疟原虫感染通过抑制AMPK-ACC途径诱导宿主血脂异常和肝脂生成状态 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

疟疾是人类的一种主要寄生虫病，是影响100多个国家的公共卫生问题。2017年，在2.19亿感染中，它造成了近50万人死亡。疟疾是由该属原生动物寄生虫引起的。疟原虫是由雌性蚊子传播的按蚊..一旦进入血液系统，疟原虫裂殖子侵入红细胞并增殖，直到细胞溶解并释放侵入其他红细胞的新寄生虫。值得注意的是，它们可以操纵脊椎动物宿主的脂代谢途径，因为它们不能合成对它们的发育和复制至关重要的脂类。在这项研究中，我们发现老鼠感染了柴胡疟原虫显示一个完全不同的血浆档案与对照组小鼠，明显的高蛋白血症，高甘油三酯血症，低血糖，低胆固醇血症。此外，白色脂肪和肝脏组织以及受感染动物的分析显示，三酰甘油在两种组织中积累，而游离脂肪酸和游离胆固醇在肝脏中积累。还改变了肝脏脂质代谢关键酶和转录因子的mRNA和蛋白表达。沙波迪(P.chabaudi)感染导致脂肪生成状态。酶5‘AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是细胞能量代谢的主调节因子，它也被寄生虫所调控，从而降低了AMPK在感染时的磷酸化水平。二甲双胍预处理21天后感染沙波迪(P.chabaudi)在激活AMPK的同时，能有效地预防小鼠感染，降低肝脏脂质蓄积。这些结果为疟原虫调控肝脏脂代谢的具体分子机制提供了新的重要信息，以促进其在脊椎动物宿主体内的发育、增殖和寿命。

导言

疟疾是人类的主要寄生虫病。1..这是一种危及生命的疾病。2然而却被认为是一个被忽视的疾病和公共卫生问题，影响了全世界100多个国家。3..2017年，在2.19亿感染中，它造成了近50万人死亡。目前有30多亿人处于感染和发展疟疾的危险之中。4.

疟疾是由原生动物寄生虫引起的一种传染病。疟原虫是由雌性蚊子传播的按蚊5..作为一种多因素的疾病，其临床进展取决于多种宿主因素，包括年龄、感染史、营养状况、宿主和寄生虫的遗传、地理位置和社会经济状况。6,7,8..然而，疟疾发病的基础有以下几个方面：(1)感染红细胞破裂引起的促炎细胞因子的大量释放；(2)感染红细胞(RBCs)在毛细血管中的粘附；(3)脾巨噬细胞对感染RBCs的破坏和清除。这些现象共同导致了与疟疾相关的主要症状，如全身炎症、贫血、代谢性酸中毒、胎盘和脑性疟疾。6,7,8..在肝脏，疟原虫感染与门脉炎有关。9、胆汁淤积症9、RBCs隔离和肝细胞坏死10..因此，疟疾患者通常表现为肝肿大、黄疸、RBCs肝负荷增加和血清肝酶水平升高。11.

肝脏是一个中央代谢器官，是葡萄糖和脂代谢的主要调节因子，是糖异生、β氧化、脂肪生成以及摄取和分泌脂蛋白的主要调节因子。12..酶5‘AMP活化蛋白激酶(AMPK)是肝脏脂质代谢的关键调节因子。13..激活后，AMPK磷酸化并抑制乙酰辅酶(ACC)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)，降低脂肪酸合成酶(Fas)的表达，激活丙二酰辅酶A羧化酶，从而降低脂肪酸和胆固醇的合成。14,15,16..ACC的抑制还通过减少丙二酰辅酶A来促进脂肪酸的氧化。17,18，导致肉碱棕榈酰转移酶1(CPT 1)活性增加。19.

考虑到在疟疾发病机制中的代谢结果和具体的肝分子机制尚不清楚，我们试图研究在疟疾发病过程中脂类代谢的变化。柴胡疟原虫在小鼠感染中，为了更好地了解它们对寄主-寄生虫相互作用和感染结果的重要性。

结果

沙波迪(P.chabaudi)感染引起瑞士小鼠血脂异常及细胞因子谱改变

采用血浆总胆固醇、三酰甘油(TAG)、葡萄糖、总蛋白、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素(IL)-1β、IL-10浓度等指标对感染小鼠血浆进行分析。1)。与对照组相比，感染小鼠的总胆固醇和葡萄糖水平显著下降(p < 0.05 and p < 0.01, respectively; Fig. 1A、C)，而在感染的动物中，TAG和总蛋白水平增加(p < 0.001 and p < 0.01, respectively; Fig. 1B，D)。感染组小鼠血清肿瘤坏死因子α、IL-1β和IL-10浓度较对照组显著升高(P<0.0 5)。p < 0.0001, p < 0.0001 and p < 0.0001, respectively; Fig. 1E-G)。这些结果显示感染小鼠和对照组小鼠的血脂、蛋白质和细胞因子均有明显变化，提示感染引起的血脂异常和炎症反应。

沙波迪(P.chabaudi)促进感染小鼠肝脏和白色脂肪组织脂类的变化

对肝脏和Wat脂谱进行了分析，以探讨脂类的可能变化。疟原虫感染。如图所示。2A，B、肝标记(p < 0.05), free cholesterol (p < 0.05), free fatty acids (p < 0.05), and sphingomyelin (SM; p < 0.05) levels increased in infected animals relative to controls, whereas the WAT of infected animals exhibited elevated TAG (p < 0.05; Fig. 2C)和降低磷脂酰乙醇胺(PE；p < 0.05; Fig. 二维空间)，其他脂类无显着性差异。用酶比色法确定感染组和对照组肝组织和Wat浓度的变化，并验证感染组和对照组肝组织中这种脂类含量的增加(见图1)。2A、C)。这些数据表明，沙波迪(P.chabaudi)感染会增加对小鼠脂质代谢至关重要的组织中的脂质积累。

沙波迪(P.chabaudi)感染导致肝脏脂质代谢相关基因的表达改变。

在证明了疟原虫感染小鼠会引起广泛的脂质变化，包括血脂、肝脏和Wat脂类的改变，我们下一次假设沙波迪(P.chabaudi)特异性地抑制与脂质降解或生物合成有关的关键酶和转录因子的基因表达(表)1)。在这方面，选择转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-α(pPAR-α)、pPAR-γ辅助激活剂-1α(pgc-1α)和β-氧化酶cp1-A作为脂质降解途径的相关基因进行研究。p < 0.001; Fig. 3A-C)。采用转录因子PPAR-γ、酶Fas和ACC来评价脂质合成途径的介导作用，感染小鼠体内PPAR-γ和Fas水平升高(P<0.05)。p < 0.05 and p < 0.01; Fig. 3D，E，ACC基因的表达无显着性差异(图1)。3F)。总之，这些发现表明，疟疾导致肝脏基因表达的显著变化，其组合表明脂肪生成增加，脂肪代谢途径减少。

表1用于基因表达评估的引物序列。

全尺寸表

沙波迪(P.chabaudi)感染改变参与脂质代谢的肝酶和转录因子的磷酸化水平和蛋白表达

AMPK是细胞能量代谢的主要调节因子。20..当磷酸化时，该激酶被激活，并利用磷酸化来下调合成和刺激分解代谢途径，以恢复细胞能量平衡。20..因此，我们推测Ampk及其下游靶点的肝磷酸化水平会被沙波迪(P.chabaudi)感染这些动物。然后我们证明AMPK磷酸化水平在感染时显著降低。p < 0.05; Fig. 4A和补充S1a)，同时伴随着转录因子甾醇调节元件结合蛋白-1c(srEBP-1c)和pPARα(p < 0.001; Fig. 4B、C、F分别与补充S1B、C、F)。同时，Fas和pPARγ蛋白表达增强。p < 0.05; Fig. 4D，E；补充S1D，E).

二甲双胍预处理沙波迪(P.chabaudi)小鼠感染及保护肝脏免受脂肪变性的影响

为了验证AMPK介导的感染引起的脂质代谢改变的关键作用，我们先用AMPK激活剂二甲双胍(1，1-二甲基联胍)对小鼠进行预处理。沙波迪(P.chabaudi)接种(见材料和方法)。二甲双胍预处理完全逆转了肝脏AMPK磷酸化水平的下降沙波迪(P.chabaudi)感染(p < 0.001; Fig. 5A和补充S2A)。同样，与感染组相比，二甲双胍预处理可消除感染组ACC(AMPK下游靶点)的下降，甚至增加其肝磷酸化水平。p < 0.001) and control (p < 0.001; Fig. 5B和补充S2B)团体。值得注意的是，受感染的小鼠在感染后第5天，寄生虫血症率逐渐显著上升，达到80%(图1)。6)，二甲双胍预处理后第3天至第5天，寄生虫血症率显著降低(p < 0.001; Fig. 6)。这种感染率的显著下降还伴随着临床感染症状的减少，如昏睡、竖立、体温过低、饥饿和贫血等，与未受感染的小鼠相比，预处理后的受感染动物均被消除。此外，二甲双胍预处理可降低感染小鼠和非感染小鼠肝脏脂类的百分比(p < 0.001; Fig. 7)，但总磷脂含量高于未处理组(p < 0.001; Fig. 7)。与对照组相比，二甲双胍预处理后小鼠血浆和肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-10均显著降低(图1)。8A-F).

讨论

在这项研究中，我们证明了沙波迪(P.chabaudi)感染引起脊椎动物宿主脂代谢的严重变化，表现为血浆、肝脏和WAT代谢改变。这些变化是由AMPK下调和随后的激活导致脂质生物合成和积累增加所介导的。二甲双胍预处理可逆转感染引起的肝脏变化，提示建立了一种保护性代谢状态，抑制病原体的增殖，进而在哺乳动物宿主中传播。

宿主促炎免疫反应和抗炎免疫反应之间的平衡在决定机体预后的过程中起着至关重要的作用。疟原虫感染。弱的促炎反应可能导致寄生虫不受管制的复制，而活跃的促炎反应则可能导致组织损伤，如严重的疟疾综合征，包括脑疟疾和多器官功能衰竭。在此，我们发现感染小鼠血浆和肝脏中的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素10水平与对照组相比均有升高(如图1所示)。1)。高水平的血浆肿瘤坏死因子α与贫血和高密度有关。恶性疟原虫感染21，以及其他严重的疟疾并发症，如肾功能衰竭。22..来自小鼠疟疾模型的数据表明，IL-10是保护宿主组织免受炎症所必需的，但也可能促进寄生虫的生长和相关的疾病表现。因此，IL-10似乎在调节肿瘤坏死因子在疟疾期间的作用中起着关键作用，但同时，IL-10可能会促进高密度感染，从而导致其他并发症，包括感染的红细胞在组织中积聚，从而导致缺氧和对血管的直接损害。23,24.

沙波迪(P.chabaudi)促进低胆固醇血症、高甘油三酯血症、低血糖、高蛋白血症和细胞因子的改变，这清楚地表明了血脂失调和炎症反应增加，这与以前的研究是一致的。25,26,27,28,29..然而，我们也发现，这些血浆变化伴随着Wat的脂质结构的改变以及TAG和SM的增加；据我们所知，这是第一次在文献中报道这些效应。考虑到感染的红细胞在多种组织(包括Wat)中粘附于毛细血管内皮细胞。30)寄生虫可能通过内皮间接作用于脂肪细胞，并刺激脂质的积累，从而促进脂肪在宿主体内的发育和增殖。需要进一步的研究，以更好地理解这一调控所涉及的分子途径，并探讨其与寄主-寄生虫相互作用的相关性。

我们的研究重点是肝脏，因为这个组织拥有合成脂质所必需的一整套酶机制，因为它是体内脂质交换的主要器官。31,32..感染小鼠肝组织中TAG、游离脂肪酸和游离胆固醇含量增加，提示肝脏血脂异常，定量聚合酶链反应(QPCR)结果显示感染过程中PPAR-α、PGC-1α和CPT 1-A表达降低，证实了这一点。PPAR-α是健康肝脏中最丰富的转录因子.它负责激活脂肪酸的摄取和氧化，pPAR-α肝细胞特异性基因敲除损伤游离脂肪酸的稳态，并影响整个身体的喂养或禁食小鼠。33..pgc-1α是禁食诱导的一种转录辅激活因子，它通过pPAR-α、Foxo 1和hnf-4α刺激激活脂肪酸氧化和糖异生作用。34,35,36..cpt 1-A是β氧化过程中的关键酶，不仅受丙二酰辅酶A的调节，还受甲状腺激素和胰岛素的调节。37,38..与健康的肝脏相比，我们的结果都表明感染后的脂肪酸氧化状态较低。

相反，我们观察到感染小鼠肝组织中PPAR-γ和Fas的mRNA和蛋白表达明显高于对照组。Fas是脂肪酸合成过程中的关键酶，其在小鼠体内的基因敲除是致命的，表明Fas在脂肪酸合成过程中起着至关重要的作用。德雷沃胚胎发育中的脂肪发生39..pPAR-γ是肝脏脂肪酸储存的转录调节因子，其对肥胖小鼠肝脏特异性基因敲除可减少脂质的积累。40..因此，PPAR-γ和Fas基因表达的增加意味着感染期间脂质生物合成增加.

AMPK酶是脂类、碳水化合物和蛋白质生物合成和降解的中心调节因子。41..在此，我们发现肝AMPK在疟原虫感染，这会降低AMPK的磷酸化，并导致合成状态的激活(图1)。4A和S1a)。acc、srebp-1c和pPARα也是控制脂质合成/降解途径的关键，它们是ampk磷酸化的靶点。42,43. 疟原虫感染降低ACC，SREBP-1c磷酸化(即诱导其激活)4B、C和S1B，C)和降低pPARα磷酸化(即降低它们的激活)(如图所示)。4E和S1E)。此外，感染增加了Fas和pPARγ的蛋白表达。4D，F和S1D，F)。srebp-1c刺激Fas44在感染期间导致脂肪生成而不是脂解。

二甲双胍是一种经典的AMPK激活剂，是治疗2型糖尿病(T2DM)患者高血糖最广泛的药物。45..它也被用于糖尿病前期人群的预防。46,47，以避免与T2DM相关的血管并发症48，减少炎症和肝脏脂肪变性。49..疟疾以前曾与T2DM有关。50..在加纳进行的一项病例对照研究报告，T2DM患者感染的风险增加了46%。恶性疟原虫51由于机体对肝脏和血液阶段寄生虫的防御能力受损，T细胞介导的免疫功能降低，葡萄糖利用率增加。52..最近的研究表明，维持血糖对小鼠疟疾的耐受性是必不可少的，因为严重的低血糖会增加受感染小鼠的脑炎症和致死率。53,54..与未经二甲双胍治疗的患者相比，T2DM患者使用二甲双胍可显著降低疟疾感染的发生率。55..此外，二甲双胍还可以减少恶性疟原虫与包括阿托伐酮在内的抗疟药物流行并显示协同作用51,56，与单用二甲双胍相比，青蒿琥酯/埃索美拉唑更有效地降低血糖水平，减轻代谢综合征症状，促进有效的寄生虫清除和防止其复发。57.

在本研究中，我们发现二甲双胍对预处理有保护作用。沙波迪(P.chabaudi)感染小鼠从发展中的临床意义上的疟疾。AMPK在病毒感染严重程度中的作用已被研究过。58和疟疾59然而，后一项研究是在疟疾肝循环期间进行的。我们的研究包括一个独特而新颖的实验设计，用来解决疟原虫红细胞内循环中，寄生虫不再感染肝细胞，疟疾征状和症状更加强烈。因此，我们在这里已经证明，疟疾是可以预防的前处理与二甲双胍。

二甲双胍预处理抑制作用的机制疟原虫感染仍需确定。然而，我们认为AMPK下调诱导的脂肪生成状态有利于疟原虫在哺乳动物宿主中增殖和传播，而二甲双胍诱导的AMPK激活限制了对寄生虫的脂质供应，从而损害了感染。病原体广泛利用宿主的细胞脂质体通路，在数百万年的寄生过程中，它们进化出非常复杂的机制来延长宿主的寿命。宿主脂的获取对调节宿主与病原体的相互作用和提高病原菌的毒力至关重要。60..脂类是病原体的能量来源，不能合成脂肪酸，因此它们依赖于从宿主获得这些分子，并随后诱导β氧化。61..如属疟原虫在红细胞内阶段，宿主脂的获取是基本的，特别重要的是，当这种寄生虫失去了合成脂肪酸的能力，并且只能在其寄生的液泡中储存脂类的时候。62..此外，宿主脂为病原体组装提供了基础。63,64,65以及一种方便的碳源，正如人们所描述的结核分枝杆菌66,67, 沙门氏菌68, 白色念珠菌69，和新生隐球菌70.

二甲双胍预处理可显著降低感染小鼠的TNFα、IL-1β和IL-10浓度。8)。二甲双胍已被证明可以减轻几种疾病的促炎反应。71,72,73..因此，二甲双胍诱导的ampk激活抑制了血液中寄生虫的存在所引发的不受控制的炎症反应，保护肝脏免受损伤和由此产生的脂质积累，最终将抑制小鼠的发育和增殖。疟原虫在血泊中。

图形9的分子机制的工作模型。疟原虫感染，表明一种可能的途径，可引起小鼠在感染过程中肝脏脂质的积累。AMPK活性降低导致ACC活性升高，从而促进脂质合成，并通过抑制β氧化限速酶CPT1-A来降低脂质氧化。较低的AMPK也会增加SREBP-1c的激活，从而刺激参与脂质合成的基因的转录，如Fas。支持这一途径的一个互补轴来自于pPARγ蛋白表达的增加，这是一种参与脂质合成的转录因子，并降低了pPARα的磷酸化水平和pgc-1α的mrna表达，这两种脂肪酸氧化诱导剂。74..二甲双胍能激活肝脏AMPK并抑制ACC活性，可能逆转了肝内脂积累的所有信号通路。疟原虫小鼠感染。总之，我们提供的数据表明，AMPK是预防和治疗疟疾的新药物的一个有吸引力的目标。

材料和方法

寄生虫和老鼠

寄生虫和小鼠来自里约热内卢联邦大学CarlosChagas Filho生物物理研究所的超微结构和细胞生物学实验室Hertha Meyer，与KildaMiranda博士合作。沙波迪(P.chabaudi)在实验感染方案之前，通过每周一次的连续传代在瑞士小鼠体内维持寄生虫。8周龄的瑞士雄性老鼠被饲养在一个12小时/12小时的光/暗循环中，并且有水和食物。[医]锂.

道德声明

所有动物都按照实验动物的护理和使用指南75，所有实验协议均经里约热内卢联邦大学和卫生科学中心动物护理委员会批准(IBCCF209-09/16号协议)。

实验设计1

将瑞士雄性小鼠(~25克，8周龄)分成感染组(INF，n=14)和控制(CTR，n=14)组。感染性接种(1×10)6含沙波迪(P.chabaudi))然后制备并腹腔注射到INF组。CTR小鼠接种类似的疫苗，但缺乏寄生虫(1×10)6(未受感染的RBCs)。注射后，用快速泛视法(Labclin)固定并染色的血液涂片对寄生虫血症进行监测。®)。当INF动物的寄生虫血症达到80%时(感染后5天)，所有小鼠均在CO中安乐死。2心脏穿刺后，取腔及血液制成含3%柠檬酸钠作为抗凝剂的小瓶。收集肝脏和腹膜后Wat，并将其储存在液氮罐中。血液样本在500℃离心g血浆采集15 min后，保存在−20°C，直至需要分析为止。

实验设计2

雄性瑞士小鼠(~25 g，8周龄)分为4组：对照组(CTR)，n=9)，感染(INF，n=9)，用二甲双胍预处理(CTR-Met，n=9)，并经二甲双胍感染和预处理(INF-Met，n=9)。CTR-Met组和INF-Met组采用二甲双胍(150 mg/kg)腹腔注射，每日1次，共21天。76..CTR组和INF组进行了类似的治疗，但以0.15 M NaCl代替。然后将动物腹腔注射感染疫苗(1×10)。6含沙波迪(P.chabaudi)用于INF和INF-Met组或未感染疫苗(1×10)6CTR组和CTR-Met组健康RBCs。疟原虫血症用快速泛视法染色的每日血液涂片监测(Labclin)®)。INF组小鼠感染5d后，寄生虫血症达80%时进行安乐死。血液和组织样本的收集和存储采用与实验设计1相同的程序。

脂类提取与分析

脂类提取采用Bligh和Dyer改良的方法(1959年)77..将肝脏和Wat样品(10 Mg)加入500 L的裂解缓冲液(50 mm Tris-HCl，pH 7.4，1%np-40，250 mm NaCl，5 mm edta，50 mm NaF)中，在2 500 mm时离心。g持续5分钟。上清液加入玻璃锥管，加入4 mL氯仿-甲醇-水(2：1：0.8 mL)，间歇性摇动2h，730离心。g在4°C高速冷冻离心机中工作20分钟(日立有限公司，日本)。收集上清液，加入2 mL水和氯仿(1：1 mL)，730离心。 g在4°C下收集有机相(含脂)20 min。用正己烷/二乙醚/乙酸溶剂(60：40：1v/v)对提取的脂质进行薄层色谱分析。78..为了观察脂质，板被浸在由8%CuSO组成的碳化溶液中。410%H3阿宝410s，在110°C下加热20 min79..利用ImageMaster TotalLab软件(TotalLab，纽卡斯尔，英国)对平板进行密度测量分析。

比色酶分析

用商用酶试剂盒测定血浆标签、总胆固醇和葡萄糖浓度。®、巴西戈伊尼亚)，并遵照制造商的指示。

蛋白质浓度测定

血浆蛋白浓度用Lowry法测定80，以牛血清白蛋白(0.1%)为标准。

RNA提取与cDNA合成

肝样本(10 Mg)用5 0 0μL TRIzol试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)进行匀浆，并于7，500次离心。g在4°C下培养15 min，将上清液转入含有2 0 0μL氯仿的微管(德国达姆施塔特，默克)。样品摇动10s，7，500次离心。g在4°C下培养15 min，取上清液转入含2 0 0μL异丙醇(Merck)的新型微管中。将样品轻轻倒置，在室温下孵育10 min，然后在7，500℃离心。g在4°C下培养15 min，丢弃上清液，在2 0 0μL的无水乙醇中重新悬浮沉淀。然后以3，000的速度离心样本g在4℃下15 min，丢弃上清液，再悬浮于30μL的无酶水中。用纳米滴法测定RNA浓度。

cDNA合成用高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统，福斯特市，美国)。反应包括1μg RNA，2μL反应缓冲液，0.8μL，2 0 0 mdNTPs，2对随机引物μL，1μL 5 0U/μL逆转录酶，无RNase水，可使最终反应量达到2 2μL。

定量聚合酶链反应(QPCR)

qPCR使用StepOne实时PCR系统(应用生物系统、热费舍尔科学、美国马里兰州沃尔塔姆)和动力SYBR进行。®绿色PCR主试剂盒(应用生物系统，热费舍尔科学)。引物是定制的(表)1)，使用国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/引物-BLAST)，并由集成DNA技术(美国，科拉维尔)合成。5μL与0.9μL正、反向引物混合(0.0 5μg/μL)，0.35μL(Dh)2O，和6.25μL的SYBR®绿色混合液，最终体积为12.5μL.96孔六孔光学板在热循环器中运行，参数分别为50°C 2 min、95°C 10 min、95°C 15 s、60°C 30 s、72°C 45 s，然后是熔化曲线。用该方法计算相对mRNA的表达。−ΔΔCT方法81，和Rplp 0作为内源对照。

免疫印迹

肝样品(50 Mg)在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的裂解缓冲液(50 mm Tris-HCl，pH 7.4，1%np-40，250 mm NaCl，5 mm edta和50 mm NaF)中均匀化，蛋白质用Lowry法测定(目录号P 8340，Sigma化学品，St.Louis，MO)。80..提取液(60μg)在10%SDS-PAGE凝胶中电泳，转至含3%牛血清白蛋白的硝化纤维膜(GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)，用含3%牛血清白蛋白的TBS-吐温(20 mm Tris-HCl，pH7.5，500 mm NaCl，0.1%吐温20)封闭1h。随后用抗β-actin单克隆抗体(1：1000，圣克鲁斯，CA，美国)，多克隆兔抗磷化磷-ampk(1：500，圣克鲁斯，CA，美国)，多克隆兔抗AMPK(1：500，圣克鲁斯，CA，美国)，单克隆兔抗磷脂-srepp-1c(abcam-sma，美国)，多克隆兔抗SREBP-1c(1：500，Santa Cruz，ca，USA)，多克隆兔抗ACC(1：500，圣克鲁斯，CA，美国)，兔抗磷素-ACC(1：500，美国圣克鲁斯)。多克隆兔抗Fas(1：500，圣克鲁斯，CA，美国)，抗PPARγ(1：1000，圣克鲁斯，CA，美国)，抗磷-PPARα(1：1000，圣克鲁斯，CA，美国)和抗PPARα(1：1000，圣克鲁斯，CA，美国)与抗兔或抗小鼠多克隆抗体结合辣根过氧化物酶(HRP)孵育90 min；1：20000，美国加利福尼亚州圣克鲁斯)。用ECL试剂盒(美国药典，GE保健生命科学)用化学发光法检测免疫反应蛋白，并用图像定量LAS 4000(GE保健生命科学，美国马里兰州马尔堡)进行检测。用ImageMaster TotalLab软件(TotalLab)进行密度定量分析。

细胞因子测定

应用肿瘤坏死因子α、IL-1β和IL-10细胞因子对血浆和肝组织进行分析.使用的协议遵循制造商的规格(研发、系统公司、明尼阿波利斯、缅因州)。用抗肿瘤坏死因子α、IL-1β和IL-10单克隆抗体致敏96孔微板，稀释于pBS中，室温孵育24h。用PBS/4%牛白蛋白血清(SAB-Sigma化学试剂，St.Louis，MO，USA)封闭平板，室温孵育2h。用0.05%PBS-吐温-20缓冲液进行三次洗涤后，加入样品和标准曲线系列稀释剂，室温下孵育1h。然后，将生物素结合抗体添加到培养皿中，孵育1小时.随后，加入链霉亲和素过氧化物酶20分钟。3‘，3’，5，5‘四甲基联苯胺(TMB，Zymed)在平板上加入3’，3‘，5’，5‘四甲基联苯胺(TMB，Zymed)，加入硫酸1M停止反应。

统计分析

使用GraphPad Prism软件Version 6.0(美国加利福尼亚州GraphPad Inc.)进行统计分析，并包括未配对学生的统计分析。t-测试，单向方差分析，邓尼特多重比较检验，双向方差分析，图基多重比较检验.具体的统计分析载于这些数字的传说中。结果表示为平均±标准误差，在下列情况下，差异被认为是显著的。p < 0.05.

数据可维护性

在本研究过程中生成或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章(及其补充信息文件)中。