血液中MG53的持续升高可提高组织的再生能力，而不会损害代谢功能 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

血液中MG53的持续升高可提高组织的再生能力，而不会损害代谢功能

摘要

MG53是阳性TRIM-family蛋白质主持细胞膜修复反应。在这里,我们表明,MG53存在于血液循环作为myokine促进组织损伤修复和再生。转基因小鼠血液中持续海拔MG53 (tPA-MG53)有一个更健康和更长的寿命与同窝出生仔畜野生型小鼠相比。 tPA-MG53老鼠显示正常骨骼肌葡萄糖和胰岛素信号处理,和持续的海拔MG53在血液中不产生有害影响db / db老鼠。更重要的是,tPA-MG53老鼠显示显著的皮肤伤口愈合能力,增强肌肉性能,改善损伤修复和再生。重组人类MG53蛋白防止偏心contraction-induced小鼠的急性和慢性肌肉拉伤。我们的研究结果表明myokine MG53组织保护功能和现在MG53再生医学作为一个有吸引力的生物试剂没有干扰体内葡萄糖处理。

介绍

骨骼肌控制身体的运动,需要一个活跃的损伤修复机制来保持其完整性,肌肉纤维的contraction-relaxation常常导致肌纤维膜损伤。发展治疗方法改善肌纤维膜的完整性,促进受伤的肌肉纤维的再生肌肉生理学的研究仍然是一个主要挑战1,2,3.。除了作为一个收缩机,骨骼肌被公认为一个内分泌器官,分泌大量的myokines调节其他组织功能4,5,6,7,8。针对myokine骨骼肌的功能及其与其他组织的相声是一个有吸引力的手段提高人体的生理和病理条件下的再生能力。

MG53,三方主题(修剪)家族成员蛋白,质膜损伤修复中扮演着重要的角色9,10,11。 MG53零老鼠显示进步的骨骼肌病和再生能力下降造成的心肌细胞受损细胞膜修复功能9,10,12。 MG53也见于血液循环与肌肉收缩和分泌活动水平相关13,14,15,16。细胞外的应用重组人类MG53 (rhMG53)对膜蛋白保护各种类型的细胞破坏。当应用静脉注射,rhMG53改善病理与肌肉萎缩症,肺损伤,心肌梗死和急性肾损伤在啮齿动物和这些疾病的动物模型13,17,18,19。这些数据强调针对细胞膜修复的重要性在再生医学和现在MG53作为一个潜在的生物试剂恢复组织完整性在范围广泛的人类疾病。

除了细胞膜修复,MG53包含守恒的环与E3-ligase活动主题,可以调节其底物通过泛素蛋白酶降解途径。歌等。20.报道,MG53蛋白质在动物模型中增加糖尿病和建议MG53函数作为E3-ligase下调胰岛素受体底物1 (IRS-1),作为糖尿病的发展的诱发因素。然而,易建联et al。21和其他调查人员16,22,23观察正常MG53表达肌肉糖尿病小鼠模型和人类患者的样本。此外,早期的研究和基因敲除小鼠IRS-1显示没有明确的表型的II型糖尿病24,25因为其他国税局亚型的存在可能弥补IRS-1缺席26,27,28,29。因此,拟议的MG53作用介导糖尿病的表现差别IRS-1对这些缺乏生物基础。刘等人的最近的一份报告显示,心脏过度MG53诱导心肌病通过转录激活的过氧物酶体proliferation-activated受体(PPARα)30.。虽然这些研究提高安全的担忧MG53超表达对心血管和代谢功能,没有进行调查研究的生理影响提升MG53血液循环。

我们开发一个转基因小鼠模型持续海拔MG53在血液中以检查myokine MG53组织损伤修复和再生的功能。我们观察到tPA-MG53老鼠生活健康的寿命和显示增强的组织再生能力。生理生化研究表明,持续的海拔MG53在血液中不会影响身体的代谢葡萄糖和胰岛素信号处理的函数。

结果

小鼠海拔循环MG53是健康的

在啮齿动物,MG53骨骼和心脏肌肉组织中大量表达。可以在血液中检测到低水平的MG53在正常情况下13,14,16。测试myokine MG53功能在组织修复和再生,我们生成一个转基因小鼠模型与持续海拔MG53血液循环(tPA-MG53)(无花果。1)。促进MG53分泌到血液循环,增加了组织纤溶酶原激活物(tPA)序列的人类mg53互补脱氧核糖核酸。鸡beta-actin背后的tPA-MG53序列克隆启动子驱动转基因的表达。

免疫印迹分析显示中MG53蛋白水平升高的血清来源于tPA-MG53小鼠与野生型相比,同窝出生(无花果。1)。特异性抗体用来量化的血清水平的MG53提出了补充图。1。增强MG53 tPA-MG53老鼠的分泌在血液中保持在不同的年龄从2个月(年轻),10 - 12个月(中),22 - 24个月(旧)。平均血清水平的MG53 tPA-MG53老鼠~ 120倍高于野生型的同胞(无花果。1 b)。定量测定表明,血清水平的MG53 tPA-MG53老鼠为5997.1±2071.0 ng / ml (n= 9),和野生型小鼠的血清水平为50.4±32.8 ng / ml (n= 10)。 ELISA测定证实MG53水平升高的血清来源于tPA-MG53老鼠(补充图。2)。

相比明显海拔MG53的血液,骨骼和心脏肌肉来源于tPA-MG53老鼠只增加了边际同窝出生仔畜野生型小鼠(无花果。1 c)。除了本地乐队53 kDa的蛋白质,高分子量蛋白质高于53 kDa乐队在免疫印迹的骨骼肌tPA-MG53老鼠(图。1 c)。这可能代表了tPA-MG53蛋白质没有乳沟的tPA分泌肽未经处理的蛋白质分泌。我们还进行了免疫印迹non-muscle MG53表达的组织,如脑、肝、肾、肺,发现可衡量的积累MG53在这些组织(补充图。3.)。

tPA-MG53老鼠住在一个健康的寿命没有可观察到的所有主要重要器官的病理。三个五个老鼠存活超过36个月,而野生型控制老鼠死在30个月的年龄。对于那些tPA-MG53老鼠牺牲在32个月,组织学分析没有透露在任何重要器官(图明显的病理变化。1 d)。额外的H / E染色的组织样本来源于野生型和tPA-MG53小鼠在不同年龄提出了补充图。4。因此,持续提升MG53在血液中没有对整个身体功能产生不利影响。在跑步机测试中,32个月的岁tPA-MG53可能运行在一个性能水平与年轻的野生型小鼠(6个月)(见补充电影1)。

以前,我们表明,静脉注射1毫克/公斤rhMG53可以实现瞬态海拔MG53血液中的水平10 - 20µg / ml,衰变的半衰期时间~ 1 h在血液中18。这样的系统性管理rhMG53可以防止急性损伤骨骼肌,心脏,肾,肺在动物模型研究13,14,17,18,19。 tPA-MG53小鼠的血清水平MG53(~ 2 - 6µg /毫升)与外生rhMG53实现通过静脉注射管理的水平。这表明,治疗方法慢性海拔MG53在血液中可能是安全的。

tPA-MG53老鼠通常采取行动,血糖和胰岛素的挑战

作为TRIM-family蛋白质,MG53包含E3-ligase活动可能参与代谢功能的调制20.,21。歌等。20.报道,MG53基因敲除小鼠的表型显示瘦体重在正常饮食的条件下,对雌性(HFD)诱导身体增长与改善葡萄糖处理HFD治疗后。然而,这种观察其他调查人员尚未完成。具体地说,易建联et al。21与野生型相似的身体成长/ mg53−−老鼠HFD治疗后(见补充图。14在彝族等。21)。在补充图。5,我们提出了数据显示/ mg53−−小鼠与野生型老鼠体重增加的趋势在正常饮食条件。

tPA-MG53老鼠,我们没有观察到任何显著差异与野生型相比,他们的增长模式同窝出生时受到HFD治疗(图。2)。我们使用糖耐量测试(GTT)和insulin-tolerance测试(ITT)评估如果tPA-MG53老鼠表现出任何改变葡萄糖处理。丸小鼠挑战时腹腔内注射葡萄糖(1克/公斤),类似的观察葡萄糖处理tPA-MG53和野生型之间同窝出生6周,30周的年龄(无花果。2 b)。此外,野生型之间并没有明显的观测到ITT和tPA-MG53老鼠8周和32周的年龄(无花果。2摄氏度)。测量数据和ITT的老鼠在12周年龄提出了补充图。6。这些数据表明,持续的海拔MG53血液中的葡萄糖处理没有显著影响。

我们接下来进行免疫印迹分析骨骼肌组织来自于野生型和tPA-MG53老鼠,关注关键蛋白质胰岛素信号包含的组件,例如,IRS-1,胰岛素受体β(IR-β)和Glut-4。 Glut-4是主要的膜转运蛋白,促进insulin-mediated骨骼肌葡萄糖吸收。如无花果所示。二维,可比IRS-1水平和IR-β骨骼肌中发现来源于野生型和tPA-MG53老鼠。此外,没有可衡量的变化Glut-4骨骼肌蛋白表达的来自tPA-MG53老鼠(图。2 e)。这些测量是在多个重复实验(n= 6 - 10只老鼠,4-16月龄)(图2 e),观察骨骼肌在缓慢的抽动和快速抽动。先前的研究由阮等。31表明,粘着斑激酶(FAK)是一种潜在E3-ligase MG53生长的基质。我们进行了免疫印迹分析和发现的蛋白质水平FAK并不改变MG53 tPA-MG53肌肉(补充图。7)。此外,我们发现ERK表达野生型和tPA-MG53肌肉也保持类似的(补充图。7)。

进一步测试MG53在胰岛素信号传导中的作用,我们对待tPA-MG53小鼠和野生型的同胞与胰岛素(0.75 U /公斤,腹腔内)。如无花果所示。2 f,一种蛋白激酶的激活胰岛素是健壮的和类似tPA-MG53和野生型的肌肉。这些结果表明,过度的MG53并不改变骨骼肌的胰岛素信号。

我们还没有看到任何变化PPARα骨骼肌中表达水平来源于tPA-MG53小鼠与野生型相比肌肉(补充图。7)。总体而言,这些数据表明,小鼠持续海拔MG53血液中并没有出现代谢功能障碍。

tPA-MG53老鼠显示增强的损伤后修复能力

以前,我们表明,尽管MG53缺席角质细胞和成纤维细胞,皮肤结构被观察到显著的缺陷/ mg53−−老鼠,和这些动物显示延迟伤口愈合和异常疤痕32。 MG53出现在循环可能导致皮肤架构在生理条件下的维护。在这里我们使用了一个耳朵穿孔模式,已广泛用于哺乳动物伤口修复和再生33,分析水平的提高是否MG53在血液中可以恢复组织伤口愈合能力。

在这项研究中,一个单独的tPA-MG53鼠标与混合遗传背景的129 / Sv和C57BL / 6 j。这些老鼠也有循环MG53水平升高(图。3)。一个地地道道的1毫米耳洞是和监控为14天。 0线开枪关闭被拍到在天,7和10。如无花果所示。3 btPA-MG53老鼠显示显著增强ear-punch损伤后修复能力与野生型相比,他们的同胞。野生型老鼠没有愈合10天的观察而tPA-MG53老鼠都完全愈合前10天(无花果。3 b、e、n= 10)。更有趣的是,染色的耳朵组织抗体MG53透露MG53浓度在治疗耳洞的边缘来源于tPA-MG53老鼠(图。3 c从循环),这表明MG53被贩卖到损伤部位促进伤口关闭。也有可能出血的病变可以让MG53受伤的网站的访问。

值得注意的是,在受伤后10天,所有tPA-MG53老鼠恢复完全没有可观察到的疤痕。这些现象都可再生产地观察到相同的多个耳朵受伤tPA-MG53老鼠。如无花果所示。3 d,三色的染色显示明显差异在耳朵皮肤架构tPA-MG53与野生型小鼠,伤口敏锐地在创建2 h和耳朵穿孔后14天。定量分析表明显著减少纤维化与治疗相关tPA-MG53 ear-punch受伤的老鼠相比,同窝出生仔畜野生型小鼠(无花果。3 f)。通过这些研究,我们得出结论,增加流通中的MG53水平提高了组织伤口愈合能力。

提高性能和再生tPA-MG53肌肉

我们进行了实验,以描述与tPA-MG53小鼠骨骼肌的作用。 logus大体解剖学的比目鱼肌、伸肌肌腱牵向前(EDL)和腓肠肌(胃)肌肉似乎可比tPA-MG53和野生型之间的同胞(无花果。4)。量化的肌肉重量比胫骨长度显示任何肌肉萎缩和肥大的tPA-MG53老鼠(图。4 b,n= 7)。 H / E染色的肌肉横截面并没有透露探测与tPA-MG53肌肉病变。此外,横截面染色的比目鱼肌和EDL肌肉与肌凝蛋白重链抗体特定类型1 (MHC1,蓝色,无花果。4摄氏度),肌凝蛋白重链类型2 (MHC2a,绿色,无花果。4摄氏度),肌凝蛋白重链类型2 b (MHC2b,红色,无花果。4摄氏度)和肌凝蛋白重链类型IIx (MHC2x,紫色,无花果。4摄氏度)没有显示显著的肌纤维类型切换tPA-MG53老鼠(无花果。4 d)。 MHC2b的数量,比目鱼肌中微量组分在野生型肌肉,是检测不到tPA-MG53比目鱼肌(无花果。4 b)。

tPA-MG53和同窝出生仔畜野生型小鼠受到跑步机训练测试如果海拔循环MG53水平可能会影响动物的运行能力。在这项研究中,老鼠第一次受到运行10米/分钟6 h。第一轮运动训练20小时后,老鼠又受到运行在不同的速度为3分钟在跑步机上测试的能力恢复从运动性肌肉损伤。老鼠不能向前跑的次数和触摸底部的电网的跑步机(剩余> 7 s)被记录为退出。如无花果所示。4 e,野生型老鼠有更多的困难在跑步机上呈现出更多的辍学生,特别是在更高的运行速度,比tPA-MG53老鼠。这个观察表明,运动性肌肉损伤的可能少tPA-MG53老鼠,和他们的肌肉也恢复得更快的持续海拔MG53血液循环。

评估如果持续海拔MG53影响小鼠的基本性能,老鼠接受自愿轮竞选7天。如无花果所示。4 ftPA-MG53老鼠显示,增强运行能力与野生型相比,同窝出生仔畜控件(n每组= 5)没有反映了肌肉纤维糖原含量的变化由于生化研究显示只边际gastrocnemic肌肉糖原含量增加来自tPA-MG53小鼠与野生型相比,同窝出生(见补充图。8)。我们测量血液中炎性细胞因子前后自愿轮运行,并没有观察到任何不同水平的细胞因子之间tPA-MG53和野生型的同胞(补充图。9)。此外,电子显微镜分析线粒体的变化不太明显的内容在EDL和比目鱼肌的肌肉来源于tPA-MG53小鼠与野生型相比,同窝出生(见补充图。10)。

之前我们报道了MG53扮演了一个角色在骨骼肌钙信号的调制34。为了测试持续海拔MG53影响骨骼肌钙信号,我们孤立趾短屈肌腱牵向前(身上)肌肉从野生型和tPA-MG53同窝出生的。如补充图所示。11,KCl-induced细胞内钙释放是野生型之间的可比性和tPA-MG53肌肉纤维缺乏细胞外钙。有趣的是,在2毫米Ca在细胞外的解决方案,持续观察钙释放肌肉纤维来源于tPA-MG53老鼠(图。4 g)。 Ca的半场衰变为45.1±9.0年代(tPA-MG53)和15.2±4.4年代(野生型,p< 0.05)(图4 h),建议增加MG53表达式可以提高在骨骼肌细胞外钙条目34。这可能是一个因素的增强肌肉性能tPA-MG53老鼠。需要进一步的研究来确定这种观察的生物学基础。

我们进行下一个cardiotoxin-induced肌肉损伤评估tPA-MG53肌肉的再生能力13。心脏毒素(50µl 10µM股票的解决方案)的后肢肌肉肌内注入野生型,/ mg53−−,tPA-MG53老鼠。七天后心脏毒素伤害,H / E染色用于评价肌肉病理。如无花果所示。5,有明显差异的三个肌肉样本。 tPA-MG53肌肉显示更多的同质纤维尺寸与中央核(右面板,无花果。5),说明增强肌肉再生,与野生型相比,(中间面板)。的/ mg53−−肌肉纤维(左面板,无花果。5显示更多的异构纤维尺寸。此外,减少累积的免疫细胞中清晰可见tPA-MG53肌肉在7天心脏毒素伤害。我们使用免疫球蛋白标记量化程度的肌肉坏死。如无花果所示。5 b观察,免疫球蛋白阳性染色/ mg53−−肌肉比野生型和tPA-MG53肌肉,这是符合减少膜的修复功能与消融的肌肉纤维mg53。

量化的免疫细胞浸润程度的受伤的肌肉纤维,我们做CD11b包含IHC染色。如无花果所示。5度,tPA-MG53肌肉含有染色的CD11b显著低于野生型肌。的/ mg53−−肌肉纤维中最CD11b染色。来自多个实验的数据在图中做了总结。5 d。

的惊人的再生能力tPA-MG53心脏毒素损伤后肌肉显示MG53的可能性可能调节肌肉卫星细胞(mSC)功能有助于肌肉再生。如无花果所示。6、单趾长伸肌肌腱牵向前(EDL)肌肉纤维分离成年野生型,tPA-MG53和/ mg53−−(KO)小鼠(年龄4 - 6月),和培养的msc的肌纤维,以便结果。 msc较少从KO肌肉纤维增长,比野生型和tPA-MG53肌肉纤维。更多的msc附近发现了tPA-MG53纤维在5天后文化。当外源性rhMG53(20μg /毫升)添加到培养基中,增加数量的msc KO附近观察肌纤维(无花果。6,对吧)。这些数据提供的证据直接MG53对mSC增殖的影响。我们进行了流式细胞术分析细胞谱系不同抗体(Pax7 msc, MyoD成肌细胞,PDGFα成纤维细胞)来验证培养的msc的身份。 msc Pax7)阳性和阴性MyoD PDGFα(无花果。6 b(左),而C2C12成肌细胞MyoD阳性和阴性Pax7(无花果。6 b,右)(图形占所有流式细胞仪连续浇注/排序策略综述了补充图。12)。 Immunofluorescent染色证实了肌肉纤维的高纯度派生msc、Pax7阳性和阴性MyoD(无花果。6摄氏度)。图中的数据的平均值。6综述了在无花果。6 d。显然,有一个有缺陷的mSC的增殖/ mg53−−肌肉,大大改善了tPA-MG53肌肉,mSC增殖与mSC来自WT肌肉。更重要的是,我们发现孵化/ mg53−−肌肉纤维与rhMG53蛋白质可以恢复mSC增殖。的识别作用MG53 mSC的调制函数提供了一个机械的基础增加再生能力与肌肉损伤有关。

rhMG53预防急性和慢性肌肉拉伤

获得进一步了解循环MG53的直接行动防止慢性肌肉拉伤,我们进行了一次广泛的一系列研究使用离心收缩诱导小鼠的肌肉拉伤(无花果。7)。后肢肌肉(跖屈肌)的C57BL / 6 n小鼠(男,年龄12 - 14周)刺激产生强直收缩(通过坐骨神经刺激、60重复10年代除外)而被强行延长体内。偏心contraction-induced肌肉拉伤后,老鼠与rhMG53管理(2毫克/公斤)通过尾静脉注射肌肉受伤后在不同的时间(无花果。7一个)。我们发现静脉rhMG53管理时间的方式保护急性肌肉损伤。即使在6小时后肌肉拉伤,rhMG53仍然有效(p< 0.05)。根据观察发现在肌肉收缩性显著改善与rhMG53 4 h post-muscle损伤(无花果。7一个),后续实验研究与治疗的老鼠在4 h与不同剂量的rhMG53 post-muscle损伤(0、0.6、2、6和20毫克/公斤,静脉注射)。如无花果所示。7 b,rhMG53蛋白质防止偏心contraction-induced肌肉损伤剂量依赖性的方式。

我们接下来进行纵向评价rhMG53可能防止慢性肌肉损伤小鼠(无花果。7 c)。纵向测量肌肉收缩性表现在第0天(基线),第一天,3,6日,15日,23岁,具有抑制受损老鼠延伸30处理车辆控制(蓝色)或rhMG53蛋白质(红色)。老鼠接受rhMG53皮下注射(6毫克/公斤)每天4周。第一剂rhMG53管理在偏心contraction-induced肌肉损伤后24小时。如果rhMG53唯一的功能是防止肌纤维膜损伤,不希望看到任何有益的效果之一rhMG53在24 h post-musfcle受伤当所有受伤的肌肉纤维会死亡。然而,我们很兴奋地看到,重复剂量的rhMG53 24 h后肌肉拉伤(图仍有疗效。7 c)。曲线下的面积(AUC)显示重要的有利影响rhMG53便利化的收缩功能恢复eccentric-contraction-induced肌肉损伤后28天观察期间(无花果。7 d,p< 0.001,而盐水控制)。

这个意想不到的发现提供了直接证据的作用MG53在预防慢性肌肉损伤可能与mSC函数的便利化。此外,我们发现重复剂量的rhMG53是安全的,没有改变葡萄糖处理(无花果。7 e),一个观察是一致的健康寿命tPA-MG53老鼠含有> 100倍海拔MG53在他们的血液中。

db / db-tPA-MG53老鼠不改变胰岛素/血糖处理

tPA-MG53老鼠了db / db老鼠为了评估如果持续海拔MG53循环影响代谢功能(补充图。13)。如无花果所示。8,db / db-tPA-MG53老鼠显示类似的增长模式db / db老鼠在正常饮食条件。此外,没有增长模式tPA-MG53和野生型的同胞之间的差异。我们进行GTT和ITT公司测试的四组老鼠:野生型,tPA-MG53,db / db,db / db-tPA-MG53, 18 - 20岁的周。如无花果所示。8 b的葡萄糖耐量db / db和db / db-tPA-MG53老鼠无法区分,因为他们的胰岛素耐受性。与图中所示的结果一致。2 b, c,我们发现野生型之间没有改变GTT和ITT和tPA-MG53 18 - 20周的年龄。

我们使用超声心动图来确定MG53的持续提升db / db老鼠可能会改变他们的心脏功能。如无花果所示。8 c,心脏的射血分数和小数缩短是相似的db / db-tPA-MG53和db / db老鼠在8 - 10周的年龄。因此,增加MG53水平循环没有任何有害的对心脏功能的影响。

这些发现令人惊讶,因为他们与先前的报道,歌曲等。20.和刘et al。30.。如果他们的假设是正确的,我们希望看到极端夸张的代谢缺陷db / db-tPA-MG53老鼠由于增强MG53 IRS-1行动和PPARα介导胰岛素信号和脂肪生成的功能。我们因此与比目鱼肌来源于进行免疫印迹分析db / db和db / db-tPA-MG53老鼠。如无花果所示。8 d的蛋白质含量IRS-1、PPARαIR-β两组之间没有明显的差异。

刘等人。30.表明,小鼠心脏过度MG53 MG53导致核易位,这可以通过绑定到PPARαPPARα转录激活启动子区域。的激活PPARα导致心肌细胞脂肪生成,导致心肌病。有趣的是,尽管我们做了观察核积累MG53 tPA-MG53肌肉(见补充图。14),我们未能观察检测PPARα的变化在我们的鼠标线。

总体而言,我们的研究结果提供证据表明MG53水平升高在流通安全的代谢和心脏功能。

讨论

在目前的研究中,我们使用转基因小鼠行(tPA-MG53)持续海拔MG53蛋白质生理功能的血液循环来评估MG53组织损伤修复和再生。 tPA-MG53老鼠维持高水平的循环MG53在他们的寿命(36个月),没有可观察到的副作用。除了延长寿命,tPA-MG53老鼠表现出非同寻常的再生能力,以应对有害攻击多个器官。当挑战与跑步机跑步和心脏毒素伤害,tPA-MG53老鼠显示可以提高运动性能和增强愈合能力以应对肌肉损伤。更加让人觉得振奋,而皮肤组织不包含内生MG53蛋白质,耳朵穿孔损伤tPA-MG53老鼠可以治愈显著高于野生型老鼠。生化和成像分析表明,MG53可以旅行在血液中边缘的耳朵专注于伤口愈合网站,从而改善组织损伤后再生能力。在一起,我们的数据支持的安全水平升高MG53循环中我们的身体在生理情况下,血液中的MG53的有利影响组织损伤修复和再生。因此,通过静脉注射的治疗方法rhMG53可能代表一个安全、有效的手段来治疗多种疾病引起的组织损伤。

因为我们识别MG53作为一个关键组成部分细胞膜修复2009年,许多研究小组也加入这一重要研究领域。我们知道基因消融MG53导致细胞膜修复产生缺陷,从而导致进步骨骼肌病和心肌细胞的再生能力下降。评估MG53的体内功能,采用多种策略。研究人员利用基于病毒运载系统过度表现MG53骨骼肌35和心脏12,发现过度MG53可以防止受伤肌肉和心脏和改善肌肉萎缩症和心肌病动物模型。

除了病毒介导基因传递,转基因的方法也已经被多个组测试MG53的生理功能。之前,我们的研究与tPA-MG53老鼠,三个不同的行MG53转基因老鼠在文献中报道21,30.,36。肖和他的同事使用一个鸡β-actin催化剂21和α-myosin重链的催化剂30.开车MG53表达式分别在骨骼肌和心脏。他们报告说,过度MG53代谢紊乱引起的小鼠通过监管IRS-1, MG53的E3泛素基质21。与心脏MG53转基因老鼠,刘等人表明,除了,差别IRS-1对这些MG53可以在心肌细胞的细胞核PPARα信号调节转录激活30.,高架PPARα活动可能导致肥大和心肌病观察老鼠群。有趣的是,独立研究的火腿和Mahoney报道,心脏MG53转基因老鼠第一显示营养不良的心在年轻的时候,和转基因动物与衰老才开始开发心脏肥大36。相反IRS-1水平降低心脏组织来源于MG53转基因老鼠报道刘et al .,火腿和Mahoney显示高架IRS-1表达的转基因老鼠在同样的年龄36。

我们本研究采用了一种不同的方法评估函数的MG53 overexpressing分泌MG53横纹肌。我们tPA-MG53老鼠包含持续海拔MG53在血液循环水平接近rhMG53实现通过静脉输液治疗剂量的狗和猪18,19。我们没有观察到任何更改IRS-1和IR-β肌肉组织来源于tPA-MG53老鼠。我们也未能发现PPAR-α信号的激活骨骼肌、心脏与我们tPA-MG53老鼠。之间的区别我们的观察和歌曲等人,刘等人可能在于MG53的分布。可能过度的MG53肌肉和心脏组织内可能有有害的影响报道歌等人,刘等。我们的发现表明,水平的提高MG53流通有利于组织保护,不损害其代谢功能。

我们目前的证据表明,持续提升MG53流通并不影响胰岛素信号和葡萄糖处理在老鼠身上。此外,代谢和心脏功能db / db老鼠不改变当他们越过tPA-MG53老鼠。这些结果挑战建议MG53函数作为一把双刃剑在组织再生和代谢调节37。尽管一些潜在的不利影响从MG53可以通过细胞内发生行动IRS-1 PPARα信号通路,管理rhMG53蛋白在血液中可以很大程度上减少细胞内行动。由于相对较短的半衰期MG53蛋白在血液循环13,18,它不太可能MG53管理会影响身体的新陈代谢功能,特别是当使用MG53重组蛋白治疗急性组织损伤和皮肤伤口。

在我们的手稿是审查,由吴等人发表的一篇论文在流通,达成immuno-approach使用MG53抗体减少血清水平来治疗糖尿病38。他们报告说,血清来源于db / db老鼠显示海拔MG53可能是糖尿病的诱发因素; 和静脉注射抗体MG53可以降低血糖水平db / db老鼠。然而,作者使用的生物化学和生物物理研究并不足以支持其结论MG53的生理作用及其功能与胰岛素受体的交互控制葡萄糖代谢(见朱给编辑的信等。39)。当他们提出immuno-therapeutic方法是有趣,作者所呈现的数据包含大量标准错误评估的血糖水平db / db老鼠。此外,作者没有提供任何安全数据重复剂量的抗体对重要器官功能。建立的安全性和有效性抗体MG53将是非常重要的如果这种immuno-approach糖尿病患者的任何好处。

我们目前研究的一个主要发现是,持续提升MG53流通导致增加骨骼肌的再生能力与心脏毒素和运动性肌肉损伤。到达机械理解MG53生理作用的调节肌肉再生,我们分离msc/ mg53−−、野生型和tPA-MG53老鼠,发现有缺陷的mSC的增殖/ mg53−−肌肉,大大改善了tPA-MG53肌肉,mSC增殖与mSC来自野生型肌肉。更重要的是,我们发现孵化/ mg53−−肌肉纤维与rhMG53蛋白质可以恢复mSC增殖。的识别作用MG53 mSC的调制函数提供了一个机械的基础增加再生能力与肌肉损伤有关。

来洞察MG53循环的直接行动防止慢性肌肉拉伤,我们实验中使用离心收缩诱导小鼠的肌肉拉伤。我们发现静脉rhMG53管理时间和剂量依赖性的方式保护急性肌肉损伤。即使在6小时后肌肉拉伤,rhMG53仍然是有效的。这些发现符合角色的肌肉拉伤MG53修理; 然而,我们惊讶地发现,重复剂量的rhMG53 24 h后肌肉拉伤仍有疗效。这个意想不到的发现提供了直接证据的作用MG53在预防慢性肌肉损伤可能与mSC函数的便利化。此外,我们发现重复剂量的rhMG53是安全的和没有改变葡萄糖处理,观察是一致的健康寿命tPA-MG53老鼠含有> 100倍海拔MG53在他们的血液中。

总的来说,数据提出了研究推进我们的理解的MG53保护骨骼肌的再生能力,这是超出我们目前的知识MG53作为唯一的肌肉肌纤维膜损伤修复的分子。我们表明,MG53有助于msc的增殖和rhMG53蛋白持续影响慢性肌肉拉伤时管理系统。这些发现将提供一个基础的潜在使用rhMG53治疗慢性肌肉疾病相关的肌肉失去完整性和肌肉卫星细胞的功能。

方法

实验动物

动物进行处理和手术根据协议机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)俄亥俄州立大学和符合美国认证协会的指导方针实验动物保健。 MG53基因敲除小鼠(/ mg53−−)及其野生型控制老鼠培育和维护如前所述。代tPA-MG53老鼠,人类MG53 cDNA共轭与分泌信号肽(tPA) 5 '末端。 tPA-MG53表达式构造是由克隆tPA-MG53生成到一个包含鸡β-actin启动子的表达载体。的质粒被送到转基因/淘汰赛鼠标(TG / KO)设施在新泽西癌症研究所(CINJ)转基因小鼠的一代。转基因小鼠线生成129年混合遗传背景/ Sv和C57BL / 6 J和用于耳朵穿孔试验(无花果。3.)。因为它比其他tPA-MG53早些时候生成鼠标线,这鼠标线也用于老化实验。

生成一个单独的tPA-MG53鼠标线从C57BL / 6 J Cyagen生物科学的遗传背景。美国加利福尼亚州圣克拉拉。这款鼠标线是用于所有实验除了耳朵穿孔和衰老的研究。两个tPA-MG53鼠标线表达高水平的正常MG53流传和发展。

血清MG53量化

两种不同的方法被用来量化小鼠血清MG53水平。免疫印迹,不同数量的rhMG53(0.03, 0.05, 0.1,和0.3 ng)与1μl混合血清/ mg53−−小鼠作为标准。从野生型小鼠血清样本是装有卷1和2的μl和探索对MG53单克隆抗体。免疫印迹的密度对rhMG53标准浓度,绘制和回归分析用于计算浓度的血清中MG53源自于野生型老鼠。同样,量化MG53 tPA-MG53小鼠血清,大量的rhMG53 (1、5、10 ng)与1μl涨跌互现/ mg53−−血清作为标准。每个血清样本tPA-MG53老鼠是加载量为0.1,1和2μl。免疫印迹的密度对rhMG53绘制标准蛋白质浓度和回归分析用于计算在tPA-MG53 MG53血清的浓度。

MG53水平血清也量化夹心ELISA测定(补充图。1)。血清样本来自tPA-MG53老鼠稀释50,200和1000倍的BSA阻断ELISA板缓冲和加载。生成一个标准曲线,不同数量的飙升到血清来源于rhMG53蛋白质/ mg53−−老鼠,然后与BSA阻止进一步稀释缓冲50,200和1000倍和加载相同的ELISA板进行量化。阅读每一个标准的蛋白质对其浓度,然后绘制和回归分析用于计算在tPA-MG53 MG53血清的浓度。

葡萄糖耐量试验

老鼠单独安置和禁食16 h前测试。老鼠的尾巴尖被无菌手术刀刀片。血液从尾部尖收集和基底由OneTouch血糖测量超Glucometer (Lifescan、苗必达,CA)。禁食后,小鼠腹腔注射葡萄糖的丸(1克/公斤,10%葡萄糖,刚做好无菌0.9%氯化钠溶液)。从小鼠尾静脉血糖评估15岁,30岁,45岁,90年,120分钟后血糖管理。

胰岛素耐量试验

老鼠单独安置和禁食6小时前测试。老鼠的尾巴尖被无菌手术刀刀片。血液从尾部尖收集和基底由OneTouch血糖测量超Glucometer (Lifescan、苗必达,CA)。禁食后,小鼠腹腔内(i.p)注射胰岛素的丸(0.75 U /公斤)(σ,胰岛素是刚做好的无菌0.9%氯化钠溶液)。血糖评估10点,25岁,45岁,90年,120分钟后胰岛素管理。

耳朵穿孔伤

一个1毫米耳洞是在耳朵的老鼠的中心使用金属耳穿孔机(费舍尔科学、猫。没有50822358)。耳洞拍摄,在表示时间点使用卡尺测量。在耳朵穿孔后14天,老鼠牺牲和耳朵被解剖组织化学分析。石蜡包埋的耳朵样本切割为三色的染色量化再生组织的纤维化。对急性损伤,2 h后耳朵,耳朵采集样本进行免疫组织化学分析MG53耳朵前缘的伤口。

跑步机和voluntary-wheel运行实验

tPA-MG53和野生型同窝出生的最初训练(5米/分钟每次运行5分钟,每天三次竞选三天)在小动物跑步机(哥伦布仪器)。然后老鼠受到跑步机跑步10 m / min 6 h。二十小时后最初的运动训练,老鼠受到运行在6、8、10、12、14、16米/分钟每3分钟在跑步机上测试从肌肉拉伤恢复的能力。老鼠不能向前跑的次数和触摸底部的电网的7岁以上的跑步机,仍是记录为退出。辍学生的老鼠在每个不同的速度记录。

在不同的研究中,tPA-MG53和野生型的同胞被单独关在笼子里配备自愿旋转运行车轮(哥伦布仪器,哥伦布,哦)一个星期。志愿活动运行记录通过每隔2 h轮旋转使用Windows软件(哥伦布仪器,哥伦布,哦)。

Ca2 +测量在孤立的骨骼肌纤维

老鼠身上的肌肉纤维分离从野生型和tPA-MG53协议后朱et al。40。他们含有10μM Fura-2。 Fura-2荧光的激发波长的比率340年和380年纳米测量使用PTI荧光谱仪(光子技术国际)评估细胞内(Ca的变化2 +]我刺激与氯化钾。零Ca2 +Ca或2毫米2 +Tyrode灌注的解决办法是在纤维之前添加110毫米氯化钾诱导Ca2 +商店版本。

组织病理学和immunofluorescent染色

所有的组织病理学和immunofluorescent双盲的方式进行了分析。石蜡包埋的组织部分4µm厚度用于苏木精和伊红染色())。在4%多聚甲醛固定的组织样本(PFA)一夜之间在4°C。固定后,样本5分钟用70%的乙醇清洗三次。洗样本处理和嵌入式石蜡。 4-μm-thick石蜡部分被削减为病理染色幻灯片)和马森三色的和immunofluorescent染色。 Immunofluorescent染色进行如下:幻灯片被孵化deparaffinized和水化先后在二甲苯中,100%乙醇,95年,75年,50%的乙醇和PBS。抗原检索是通过加热在压力锅Tris-EDTA缓冲了13分钟。初级抗体应用和孵化一夜之间在4°C。山羊anti-rabbit /鼠标二级抗体alexa - 546 / alexa - 647应用和在室温下孵化1 h。抗体用于immunofluorescent染色:anti-MHC我抗体(发展研究杂种细胞银行(DSHB),爱荷华州BA-F8, 1:50), anti-MHC花絮抗体(1:50 0 DSHB, sc - 71), IIb anti-MHC抗体(DSHB BF-F3, 1:10 0), anti-MHC IIx抗体(DSHB 6 h1, 1:50) anti-CD11b抗体(Abcam, ab133357 1:200)和anti-MG53抗体(自制的单克隆抗体)。 DAPI染色组织的核心。所有图片都被蔡司LSM ImageJ 780共焦显微镜和分析。

免疫印迹

粗提取物切割肌肉或实验动物中心与冰冷的PBS和细胞溶解洗两次里帕缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值7.2,150毫米氯化钠,NP-40 1%, 0.5% SDS和0.5% deoxycolate),补充鸡尾酒的蛋白酶抑制剂(σ)和磷酸酶抑制剂(热科学)。心脏、肌肉溶解产物或血清样本10% sds - page分离和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔)。这些墨迹与Tris-buffered盐水洗Tween-20 (TBST),阻止5%牛奶TBST 1 h,孵化和定制的单克隆抗体anti-MG53 (1:20 00)18,30.或商业IRS-1抗体(表达载体,猫。 700662号,1:1000),anti-PPARα抗体(NovusBio,猫。不。 1:1000 nb600 - 636)、anti-IR-β抗体(细胞信号,猫。 3025号,1:1000)和anti-Glut-4(细胞信号,猫。 2213号,1:1000)抗体。免疫印迹和ECL +可视化工具包(皮尔斯)。

我们通常使用多个样本来自样品在给定的蛋白质印迹。说明带强度的传播与野生型样品,我们归一化带强度野生型样本(通常是一个中等强度),并绘制其他样品的相对强度(包括野生型和tPA-MG53肌肉)的散点图。

心脏毒素诱导骨骼肌损伤

在4 - 6个月的年龄,/ mg53−−、野生型和tPA-MG53老鼠接受50µl 10μM心脏毒素VII4 (CTX Sigma-Aldrich)通过肌肉注射。 7天之后,小鼠安乐死和骨骼肌进行组织学分析。组织学分析,列出组织手术解剖,浸泡在福尔马林溶液(电子显微镜服务)一夜之间在4°C紧随其后的是上面描述的组织化学的过程。分析双盲。

偏心contraction-induced在小鼠肌肉拉伤

雄性C57BL / 6 n小鼠在12 - 14周的年龄被单独安置在十二12 h(黑暗:光明)周期,和适应GSK动物园开始前1周肌肉损伤和干预。动物被随机分配到治疗组根据基线体重。老鼠使用异氟烷麻醉。后肢肌肉刺激产生强直收缩(通过坐骨神经; 60重复; 十年代除外)而被强行延长体内。该协议在葛兰素史克IACUC批准。偏心contraction-induced肌肉拉伤后,老鼠被分成组,每组10根据下列实验设计:a)尾静脉rhMG53管理局(2毫克/公斤)在不同时间后损伤; b)尾静脉管理4个小时后肌肉拉伤与不同剂量的rhMG53(0, 0.6, 2, 6 - 20毫克/公斤); 和c)皮下管理rhMG53每天(6毫克/公斤),与第一剂量应用于24 h后肌肉拉伤。 rhMG53,纵向研究与重复给药后小鼠牺牲在28天受伤,甘油三酯和血清葡萄糖和量化。所有测量进行了双盲的方式。

肌肉卫星细胞的文化

趾长伸肌肌腱牵向前(EDL)肌肉/ mg53−−,tPA-MG53及其野生型同窝出生的解剖和消化0.2%胶原酶在35°C水浴45分钟的震动。单一肌肉EDL肌肉纤维选择热的巴斯德吸管,放在个人的中心的24-well基底膜基质涂层板。文化传媒(DMEM加上20%的边后卫)每3天改为允许产物肌卫星细胞在37°C(5%股份有限公司2)。的身份培养卫星细胞经罗马7抗体(爱荷华州的杂种细胞银行)染色流式细胞术和immunofluorescent染色。抗体MyoD(成肌细胞标记)和PDGFα(成纤维细胞标记)被用来显示孤立的卫星细胞的纯度。

超声心动图

超声心动图进行小鼠麻醉isofluorane 2%,使用Vevo2100用30 mhz超声心动图系统传感器(Visualsonics, Inc .,多伦多,安大略省,加拿大)。心第一次使用的二维模式查看胸骨旁的烈度极震区的观点。极震区视图用来M-mode游标位置垂直于心室中隔和LV后壁。内部LV舒张末期直径(LVEDD)以明显的最大LV舒张维度,和LV内部收缩末期直径(LVESD)测定在最前收缩后壁的远足。 LV卷和射血分数(EF)被Teichholz计算方法。卷,LVEDV = 7 (LVEDD) 3 / (2.4 + LVEDD)和LVESV = 7 (LVESD) 3 / (2.4 + LVESD) LVEDV和LVESV LV舒张压和收缩压卷分别结束。 EF英孚(%)= (LVEDV−LVESV) / LVEDV×100。 LV部分缩短(FS)计算了FS (%) = (LVEDD−LVESD) / LVEDD×100。