乳腺癌中Leptin促血管生成信号与IL-1信号的关系

背景：

瘦素(Leptin)和白介素-1(IL-1)上调血管内皮生长因子(VEGF)，促进血管生成，与乳腺癌预后差有关。然而，目前尚不清楚瘦素是否对IL-1有调节作用，这些作用是否与瘦素诱导VEGF/VEGFR 2在乳腺癌中的表达有关。

方法：

本文采用遗传和药理学的方法，探讨了IL-1系统瘦素调节的机制。α，IL-1β、IL-1Ra、IL-1R、Ti，以及IL-1信号对Leptin诱导的小鼠乳腺癌4T1细胞VEGF/VEGFR 2表达的影响(一种类似于浸润性和高转移性的人乳腺癌模型)。

结果：

瘦素增加了IL-1系统各组成部分的蛋白质和mRNA水平.IL-1的上调涉及瘦素激活JAK 2/STAT 3、MAPK/ERK 1/2、PI-3K/AKT 1、PKC、p38和JNK。瘦素诱导的mTOR/4e-BP 1磷酸化增强IL-1β和IL-1Ra的表达，但下调了IL-1的表达。α..瘦素对IL-1的上调作用α启动子与SP1和NF-κb转录因子。此外，瘦素对瘦素受体(Ob-Rb)有上调作用.有趣的是，瘦素对VEGF/VEGFR 2的上调部分是由IL-1/IL-1R的ti信号介导的.

结论：

我们首次发现瘦素可以诱导多种信号途径上调乳腺癌细胞中IL-1系统的转录和翻译表达。此外，Leptin上调VEGF/VEGFR 2的表达受IL-1信号阻滞的影响.这些数据表明，乳腺癌中的瘦素促血管生成信号与IL-1信号有关，部分受其调控。

肥胖是美国的一种流行病，每年在美国有超过10万例癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌和子宫内膜癌。与非肥胖相比，肥胖乳腺癌患者的死亡率增加。Whiteman等人，2005年)。肥胖对乳腺癌患者的生存产生负面影响，而不论更年期状况如何，因为肥胖与复发风险增加和乳腺癌对雌激素无效的比例增加呈正相关(Dling等人，2001年)。肥胖基因配体(Leptin)是一种16 kDa细胞因子，主要由脂肪组织产生.女性、绝经后妇女和肥胖者体内瘦素水平较高。瘦素是一种促血管生成、促炎和促有丝分裂因子，其作用通过与细胞因子/生长因子的相互干扰而增强。Caldefie-Chézet al，2005年; Gonzalez等人，2006年; Rene Gonzalez等人，2009年; Jarde等人，2010年).

乳腺癌细胞表达的瘦素及其受体Ob-R水平高于正常乳腺细胞(Miyoshi等人，2006年Leptin/Ob-R水平与乳腺癌转移和低生存率之间存在显著的相关性。此外，瘦素的研究OB/ob)和Ob-R(DB/db)突变小鼠提供了令人信服的数据，支持瘦素在乳腺癌发展中的作用。这些瘦素信号缺乏的肥胖小鼠的乳腺肿瘤发病率明显低于瘦素白蚁。MMTV/TGF-α小鼠有发展乳腺肿瘤的倾向，但当与瘦素/Ob-R缺乏的小鼠杂交时，其后代的乳腺肿瘤发病率降低。Cleary等人，2003年, 2004)。此外，我们发表的数据强烈地表明，瘦素是乳腺癌发展的一个重要因素。我们已经证明了对瘦素信号的抑制离体和体内我们的新型瘦素肽受体拮抗剂(PEG-LPrA)能显著降低缺氧前血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(VEGFR 2)的水平。Gonzalez-Perez等人，2010年)在乳腺癌和间质细胞中，同时减少同基因肿瘤的建立和生长。Gonzalez等人，2006年)、异种移植物(Rene Gonzalez等人，2009年)和7，12-二甲基苯(A)蒽诱导肥胖(未发表)小鼠乳腺癌模型。

肿瘤生长和转移成功的关键事件之一是由免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞和基质细胞产生的多种细胞因子促进血管网络的生长。白血病抑制因子(VEGF)、白细胞介素-1(IL-1)和瘦素(Leptin)是已知的乳腺癌细胞表达的血管生成因子。Apte等人，2006年a, 2006年b)。异常的炎症反应超过正常的免疫促进肿瘤的发展。乳腺癌中IL-1水平升高(Miller等人，2000年)。IL-1家族是一种主要的促炎细胞因子，由两种配体组成：il-1。α和IL-1β，一种受体拮抗剂：IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)和两种受体：IL-1R ti(Ⅰ型受体)和IL-1R Tii(Ⅱ型受体)(Boraschi等人，1996年)。IL-1Rti是一种80 kDa蛋白，其胞浆结构域约为215个氨基酸.IL-1Rti是唯一负责在IL-1结合上传递信号的受体.相反，IL-1R Tii，一种60 kDa的短细胞质结构域(29个氨基酸)蛋白，是降低IL-1水平的诱饵靶点。IL-1Ra是一种抑制蛋白，能与IL-1R、Ti或IL-1R Tii结合，具有相似的亲和力，不引起细胞信号传导效应。因此，IL-1Ra是IL-1信号的天然抑制剂(Apte等人，2006年a, 2006年b).

IL-1是已知的VEGF在不同组织中表达的诱导剂，被认为是肿瘤发生发展的一个因素。Carmi等人，2009年; Valdivia-Silva等人，2009年)。巨噬细胞是由肿瘤细胞和其他细胞在肿瘤微环境中产生的趋化因子、细胞因子和生长因子(包括血管内皮生长因子)被吸收到肿瘤中的。反过来，巨噬细胞和肿瘤细胞分泌IL-1，通过促进血管生成、基质重塑、侵袭和转移(Chen等人，2009年)。值得注意的是，外源性IL-1Ra抑制IL-1信号对裸鼠肿瘤血管生成有负性影响(Voronov等人，2003年).

虽然瘦素参与肿瘤进展的机制尚不清楚，但我们公布的数据表明，特异性瘦素信号增强了乳腺癌细胞的增殖和VEGF/VEGFR 2的表达。Gonzalez等人，2006年; Rene Gonzalez等人，2009年; Gonzalez-Perez等人，2010年; 郭等人，2010年)和子宫内膜癌(Carino等人，2008年)，以及子宫内膜异位症(Styer等人，2008年)。瘦素和白介素-1的相关表达已在几种病理情况下被描述.在子宫内膜癌细胞中，瘦素诱导IL-1系统表达。Carino等人，2008年)。瘦素和IL-1信号可激活NF-κb和增加可能与乳腺癌进展相关的VEGF和bcl-2水平(Caldefie-Chézet al，2005年)。因此，Leptin和IL-1可能在乳腺癌的进展中具有协同作用.此外，他们之间的关系可能更明显的肥胖(显示更高的瘦素水平)比在瘦个人。

尽管如此，瘦素(Caldefie-Chézet al，2005年; Gonzalez等人，2006年; Rene Gonzalez等人，2009年; Gonzalez-Perez等人，2010年; 郭等人，2010年)和IL-1系统(Kumar等人，2003年; Voronov等人，2003年)似乎在肿瘤血管生成和生长中起着重要作用，目前还没有关于瘦素和IL-1信号在乳腺癌中的潜在关系的数据。我们推测瘦素诱导的乳腺癌进展可能与调节IL-1系统表达和激活NF-1有关。κb和/或次级方案1。此外，Leptin诱导的IL-1可能与Leptin上调乳腺癌血管生成因子VEGF/VEGFR 2有关。为了验证瘦素诱导的激酶抑制剂的这一假说，将转录因子的RNA敲除和IL-1基因启动子的荧光素酶报告子应用于小鼠乳腺4T1细胞，这是一种类似于人类浸润/转移期Ⅳ期乳腺癌的模型。Gonzalez等人，2006年; Gonzalez-Perez等人，2010年)。目前的数据表明，瘦素在转录和翻译水平上调了IL-1系统。值得注意的是，Leptin诱导的VEGF和VEGFR 2水平的增加被阻断了IL-1信号。因此，Leptin在乳腺癌中的促血管生成作用可能与IL-1信号有关，或部分受其调控。

试剂和抗体

重组小鼠瘦素与IL-1β，IL-1αIL-1Ra和VEGF ELISA试剂盒来自美国明尼阿波利斯市的研发系统。胎牛血清来源于美国西萨克拉门托的双子座生物制品(WestSacramento)，RPMI-1640培养基和美国马纳萨斯(Manassas，VA，美国)产青霉素-链霉素鸡尾酒。从圣克鲁斯生物技术公司获得抗IL-1Rti、Ob-R-NH2、Ob-Rb-COOH、山羊IgG2b、SP1小干扰RNA和对照siRNA-A抗体。(美国加利福尼亚州圣克鲁斯)。抗IL-1抗体α，IL-1β、mTOR和β-肌动蛋白来自AbCAM公司。(美国马里兰州剑桥)。PERK 1/2/pMAPK(Thr 202/Ty204)、pmTOR(S 2448)、p4E-BP1(Ser65)和p70S6激酶-1(Ser371)的抗体来源于细胞信号转导(Danvers，MA，USA)。抗膦AKT 1/PKBα(Ser473)来自上州(美国纽约州普莱奇湖)。辣根过氧化物酶结合物，iScript cDNA合成，IQ SYBR绿色混合蛋白和蛋白质测定试剂盒来自生物RAD实验室(大力士，CA，美国)。ECL Westernblot剥离缓冲液来自热科学公司(Rockford，IL，USA)。从美国麦迪逊市的Promega公司获得双荧光素酶检测系统和pgl-3质粒.NF-κB1小鼠短发夹RNA来源于Origene(美国马里兰州罗克维尔)。核提取试剂盒来自活性基序(Carlsbad，CA，USA)。RNeaseDNase试剂盒和SuPerfect转染试剂是从美国加利福尼亚州瓦伦西亚市的齐根公司获得的。Wortmannin、AG 490、PD 98059、G 6976、SB 203580、SP 600125、雷帕霉素、RIPA缓冲液、无内皮质粒maxiprep试剂盒、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒等来自Sigma-Aldrich(美国圣路易斯，MO)。

细胞培养

小鼠乳腺肿瘤细胞株4T1(CRL-2539；美式培养集)在无涂层平板(细胞密度为1.0、2.0或4.0×10)上培养。5如上文所述，24、12或6井板的每井单元数(Gonzalez-Perez等人，2010年)。半合流细胞在不含胎牛血清的基础培养基(RPMI-1640)中饥饿24h，用不同的化合物处理。在所有实验中，用不同的细胞制剂至少重复三次井、管和反应。

瘦素剂量效应与时程效应

4T1细胞经上述饥饿处理后，在含瘦素(0、0.6、1.2和6.25n)的培养基中孵育24h。M，相当于0、10、20和100纳克毫升。−1)。用细胞裂解液和培养上清液分别用ELISA法、westernblot法和实时RT-PCR法检测瘦素对IL-1系统组成蛋白和mRNA水平的影响。Leptin时程效应分析：用1.2n处理4T1细胞。MLeptin作用0、4、8、12、24和48h，用Bradford法(Bio-Rad实验室)测定细胞裂解液中的蛋白质浓度，Westernblot检测IL-1Rti水平。

瘦素介导的特异性激酶对IL-1系统的影响

1.2n孵育4T1细胞M瘦素和激酶抑制剂(AG 490，JAK 2/STAT 3，30)μM；PD 98059 for MEK/MAPK/ERK 1/2，30μM；Wortmannin用于PI-3K/AKT 1，20μMG 6976，PKC-Ca依赖者，30岁μMp38激酶SB 203580，30μMSP 600125用于JNK，30μM；和雷帕霉素20μM用ELISA法和westernblot法分别测定上清液和细胞裂解液中IL-1系统组分的蛋白水平。

报告基因转染与荧光素酶分析

半合流的4t1细胞与50 ngα的瞬时共转染。雷尼拉报告型荧光素酶控制质粒和500 ng的pGL 3-IL-1α质粒(由Eugenie S Kleinman博士和德州大学MD安德森癌症中心曹营博士提供)。共转染3h后，用1.2n孵育细胞。M测定24h瘦素和荧光素酶活性。正常化是基于共转染雷尼拉荧光素酶活性

RNA提取与实时RT-PCR

从4T1细胞中提取RNA，用SuperScriptⅡ逆转录酶合成第一链cDNA。该cDNA被用作实时RT-PCR反应的模板，如下文所述：Gonzalez-Perez等人，2010年)。为产生标准曲线，将扩增的cDNA用于每反应10 0~0.16 ng cDNA的五倍稀释法。用甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达值计算相关基因的表达.实验中使用的引物如下：小鼠IL-1。α前进：5‘-TCGGGAGGACTCTA-3’和反向：5‘-AGGGGTCTCACCCTGTG-3’；小鼠IL-1βforward：5′-TGCACTACAGGCTCCGAGAT-3′and reverse：5′-CGTTGCTTGGTTCTCCTTGT-3′；mouse IL-1Ra forward：5′-TGTGTTCTTGGGCATCCAC-3′and reverse 5′-TTCTCAGAGCGGATGAAGGT-3；mouse IL-1R tI forward：5′-GTCTTGGAGGGACAGTTTGG-3′and reverse：5′-CAGCTGAAGCCTCCCATATC-3′；mouse VEGFR2 forward：5′-GTGATTGCCATGTTCTTCTGGC-3′and reverse：5′-TTCATCTGGATCCATGACAA-3′；mouse VEGF forward：5′-TACCTCCACCATGCCAAGTGGT-3′and reverse：5′-AGGACGGCTTGAAGATGTAC-3′.以GAPDH为内部对照，采用以下引物：正向：5‘-TGCACCAATGCTTAG-3’和反向：5‘-GGATGCAGGATGGATGTTC-3’。

westernblot分析

经细胞因子及抗体处理后，制备了细胞裂解物，以供其他地方所述的westernblot(Gonzalez-Perez等人，2010年). β-肌动蛋白为对照。

流式细胞术测定

4T1细胞在基础培养基中孵育24h(同步细胞)，再与1.2n细胞孵育。M瘦素作用24小时后，细胞被重新分散、渗透，并与NH2(所有异构体)和C-末端(长异构体)Ob-R结构域的抗体共同孵育(见下文)。Gonzalez等人，2003年)。羊抗-β-肌动蛋白抗体为阳性对照。采用荧光激活细胞分选(BD FACScan，Becton Dickinson，Franklin Lake，NJ，USA)和BD FACSDiva(Becton Dickinson)和Flowjo(TreeStar，Ashland，OR，USA)软件对细胞进行分析。

免疫细胞化学

瘦素对IL-1系统表达4T1细胞(5×10)的影响5在免疫细胞化学处理的玻璃玻片(BD Falcon，Belford，美国)中培养，与1.2n孵育。M瘦素与抗IL-1抗体α，IL-1β和IL-1R Ti(Johnston等人，2008年)。阴性对照者省略了一次抗体。

RNA敲除

用SP1 siRNA寡核苷酸(NF-)共转染4T1半合流细胞。κB1 shRNA和pGL3-IL-1α质粒，1.2n处理MLeptin作用24h，按上述方法测定荧光素酶活性。

阻断IL-1Rti

1.2n孵育4T1细胞M瘦素与抗小鼠IL-1Rti抗体或非特异性物种匹配的IgG2b(0.1)μg毫升−1)。酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量聚合酶链反应(RTPCR)分别检测mRNA和VEGF蛋白的表达.Westernblot分析细胞裂解液中VEGF和VEGFR 2蛋白。

数据分析

学生的t-测试用于数据分析。数据以平均值±S.E.M表示。值P<0.05 were considered statistically significant. The model included the main effects of treatments and replicates.

瘦素对IL-1系统的剂量反应诱导作用

瘦素诱导IL-1系统各成分在蛋白和mRNA水平的表达。图1)。免疫组化法初步检测瘦素介导的IL-1蛋白水平的升高(P<0.01)。图1A)。瘦素(1.2n)M)IL-1蛋白水平增加。α，IL-1βELISA法检测IL-1Ra。瘦素效应呈钟状剂量反应模式。1.2n时瘦素对IL-1蛋白水平的上调作用M (图1B-D)。此外，瘦素对IL-1 mRNA的上调在较低浓度下表现出明显的变化，即0.6n。M (图1G-J)。Westernblot分析显示，瘦素在所有剂量下均能升高IL-1水平。α，IL-1β和IL-1R Ti(图1E和F).

瘦素诱导4T1细胞中IL-1系统的表达。(A用免疫细胞化学方法(放大倍数×40)测定瘦素诱导IL-1系统蛋白水平升高的典型结果。基础条件下的对照细胞：(Aa)无抗体；(Ac)IL-1α抗体；(Ae)IL-1β抗体；(Ag)IL-1Rti抗体。瘦素孵育细胞：(AB)无抗体；(Ad)：IL-1α抗体；(Af)IL-1β抗体和(Ah)IL-1Rti抗体。白介素-1配体的蛋白质水平(B，IL-1α; C，IL-1β)和拮抗剂(D，用ELISA法(Pg Ml)测定。−1(每毫克蛋白质)。(E免疫印迹法(WB)检测IL-1配体和受体的蛋白水平。(F)世界银行的结果正常化为β以肌动蛋白为对照，用ImageJ软件进行条带密度分析。IL-1配体mRNA水平G，IL-1α; I，IL-1β)，拮抗剂(H、IL-1Ra)和受体(J、IL-1R、Ti)，采用实时RT-PCR法测定.采用GAPDH作为内部对照。4T1细胞培养24h，瘦素诱导(0，0.6，1.2和6.2n)。M)如所述(见材料和方法)。(A)P<0.05 when comparing levels of protein or mRNA to control (basal). Data (mean±s.e.) are representative of the results derived from a minimum of three independent experiments.

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瘦素对IL-1系统的时程调节

瘦素(Leptin)作用24h后，4T1细胞IL-1系统各成分蛋白水平均升高(P<0.0 5)。图2A-E).

瘦素介导的时程反应对4T1细胞IL-1系统表达的影响。瘦素对IL-1蛋白水平的影响α (A)，IL-1β (B)，IL-1Ra(C)用ELISA法测定。细胞因子水平正常至基础状态(指定为1)，并以任意单位表达。IL-1Rti(D)免疫印迹法(WB)。(E)WB对IL-1R ti的检测结果被标准化为β以肌动蛋白为对照，用ImageJ软件进行条带密度分析。4T1细胞在1.2n的培养基中培养M瘦素作用0~48h(A)P<0.05 when comparing levels of protein to control (basal). Data (mean±s.e.) are representative of the results derived from a minimum of three independent experiments.

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参与调节IL-1系统的瘦素信号通路

瘦素升高IL-1水平α (图3A)，IL-1β (图3B)和IL-1Ra(图3C)。这些作用与瘦素诱导的典型信号通路(JAK 2/STAT 3、MAPK和PI3K/AKT 1)有关。同时，瘦素对IL-1的诱导作用β (图3B)和IL-1Ra水平(图3C)也与mTOR的激活有关。然而，mTOR似乎对IL-1起负调节作用。α (图3A)。此外，瘦素对IL-1的调节作用β (图3B)和IL-1Ra(图3C)在一定程度上涉及JNK、PKC和p38激酶。相反，几种瘦素信号通路参与了IL-1R-ti水平的升高(图3).

瘦素诱导的信号通路参与调节4T1细胞的IL-1系统。瘦素和激酶抑制剂对IL-1水平的影响α(A)，IL-1β (B)，IL-1Ra(C)和IL-1R Ti(D)ELISA法和Westernblot法。瘦素(0或1.2n)处理4T1细胞M)在JAK 2/STAT 3抑制剂存在下(AG 490，30)μM)，MEK/MAPK/ERK 1/2(PD 98059，30)μM)，PI-3K/AKT 1(Wortmannin，20μM)，PKC-Ca依赖者(G 6976，30μM)，p38激酶(SB 203580，30)μM)，JNK(SP 600125，30μM)和mTOR(雷帕霉素，20μM)信号通路。世界银行的结果被标准化为β以肌动蛋白为对照，用ImageJ软件进行条带密度分析。(A)P<0.05 and (b) P<0.01 when comparing levels of protein to control with or without inhibitors (basal), respectively. Data (mean±s.e.) are representative of the results derived from a minimum of three independent experiments.

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我们进一步评估了IL-1系统的瘦素调节参与了mTOR下游靶点4e-BP1和70S6K1的磷酸化。图4)。这些瘦素效应被雷帕霉素(图4A)。另一方面，Wortmannin可抑制AKT 1和4e-BP1的磷酸化，但对p70S6K1的磷酸化无明显影响。图4B)。相反，PERK 1/2的抑制不影响p4E-BP1或p70S6K1水平(图4C).

瘦素诱导4T1细胞mTOR、4e-BP 1和p70S6K1磷酸化。有代表性的westernblot结果表明，在用激酶抑制剂处理4T1后，瘦素诱导的mTOR及其下游靶点(4e-BP1和S6K1)激活：A)雷帕霉素(R代表mTOR)；(B)Wortmannin(W，用于PI-3K/AKT 1)和(C)PD 98059(MAPK的PD)。瘦素(0或1.2n)处理4T1细胞M)和抑制剂作用24小时。

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瘦素在IL-1调节中的作用α启动子

用瘦素孵育细胞可使IL-1活性提高50%以上。α启动子与对照(P<0.05) (图5A)。SP1和NF-的RNA沉默κB对瘦素介导的IL-1诱导的负性影响α记者活动(图5B).

瘦素诱导IL-1表达α基因。(A)Leptin转录激活IL-1α记者，(B)siRNA对SP1和NF-的影响κB4T1细胞瞬时转染IL-1α瘦素(0和1.2n)的报告构建及治疗M)和siRNA-SP1和shRNA-NF-κb用24小时测定荧光素酶活性(见材料和方法)，并以基础细胞或瘦素处理细胞的百分比表达。(A)和(B)P<0.05 when comparing levels of luciferase activity to control (basal) or leptin-treated cells, respectively. Data (mean±s.e.) are representative of the results derived from a minimum of three independent experiments.

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瘦素上调其在4T1细胞中的受体

4T1细胞在基础条件下表达Ob-R。瘦素诱导Ob-R总量增加(22%)；图6B)和Ob-Rb(26%；图6C)。这些结果提示瘦素主要促进功能全功能Ob-RB的表达.

瘦素上调4T1细胞OB-R表达。流式细胞术代表直方图测定瘦素对4T1细胞OB-R表达的影响。(A)阳性对照(β-肌动蛋白抗体)和阴性对照(同型匹配的非特异性IgG)，B)基础和瘦素诱导的OB-R所有亚型(抗OB-RNH2-末端抗体)的表达，C)基础和瘦素诱导的OB-RB(长异构体；抗OB-RbCOOH-末端抗体)的表达.4T1细胞在1.2n培养基中的培养M瘦素作用24h，与特异性抗体孵育，流式细胞仪分析。利用BD、FACSDiva和Flowjo软件对至少三个独立实验的数据进行了分析。

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IL-1Rti阻断对瘦素诱导VEGF/VEGFR 2表达的影响

瘦素诱导VEGF mRNA水平增加近两倍和三倍。图7A)和蛋白质(图7C)分别。同样，瘦素诱导了3倍和2倍的VEGFR 2 mRNA。图7B)和蛋白质(图7D)分别。IgG抗体的加入并没有改变瘦素介导的对VEGF的影响。图7A和图C)或VEGFR 2(图7B和图D)。阻断IL-1Rti功能显著损害瘦素对VEGF和VEGFR 2的影响(见图7 A-D).

阻断IL-1Rti对瘦素上调4T1细胞VEGF/VEGFR 2表达的影响。瘦素和IL-1Rti阻断抗体对VEGF水平的影响A、mRNA和C、蛋白质)和VEGFR 2(B、mRNA和D，蛋白)在4T1细胞中。Leptin(0，1.2n)孵育细胞M)和抗小鼠IL-1Rti抗体(0.1)μg毫升−1与非特异性物种匹配的IgG2b孵育细胞为阴性对照。用实时RT-PCR法检测VEGF和VEGFR 2 mRNA的表达，并对甘油-3-磷酸酶脱氢酶的表达进行正常化。ELISA法检测VEGF和VEGFR 2蛋白，WB法检测VEGF和VEGFR 2蛋白表达。用密度分析法(ImageJ软件)对WB的VEGFR 2结果进行分析，并将其归一化为β-肌动蛋白作为对照。(A)P<0.01 when comparing basal to leptin+control Ab and (b) P<0.05 when comparing leptin+IL-1R tI to leptin+control Ab. Data (mean±s.e.) are representative of the results derived from a minimum of three independent experiments.

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瘦素调节多种组织和病理条件下的炎性细胞因子，包括IL-1。Chala等人，2006年; Carino等人，2008年; Johnston等人，2008年)。然而，关于瘦素与IL-1在乳腺癌中的关系的研究尚不多见。Miller等人，2000年)。为了探讨瘦素是否能调节乳腺癌中的IL-1系统，我们使用了一株与人类浸润性乳腺癌非常相似的小鼠乳腺癌细胞系4T1。本研究的数据首次显示，瘦素上调了所有IL-1系统组分的翻译和转录表达。瘦素能激活4T1细胞的几条典型和非典型信号通路，主要导致SP1和NF-两种转录因子水平的升高。κ参与IL-1基因调控的B。此外，瘦素诱导的PI3K信号通路激活与pmTOR、p70S6K1和p4E-BP水平升高有关。瘦素对VEGF/VEGFR 2的上调部分依赖于IL-1信号。图8)。此外，瘦素还上调了自身的受体Ob-R，从而增强了瘦素对IL-1系统表达的作用。这些数据强烈表明瘦素、促炎和促血管生成作用密切相关。

瘦素在4T1细胞中调节IL-1系统的信号机制。瘦素在转录和翻译水平上调IL-1系统。瘦素典型信号通路(JAK 2/STAT 3、MAPK和PI3K/AKT 1)主要参与IL-1系统的上调。PI-3K/AKT 1的Leptin激活与mTOR及其下游靶点4e-BP 1的磷酸化有关，这可能与IL-1的上调有关。β和IL-1Ra。此外，mTOR对IL-1具有负调控作用。α..瘦素对IL-1的上调作用α启动子参与了SP1和NF-的激活κB.瘦素诱导的非典型信号通路(PKC、p38和JNK)对IL-1系统某些成分的表达有不同程度的影响。瘦素诱导VEGF/VEGFR 2系统的上调部分是由IL-1/IL-1Rti信号介导的.

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过度炎症反应引起的免疫抑制可能导致肿瘤的发生和肿瘤细胞的侵袭。Voronov等人，2003年)。多项研究表明，IL-1家族的细胞因子可能在乳腺癌微环境中调节肿瘤发生的活动中起着重要的作用。Miller等人，2000年; Pantschenko等人，2003年; Singer等人，2003年)。IL-1β激活NF-κB通路并诱导细胞迁移和增殖(Wang等人，2005年; Lewis等人，2006年; Streicher等人，2007年)。增加IL-1α表达与癌前转移相关伊-6和中-8)和抗凋亡基因(Traf-1和CIAP-2) (Bhat-Nakshatri等人，1998年; Newton等人，1999年; Patel等人，2000年)并与侵袭性和转移性癌症相关，导致预后不良(Miller等人，2000年)。此外，IL-1的功能多态性导致IL-1水平升高。α基因，增强肝细胞癌易感性(加奥等人，2009年)。来自IL-1 KO小鼠的数据强烈地表明，IL-1是决定肿瘤免疫与炎症平衡的关键因素。Voronov等人，2010年).

IL-1系统刺激肿瘤生长似乎依赖于肿瘤细胞与基质细胞的相互作用.在浸润性乳腺癌中发现IL-1系统成分含量和产量增加(Apte和Voronov，2002年)。然而，目前还没有关于乳腺癌中IL-1的瘦素调节的研究.此外，目前还缺乏关于肥胖患者中瘦素水平是否与乳腺癌中的IL-1水平相当的信息。事实上，肿瘤和脂肪细胞分泌的因子之一是瘦素，瘦素是一种小而多向的细胞因子，可能参与调节肿瘤相关的炎症反应。越来越多的证据表明瘦素在乳腺癌生长和肿瘤血管生成中起着重要作用。Vona-Davis和Rose，2009年; Ray和Cleary，2010年)。乳腺癌中瘦素/Ob-R水平升高与侵袭性肿瘤增多和预后恶化有关(克利夫兰等人，2010年)。Leptin和Ob-R均在癌组织中相对于非癌上皮过度表达。Ishikawa等人，2004年)。因此，我们目前的研究结果为进一步探索这些假设提供了可能性。

目前的结果表明，瘦素诱导Ob-RB的表达具有完全的信号传递能力.因此，肿瘤微环境中发现的高水平瘦素，无论来自肿瘤细胞还是脂肪细胞，都有可能促进肿瘤细胞Ob-R的表达，从而促进肿瘤的生长。Otvos等人，2008年)及促血管生成及炎症因子的表达(Guagnanet al，2003年)。此外，瘦素还通过上调Cdk 2和cyclinD 1水平而激活细胞增殖的多个基因。Dieudonne等人，2002年; Okumura等人，2002年).

瘦素浓度与正常体重个体血清(即10-20纳克毫升)相似。−1)诱导IL-1系统的表达。因此，肥胖人群血清中较高浓度的瘦素可能影响乳腺癌组织中IL-1的表达。瘦素诱导的IL-1Rti的表达涉及多个瘦素诱导的信号通路.而JAK 2和ERK 1/2主要参与IL-1配体和拮抗剂的上调。这些发现与瘦素在4T1细胞中上调Ob-Rb的能力是一致的.OB-RB是唯一能通过pSTAT 3信号的瘦素受体。Frühbeck，2006年)。此外，瘦素诱导的PKC和JNK信号通路的激活增加了IL-1Ra的水平。因此，可以预期生物过程会导致PKC的减少(即通过激活RAS癌基因)(Weyman等人，1988年)或JNK(即由NF-κB通道)(Bevers等人，2006年; De Smaele等人，2001年)能下调IL-1Ra，增加IL-1激动剂的作用。目前的研究结果表明，瘦素激活的SP1和NF-κB参与了IL-1的调节。α启动子

瘦素介导的mTOR激活，这是许多癌症中解除管制的一种途径。Bevers等人，2006年; Knight等人，2006年)，参与了IL-1系统的调控。事实上，瘦素激活的pAKT 1/mTOR/p4E-BP 1能提高IL-1的水平。β、IL-1Ra和IL-1Rti在4T1细胞中的表达。目前的数据表明α启动子受瘦素通过激活的SP1和NF-的调节作用。κ众所周知，SP1的激活通过表达多个下游基因来增强肿瘤细胞的血管生成和转移能力，包括血管内皮生长因子 (Shie等人，2001年)。目前，瘦素如何激活乳腺癌细胞中的SP1尚不清楚。

由于Leptin和IL-1都是促进VEGF表达的炎症和促血管生成因子，我们推测IL-1与Leptin的关系可能是肿瘤血管生成的重要事件。因此，阻断IL-1Rti可部分阻断瘦素介导的VEGF、VEGFR 2蛋白和mRNA的增加。这些数据强烈表明，Leptin在乳腺癌中的促血管生成信号可能部分由IL-1信号介导。这些细胞因子可以在乳腺癌中活跃地串扰，激发促进炎症和促血管生成的作用，从而促进肿瘤的生长。

炎症细胞因子的异常水平是乳腺癌的一个特征。本研究进一步支持瘦素通过增加促血管生成因子和促炎症因子的表达而在乳腺癌中发挥重要作用的观点。Leptin上调IL-1系统可进一步增强瘦素在乳腺癌中的作用.此外，Leptin和IL-1在乳腺癌进展中可能具有协同作用，促进VEGF/VEGFR 2的表达。Gonzalez等人，2006年; Rene Gonzalez等人，2009年; Gonzalez-Perez等人，2010年)和肿瘤巨噬细胞招募(CaO等人，2001年)这可能间接增强瘦素介导的血管生成效应和乳腺癌的生长。此外，VEGF信号转导也需要IL-1的诱导。Mills等人，2008年)。因此，了解这些不同的因素如何协同促进肿瘤的进展，可以导致更有效的联合疗法的发展，以对抗乳腺癌。