B-、T细胞和单核细胞群体的圆环RNA小体 用12份标本的高深度核糖缺失rna-seq数据，对健康供者B-、T-细胞和单核细胞中CircRNA的表达进行了研究，其中每组细胞从外周血单个核细胞和PBMC中各重复4次(GEO系列ID：GSE 110159；补充方法和补充表)。 1 ).
CircRNA的定量和注释是由CirComPara提供的。 25 ，它结合了9个圆环RNA检测软件工具(CIRI 2)。 26 芬达尔c 27 ；CIRC探索者2 28 BWA 29 星 30 塞格梅赫尔 31 和TopHat 2 32 定位器 33 圆环RNA探测仪 34 ；和Segemehl 31 )获得最可靠的背板。事实上，两种或两种以上的圆环RNA检测算法的共享输出已经被证明可以减少错误的阳性预测。 35 ,36 ..CirComPara执行读预处理质量过滤器，如适配器修整，读取平均质量选择和按读取长度过滤。此外，CirComPara对与每个圆环RNA的反向剪接连接排列的线性剪接读物进行计数，以估计从圆环RNA的宿主基因表达的线性转录本的表达。将这些值与测量循环表达式的反向剪接读取计数相结合，计算圆形和线性异构体之间的表达式比例(循环到线性表达式的比例，CLP；见方法)。此外，clp还嵌入了循环和线性表达相关的概念，从而使clp在不同条件下的变化反映了crna及其宿主基因的线性表达之间的独立率。 33
总之，至少用两种方法检测了10，148个体基因的68，007个圆环RNA。汉森报道等人 .36 ，算法大多同意高表达的圆环RNA，而只有一种算法检测到的读取计数一般较低(补充图)。 1 ).
此外，从3，323个基因中检索到至少一个细胞类型的所有生物复制体中表达的6，228个圆环RNA，称为“高度置信度”(Hc)cyclcRNAs(追加表)。 2 )。本研究报道的圆环RNA与Nicolet结果的比较 等人 .17 在先前的研究中检索到的489个HCcRNA中，有83%得到了确认的一致性，并披露了5，824个尚未对血细胞群体中表达变异进行研究的HC转录RNA(补充图)。 2A ).
在6，228份HCmRNA中，5，970和5，821分别在B-和T-细胞中表达，5，144在单核细胞中表达(见图)。 1A )。在所有三种细胞类型中，包括无处不在的CircZNF 609都检测到了大多数crcRNAs(4，763；80%)。 37 、圆环HIPK 3 38 和新颖的圆环RNA。新的CircRNAs(如CircPICALM)很可能对造血细胞具有特异性。圆环RNA由两种细胞类型共享，其中大多数在淋巴细胞之间共同存在。
图1 B-、T-细胞和单核细胞圆环RNA的比较。( a )在B-、T细胞和单核细胞中表达的6，228个高置信度(HC)圆环RNA的重叠；( b (1)HC crcRNA表达谱的主成分分析；( c )RNase R处理后证实了crcRNAs的表达。B2M、GAPDH和HPTR mRNA为阳性对照，相对表达量为2。 −∆CQ ，其中∆CQ是RNase R处理的与总PBMCRNA的差异； d )每个基因表达的crcRNAs数，在每种细胞类型中都有表达。
非监督主成分分析显示，在同一细胞群的复制体中，圆环RNA表达谱的变化相对较小，并指出了能明显区分细胞类型的圆环RNA体差异(图1)。 1B ).
不同健康献血者外周血单个核细胞中21株HCmRNA的RT-PCR检测(附表) 3 表 1 ；图1. 1C )。这一验证包括来自15个不同基因的外显子圆环RNA，这两个不同的异构体 IKZF 1 以及特定于男性的 ZFY 从Y染色体上分离出一个圆环RNA(18：63280887-63281214：−)，由独特的328bp的大环RNA循环而成。 BCL 2 内含子和一个来自新基因的圆环RNA(“基因间”，见下文)。rnase R处理后圆环RNA的循环结构被观察到的rnase R处理后的圆环RNA富集所证实，而qrt-pcr用反向剪接连接特异的不同引物来检测圆环RNA的环状结构。14 ,27 ..Sanger测序证实了所有预测的反向剪接连接。
来自新基因的多个环状异构体和圆环RNA 几乎所有的圆环RNA(99.4%)来源于注释的基因，通常与已知外显子重叠的反向剪接连接(98.9%)。在71个内含子区两端的圆环RNA中，最丰富的包括淋巴细胞特异性的cyclcBCL 2(经验证)、cyclcHLA-E、CircRASSF 3和几种cycMBL 1亚型。
几乎一半的圆环RNA宿主基因表达多个(多达20个)环状异构体(图1)。 1D )。观察到一种或几种普遍存在的亚型的优势反向剪接连接的使用和表达。在单核细胞中表达量最高的是 AGTPBP 1 (20)及 PICALM (15)在淋巴细胞中 UBAP 2 (19)和 自动取款机 (17).
34个来自基因间区的圆环RNA。在不同的组合中，利用相同的反向剪接末端的基因间圆环RNA鉴定了三个表达多个亚型的基因座。五个基因间的圆环RNA来源于Xq11.2区的一个新基因(chrX：65051462-65113813)(补充图)。 3 )。该基因座最丰富的圆环RNA，crcX(基因间)(x：65051462-65075912：+)，以前在血液中也被memczak和他的同事检测到。 12 ，经验证(图1)。 1C ).
接下来，我们研究了这种表达在多大程度上有利于线性转录体重叠背景剪接连接的圆形。当未检测到循环表达时，CLP值在0~1：0之间，0<CLP<0.5代表圆周RNA的表达量低于各自的线性亚型，0.5表示圆形和线性转录子具有等效丰度，0.5<CLP≤1表示环状异构体比各自的线性转录本表达更多。特别是当没有检测到相对于圆环RNA的线性表达时，CLP=1。有趣的是，在10个圆环RNA中没有检测到线性表达。此外，对于14个圆环RNA来说，中电异常高(>0.95)(补充表)。 4 )，包括CircGUSBP 2和CircNBPF 10，所有细胞群的中位差从0.99到1不等(补充表) 4 在单核细胞中表现出较高的CLP(0.97)。特定基因成熟血细胞的优先转录循环 5 ,39 和/或与线性RNA相比圆形的稳定性更高 16 ,40 可以解释这些发现。
细胞类型、细胞类型特异性圆环RNA表达与循环模式的比较 其次，我们旨在界定B-，T细胞和单核细胞的圆环RNA小体的差异.三个群体的配对比较-总体上，有1 369个细胞类型之间存在显著差异表达的ccRNAs(Decs)(补充表) 5 )，来源于880个基因。DEC表达谱的分级聚类反映了每种细胞类型中上调的一组环状RNA(图1)。 2A )。在一种细胞类型中只表达或过表达的DECs表明具有群体特异性的转录因子(如图所示)。 2B )：622例为B细胞，183例为T细胞，438例为单核细胞(共计1 243例；补充表) 5 )。此外，在这两个淋巴细胞群体中，有72种DES被上调(见图)。 2B-d )。基因本体论术语中没有明显丰富的KEGG通路导致B细胞特有的cyclcRNAs基因，尽管如此，它包含了参与B细胞受体信号通路的基因，如SOS 2和NFKB 1，或与B细胞功能相关的基因。相反，表达T细胞特异性转录因子的基因显着地丰富了T细胞受体信号通路。此外，单核细胞特有的圆环RNA基因显着地丰富了与单核细胞功能相关的几个生物过程和途径。其他细胞类型特征的宿主基因则具有与原始细胞没有直接联系的细胞功能(补充表)。 6 ).
图2 圆环RNA在成熟血细胞群体中的差异表达( a 1，369个细胞型表达谱的层次聚类(欧氏距离；完全聚类)。( b )Venn图显示了在每个群体中过度表达的圆环RNA的重叠：非相交部分勾勒出细胞类型特异性过表达的crRNA。( c )DECs的寄主基因仅在一种细胞类型中过表达：交叉区域代表在不同细胞类型中过表达不同环状异构体的基因。( d qRT-PCR检测15种圆环RNA的表达，其中13种在单核细胞(M)、T-细胞(T)、B-细胞(B)或T+B两种淋巴细胞群中均有表达。与RNA-seq数据一致，CircZFY和CircGRHPR的表达无显着性差异.与背景剪接有关的基因外显子显示在圆环RNA名称后面的括号中。表达相对于B-细胞的平均值。Man-Whitney U-检验，p-值*<0.05，*<0.01.
虽然细胞类型特征的圆环RNA集是不相交的，但表达特定异构体的基因集的重叠表明了另一种细胞型特异性循环模式。值得注意的是，有37个基因表达了两种细胞类型的cRNA特征，占多细胞型特异性转录因子基因的14.7%(图1)。 2C )。4种CycAKT 3亚型均呈细胞型特异性表达，3种为B-型，1种为T-型，4种为细胞型特异性，3种为B-型，1种为单核细胞。此外，有6种不同的GRK 3环状异构体在B-细胞中特异表达，而另外两种仅在单核细胞中过度表达。
用qRT-PCR对5个独立健康供体的B细胞、T细胞和单核细胞进行定量，证实rna-seq结果适用于所有15个检测的crcRNA，支持数据的稳健性和重现性。 二维空间 和补充图。 4 ).
5种圆环RNA对B-细胞有明显的上调作用，其中包括cyclcAFF 3(第4-6外显子)、CircIL4R(第6-7外显子)、CircSETBP 1(第2外显子)。此外，来自9p13.2基因组区的crcRNA高表达包括 帕克斯5 (补充图。 5 )证实：cycPAX 5(外显子2-5)和cyclcZCCHC 7(第2外显子)均为B细胞特异性的，而B-细胞中crcGRHPR的上调趋势与rna-seq数据的估计一致。 帕克斯5 在B细胞的承诺中起着显著的作用 41 的共同表达 帕克斯5 和 ZCCHC 7 线性转录本描述了从常见的淋巴细胞前体到前亲B细胞的进展过程。 42 ..提示9p13.2位点、CircPAX 5、CircZCCHC 7和CircGRHPR亚型在B细胞中均有特异性表达。以前在CD 19+细胞中检测到CircPAX 5和CircZCCHC 7。 14 ..crcZCCHC 7和cycGRHPR均在CD 34+细胞中鉴定，根据rna碱基修饰的数据，crcRNAs在人类细胞中的蛋白翻译有可能编码多肽。 10
在T细胞方面，cycIKZF1(第2-3外显子)、圆环TNIK(第5-7外显子)、圆环TXK(第2-6外显子)均有明显的过表达，并与以前的报告一致。 17 ，用于CircFBXW 7(外显子3-4)。T细胞圆环ZFY(外显子2-3)和单核细胞crcaff 2(外显子3)也呈上升趋势，与Nicolet一致。 等人 .17 证实了rna-seq结果，同时证实了淋巴细胞内crcX(基因间)和cycBCL 2(内含子)的显著上调和单核细胞内crcHIPK 3(第2外显子)的显著上调。
尼科莱 等人 .17 结果发现，在不同的血细胞类型和阶段中，有102个圆环RNA有差异表达，其中98个在我们的数据中被检测到。特别是42个圆环RNA在我们的比较中也有差异表达，其中31个是细胞类型特异性的。总的来说，我们的数据与圆环RNA簇一致，以前与成熟细胞群有关(补充图)。 2B )。以前分配给淋巴细胞特异性簇的CircRNA在B细胞或T细胞中的表达最高，其中包括CircZCCHC 7和CircFBXW 7，我们实验证实了这一点。根据我们的分析，在以前被认为是单核细胞特异性的10种转录因子中，有9种是在单核细胞中表达更多的，包括CircAFF 2。然而，在本研究中被定义为细胞型特异性的1，243种圆环RNA中的大多数，包括在本研究中，细胞型特异性过度表达的15种圆环RNA中的11种(如图1所示)。 二维空间 )，在Nicolet定义的集群中没有表示。 等人 .
接下来，我们观察了细胞类型之间的圆形异构体在线性表达上的丰度是否发生了改变。CLP在样品条件下的变化表明，圆环RNA与宿主基因线性表达之间的独立率。首先，我们观察到在淋巴样细胞(单核细胞185例，B细胞333例，T细胞364例)中，圆环RNA的数量较多(CLP>0.5)，这与以前对较小的一组圆环RNA的观察相一致。 17 ..然后，我们从495个基因中鉴定了687个不依赖于宿主基因表达的圆环RNA(补充表)。 7 )。在DECs中，163种细胞类型间的循环表达比例与差异绝对表达一致，这表明细胞群间的这些圆环RNA表达水平的变化并不是由于线性表达的相应变化。CycIKZF 1在T细胞中也有较高的CLP表达，对其在T细胞中的表达进行了验证。特别是，25个圆环RNA呈现出高且显著变化的循环表达比例(补充图)。 6 )，包括已证实的crcX(基因间)和另外三个基因间cRNA，它们都在B-和T-细胞中过表达。CycSMARCA 5在B细胞中的绝对和相对圆形表达最高，而在T细胞中的表达显著低于单核细胞(附图)。 7 ).
cycRNAs在6种B细胞前体急性淋巴细胞白血病细胞遗传学亚型中的表达 从上述转录体范围内的圆环RNA资源出发，对bcp-all中转录RNA的表达及可能的解除调控进行了研究。选择的圆环RNA显示淋巴细胞特异性和/或来源于白血病相关基因座。按照这些标准，10种圆环RNA在B细胞、T细胞或两个淋巴细胞群体中都有效的上调作用(如图所示)。 二维空间 )用于bcp-all中的定量，包括从已知基因( AFF 2 , AFF 3 , BCL 2 , Fbxw 7 , IKZF 1 , IL4R , 帕克斯5 , SETBP 1 和 ZCCHC 7 )和新发现的cycX(基因间)在淋巴细胞中的高表达。此外，cycZFY，一种在男性血细胞中高水平表达的crcRNA，在固体癌症中有致癌特性。 43 ；和CircPVT 1，最近与急性淋巴母细胞白血病有关。 22 ，包括在内。
用qRT-PCR技术检测32例bcp-全患者异种移植(PDX)标本中13种cRNA的表达(补充表)。 8 ).
所有白血病样本一起首次与来自健康献血者的B细胞进行比较(补充图)。 8 还有无花果。 3A )检测白血病细胞中crcRNA的表达。7种圆环RNA的表达与B细胞相比均有显着性差异(P<0.0 5)。CycIL4R、CircZCCHC 7和CircX(基因间)均在淋巴细胞中高表达，均较低表达。相反，在BCP中则出现过表达CircAFF 3、CircHIPK 3、CircPVT 1和CircPAX 5的现象。与CircPVT 1和CircHIPK 3不同的是，目前还缺乏对CircPAX 5和CircAFF 3的功能表征。因此，根据可能的miRNA结合位点、RNA结合蛋白(RBP)结合位点和编码潜力，获得了自定义的功能预测(图1)。 3B 和补充图。 9 ).
图3 CycRNA在患者源性BCP中的表达-所有标本及CircAFF 3和CircPAX 5的预测功能。( a 用qRT-PCR方法检测12种圆环RNA在正常人PBMC来源B-细胞和32例BCP-异种移植标本中的相对表达：MLL重排(n=4)、bcr-ABL(3)、ETV 6-RUNX 1(6)、TCF 3-Pbx 1(4)、高超二倍体(>50条染色体、7条)、“其他”(上述重排阴性，8条)。相对于B细胞的表达。只有显着的p值(<0.05)(Kruskal-Wallis检验，修正后用Benjamin amini，Krieger和Yekuteli程序进行多次检验).“B-细胞”的P值指的是B-细胞对所有BCP-所有样本(Mann Whitney U-检验，仅显示显着值)。( b) 预测圆环AFF 3和圆环PAX 5的功能和相互作用，包括预测的miRNA结合位点、序列基序可能被RNA结合蛋白(Rb)和至少150 nt的开放阅读框架(ORF)识别。
此外，我们还探讨了在主要的BCP-所有细胞遗传学亚型中圆环RNA靶组的表达情况(见图)。 3A )。细胞遗传学亚型表现为特殊的遗传损伤，包括反复易位(MLL重排、bcr/abl、ETV6-RUNX 1和TCF3-Pbx1融合)和超二倍体核型。细胞遗传学亚型特征有助于白血病患者的危险预后和治疗分层。不同亚型白血病细胞具有不同的生物学特征、基因表达谱和特异性miRNA信号。 44 ,45 ..在此背景下，观察到的细胞遗传学亚型之间存在明显的圆环RNA表达差异，增加了关于急性白血病异质性的新信息(图1)。 3A )。CircAFF 2在TCF 3-Pbx1 BCP-ALL中高表达，在ETV 6-RUNX 1 BCP-ALL中高表达，与B-细胞及其他细胞遗传学BCP-所有亚组相比表达较低。ETV 6-RUNX 1融合物可上调CircBCL 2(内含子)。在MLL重排样品中，CircSETBP 1和CircX(基因间)均明显降低。与ETV 6-RUNX 1亚型相比，CycIKZF 1在BCR-ABL和超二倍体白血病中的表达水平较低，其表达水平与B细胞相当。
