则抑制DLX 3的转录活性(Berghorn等人，2006年)。有趣的是，我们观察到TGF-β刺激后细胞中DLX 4蛋白水平下降。图1h)。DLX 4可能是阻断转化生长因子-β信号传导的调节环的一个组成部分，反过来也是由转化生长因子-β调节的。这种反馈机制可能在控制正常胚胎发生和稳态方面起着重要作用。

对转化生长因子-β介导的生长抑制的耐药性是大多数肿瘤发病机制中的一个重要特征。这种耐药性是由于转化生长因子-β受体或smad突变在几种类型的肿瘤，特别是胃肠道和胰腺起源。Markowitz等人，1995年; Hahn等人，1996年; Watanabe等人，2001年; Woodford-Richens等人，2001年)。肿瘤细胞对转化生长因子-β的抗增殖作用也可能是通过抑制转化生长因子-β受体的表达而产生的。Tokunaga等人，1999年)和p15Ink4B删除(Gima等人，1996年)。DLX 4阻断转化生长因子-β细胞抑制程序关键转录调控机制的能力，可以解释为什么缺乏转化生长因子-β信号通路核心成分异常的肿瘤会对转化生长因子-β的抗增殖作用产生抵抗性。

肿瘤中转化生长因子-β信号通路的一个显著方面是其两期功能.许多肿瘤对转化生长因子-β的抗增殖作用有抵抗性，但保留了其他促进转化生长因子-β(转化生长因子-β)的机制。Siegel和Massagué，2003年; Massagué，2008年)。人们一直认为转化生长因子-β途径的核心成分在这些肿瘤中仍有功能，而下游像差(如p15)则被认为是正常的。Ink4B(删除)禁用该通路的生长抑制臂(Siegel和Massagué，2003年; Massagué，2008年)。DLX 4通过固定Smad 4使核心通路失活，并可能阻断TGF-β的促转移功能。事实上，DLX 4对转化生长因子-β诱导的NMuMG细胞EMT有明显但未完全抑制的作用。补充图3A-C)。DLX 4抑制转化生长因子-β诱导的EMT的能力可以解释DLX 4与肺癌患者良好预后的关系及其抑制转移的作用。Tomida等人(2007年)..然而，据报道，卵巢癌和乳腺癌中的DLX 4水平与疾病进展有关(Man等人，2005年; Hara等人，2007年)。这一悖论有几种可能的解释。转化生长因子-β不仅通过Smad依赖的机制诱导EMT，而且还通过与MAP激酶和RhoA激活有关的Smad无关途径诱导EMT。Moustakas和Heldin，2005年)。DLX 4可能不抑制TGF-β诱导的、促进细胞迁移的非Smad途径。DLX 4还可通过持续诱导c-myc等其他机制促进肿瘤的进展.此外，我们还发现DLX 4通过诱导血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2的表达而促进肿瘤血管生成。Hara等人，2007年)。导致DLX 4在肿瘤中过表达的机制尚不清楚。这个DLX 4基因定位于17q21.3-q22区域，这是一个染色体“热点”，在∼10%的乳腺癌和卵巢癌(Hyman等人，2002年)。然而，DLX 4过表达发生在这些肿瘤中的50%以上(Man等人，2005年; Hara等人，2007年)，表明基因扩增并不是这种过度表达的唯一机制。

与Hedgehog、Wnt和Notch信号通路一样，同源盒基因网络越来越被认为是胚胎发育与癌症密切相关的重要枢纽。已知的发育模式是由同源盒基因与转化生长因子超家族成员之间的相互作用决定的，但这是第一次将异常表达于肿瘤中的同源盒基因与对转化生长因子-β的细胞静息活性有抗性的同源盒基因联系在一起的报道。未来的研究，由这类有趣的模式调节控制的路径，将提供重要的洞察的多个步骤的肿瘤过程。

材料和方法

质粒

这个DLX 4补充DNA在其他地方有描述(Haga等人，2000年; Hara等人，2007年). DLX 4片段被亚克隆到pET 41 GST载体(Novagen，Gibbstown，NJ，USA)中。DLX 4非靶向性短发夹RNA是从Origene技术公司购买的(美国马里兰州罗克维尔)。GST-Smad 2和GST-Smad4质粒由刘芳(Rutgers大学)提供。斯玛从Origene技术获得互补DNA，亚克隆到含有GAL 4 DBD(Stratagene，La Jolla，CA，USA)的PFA-CMV质粒中。GAL 4驱动的PRF-Luc报告结构是从Stratagene购买的。pGL 2萤火虫荧光素酶报告载体是从美国麦迪逊州普罗米加购买的。PBV-Luc、pSBE4-Luc和PBV-MYC(Del4)报告构造(He等人，1998年; Zawel等人，1998年)由伯特·沃格尔斯坦(JohnsHopkins大学；Addgene质粒16539、16495和16604)提供。SP1互补DNA由解克平(MD Anderson癌症中心)提供。CignalSp1报告结构是从SABiosciations购买的(弗雷德里克，医学博士，美国)。萤火虫荧光素酶野生型和突变体p15的构建Ink4B启动子序列(冯等人，2000年)由王晓凡(杜克大学医学中心)和贝勒医学院(新华峰)提供。这个Id1启动子构建由RobertBenezra(纪念斯隆-凯特琳癌症中心；Addgene质粒16048；Tournay和Benezra，1996年)。BRE-Luc记者结构(Korchynskyi和10 Dijke，2002年)由Peter ten Dijke(荷兰癌症研究所)提供。

抗体和其他试剂

Abs的来源如下：DLX 4(美国剑桥；Abnova，台湾台北)；Smad 2，磷Smad 2(Ser465/467)，SMAD 3，Smad 4，p15Ink4b和c-myc(细胞信号技术，Danvers，MA，美国)；p21WAF 1/Cip 1(加利福尼亚州圣迭戈CalBiochem)；Sp1和E-cadherin(Zymed，San Francisco，CA，USA)；N-cadherin(BD生物科学，圣何塞，CA，USA)；肌动蛋白和标志(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)；Smad 2/3和lamin A/C(Santa Cruz生物技术，圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国)。重组Sp1蛋白、转化生长因子-β和BMP-4分别来自Promega、Sigma-Aldrich和R&D系统(美国明尼阿波利斯市)。

细胞株及转染

细胞系来源如下：Mv1Lu，MDA-MB-468和NMuMG(美国式培养，Manassas，VA，美国)；HepG 2，Ampho-293和MCF-7(Michelle Barton，Douglas Boyd，Francois-Xavier Claret，MD Anderson癌症中心)。瞬时表达，用FuGENE 6试剂转染细胞(罗氏，印第安纳波利斯，IN，美国)。用于生成稳定的线条，有标记的DLX 4将互补DNA亚克隆到pRetroQ载体(Clontech，Palo Alto，CA，USA)中，用逆转录病毒转染Ampho-293细胞。培养2天后取上清液感染靶细胞。用普罗霉素(0.5μg/ml)筛选稳定株系。

生长分析和细胞周期分析

细胞接种于96孔板中，培养2天，浓度为0~100 ng/ml，用3-(4，5-dimethylthiazolyl-2)-2，5-diphenyltetrazoliumβ法检测细胞增殖。细胞周期分析：将细胞接种于10 cm培养皿中，第二天汇合率达30%。血清饥饿后，在完全培养基中加入转化生长因子-β培养18h，取细胞，用70%乙醇固定，用碘化丙酸染色流式细胞仪测定细胞周期的分布。

记者分析

将细胞接种于12孔板中，与表达质粒(400 Ng)、萤火虫荧光素酶报告质粒(100 Ng)和PRL-CMV雷诺荧光素酶报告质粒(0.5ng；Promega)共转染，使转染效率恢复正常。转染后24h，再用转化生长因子-β或bmp-4体外培养18 h。用双荧光素酶报告试剂盒(Promega)测定荧光素酶活性。

免疫荧光染色

细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100渗透。Abs染色于Smad 2、DLX 4、E-cadherin或标志(1：200)，用Alexa Fluor 594结合次级抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色。

免疫沉淀和免疫印迹

用M-Per缓冲液裂解细胞制备全细胞提取物(皮尔斯生物技术，罗克福德，美国).用细胞裂解缓冲液(10m)裂解细胞制备核提取物。MHEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic酸)，pH 7.9，1.5mM氯化镁2，10米MKCL，1米M(二硫苏糖醇加蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，然后在800下离心g10分钟。核子球在核缓冲液中溶解(20米)。MTris-HCl，pH值8.0，100米MNaCl，1%壬基磷-40(NP-40)，10%甘油和2mM(EDTA)，12 000离心g10分钟后收集上清液。用蛋白G-琼脂糖预清核提取物。将5 0 0μg的核仁提取物与抗体在4°C下孵育4~12 h，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法对免疫沉淀进行洗涤。

寡核苷酸下拉试验

用链霉亲和素琼脂糖在4℃下预清30 min，与p15的核苷酸−108和−39相对应的生物素化寡核苷酸孵育一夜。Ink4B启动子(图4d)。用绑定缓冲液(10米)清洗珠子。MHEPES，pH 7.9，100米MKCL，5米M氯化镁2，1米MEDTA，10%甘油，1米M二硫苏糖醇和0.5%NP-40)。洗脱DNA结合蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹。

晶片

芯片检测采用芯片分析试剂盒(Upstate BioTechnology，Temecula，CA，USA)，对制造商的协议进行了修改。细胞经1%甲醛交联后用甘氨酸中和。用SDS裂解缓冲液溶解细胞，经超声处理，产生长度为200~1000 bp的DNA片段。用蛋白G-琼脂糖预清剪切染色质，并与4μg的Sp1和Smad Abs共同孵育一夜。蛋白DNA复合物经G-琼脂糖沉淀，免疫沉淀复合物洗脱，交联逆转.用纯化的dna进行PCR反应，扩增p15的535 bp片段。Ink4B启动子使用以下引物：Sense，5‘-TATGTTGACTATTATCAACAG-3‘；反义，5’-GCAAAGAATTCCGTTCAGCT-3‘。扩增片段经DNA测序证实。

离体结合试验

产生gst-dlx 4和gst-smad融合蛋白。大肠杆菌..这个35合成了S标记的DLX 4，Smad 4和Sp1。离体转录/翻译(Promega)从T7启动子，并与谷胱甘肽-Sepharose珠结合的1μg GST融合蛋白孵育2h(GE Healthcare，Piscataway，NJ，美国)。用绑定缓冲液(20米)清洗珠子。MTris-HCl，pH值8.0，100米MNaCl，0.1%NP-40和2mM(EDTA)相关蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影观察.

凝胶移位试验

重组Sp1(100 Ng)与大量的离体翻译标志-DLX 4和标志标签在23°C下20分钟在绑定缓冲器(10米)中MTris-HCl，pH值7.5，1米M氯化镁2、50米MNaCl，0.5米MEDTA，4%甘油，0.5mM二硫苏糖醇和1μg聚(di-dc)。总共，1纳克32含有p15的−88至−64序列的P标记寡核苷酸Ink4B启动子(图4d)加入到结合反应中，再孵育20 min。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA-蛋白质复合物，用放射自显影法观察.

缩略语

AB：: 抗体
BMP：: 骨形态发生蛋白
DBD：: DNA结合域
EMT：: 上皮间充质转换
F-Luc：: 萤火虫荧光素酶
知识产权：: 免疫沉淀
R-Luc：: 肾荧光素酶
R-Smad：: 受体调节的Smad
转化生长因子-β：: 转化生长因子-β