甲型流感病毒M2蛋白触发线粒体DNA介导的抗病毒免疫应答 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

胞浆线粒体DNA(MtDNA)激活cGAS介导的抗病毒免疫应答，但RNA病毒刺激mtDNA释放的机制尚不清楚。我们发现，流感病毒M2或脑心肌炎病毒2B蛋白的病毒蛋白活性以Mavs依赖的方式触发mtDNA进入胞浆的易位。虽然流感病毒诱导的胞浆mtDNA刺激cGAS-和DDX 41依赖的天然免疫应答，但流感病毒的非结构蛋白1(NS1)与mtDNA相关联，以逃避叮咬依赖的抗病毒免疫。通过缝隙连接在相邻细胞中扩增出依赖于针刺的抗病毒信号.此外，我们发现对流感病毒的针刺依赖性识别对于限制病毒在体内的复制是必不可少的。我们的结果揭示了流感病毒刺激mtDNA释放的机制，并强调了DNA传感通路在限制流感病毒复制中的重要性。

导言

病毒核酸的检测是天然免疫系统感知病毒感染的主要策略之一。1,2..环鸟苷单磷酸腺苷合成酶(cgas，又称mb 21d1)检测来自dna病毒的双链dna(Dsdna)，如单纯疱疹病毒1(hspv-1)和痘苗病毒。3,4,5或反转录的逆转录病毒dna6..在dsdna存在的情况下，cgas产生cgAMP，而cgAMP又与位于内质网(Erf)中的干扰素基因的刺激因子结合并激活(sting，也称为mita、mpys、eris和tmem 173)，以增强干扰素-β的表达和对hsv-1感染的天然免疫防御。7,8,9,10,11..cgas产生的cgAMP通过间隙连接从痘苗病毒感染的细胞转移到邻近的非感染细胞，以促进诱捕依赖的抗病毒免疫信号。12..此外，最近的报道显示，某些包被的dna病毒，包括痘苗病毒和小鼠巨细胞病毒hsv-1和逆转录病毒，将cgAMP整合并转移到新感染的细胞中，以触发依赖于刺激的IFN反应。13,14.

有趣的是，刺伤在感染某些rna病毒(如水泡性口炎病毒)后，在产生干扰素-β和限制病毒复制方面也起着至关重要的作用。7、仙台病毒(SEV)7,9,11、EMCV7新城疫病毒(NDV)11..研究表明，流感病毒的膜融合活性能刺激干扰素的产生，并呈针刺依赖性。15..此外，刺痛还能抑制病毒mRNAs的翻译，从而阻止病毒蛋白在VSV感染过程中的合成。16..此外，最近的研究强调了细胞浆mtdna在cgas介导的抗病毒免疫应答中的重要性，这些病毒感染了某些rna病毒，如vsv、淋巴细胞绒毛膜脑膜炎病毒(Lcmv)、辛德比病毒和登革热病毒。17,18,19,20..TFAM(转录因子A，线粒体)缺乏症诱导的胞浆mtDNA的积累促进cGAS依赖的干扰素刺激基因(Isgs)的表达，并对LCMV的急性感染产生抗药性。18..此外，Aguirre等人。结果显示，登革热病毒NS2B蛋白降解cGAS，以防止登革热病毒感染时释放的胞浆mtDNA激活cGAS。17..虽然这些观察表明，胞浆mtdna促进了cgas刺激依赖的先天抗病毒免疫，并赋予了对rna病毒的抵抗力。17,18,19,20，RNA病毒感染刺激mtDNA释放的机制尚不清楚。

在本研究中，我们研究流感病毒感染触发mtDNA释放的细胞机制。我们证明，流感病毒M2或EMCV2B蛋白的病毒蛋白活性对胞浆mtDNA的释放是必不可少的。此外，流感病毒NS1蛋白与胞浆mtDNA结合，可减弱cGAS-和DDX 41依赖的天然免疫应答。此外，我们还发现，在体内限制流感病毒复制所必需的是叮咬依赖的信号.这些结果强调了细胞内mtDNA在流感病毒诱导的先天抗病毒免疫应答中的重要性。

结果

甲型流感病毒触发mtDNA释放

感染hsv-1、hsv-2和小鼠γ-herpervirus 68(mhv-68)而非vsv、流感、lcmv或痘苗病毒可引起小鼠胚胎成纤维细胞mtdna应激。18..此外，登革热病毒还能刺激人肺癌细胞株A 549向胞浆释放mtDNA。17,19..为了确定流感病毒是否以一种细胞类型特异性的方式刺激mtDNA的释放，我们首先检测了候选细胞类型的mtDNA释放，包括小鼠肺成纤维细胞、人A 549细胞和人胚肾细胞系293 FT(HEK293FT)细胞，在这些细胞中流感病毒被有效感染和复制(附图)。1)。为了检测胞浆中的mtDNA，我们首先从模拟或病毒感染的细胞中提取了纯的胞浆组分。1A)。对纯胞浆提取物的分析表明，野生型流感病毒(WT)能显著诱导HEK293FT细胞mtDNA的释放。1B，cA 549细胞稳定表达SING蛋白(称为SIN-A 549细胞)和小鼠肺成纤维细胞(附图)。2)感染后24h内呈多重感染(MOI)依赖性。流式细胞术和共聚焦显微镜分析证实，流感病毒诱导的高水平的dsDNA在胞浆(图)。1D，e)。此外，我们发现，感染缺乏ns1基因的重组流感病毒(Δns1)可显著促进细胞浆mtdna的释放，而ns1基因可诱导大量的Ⅰ型ifn。21与WT病毒相比，通常被用作一种有效的IFN诱导剂。1F和补充图。2D，H)。流感病毒的ns1蛋白通过隔离病毒rna或结合到rig-i和mavs依赖的信号通路所需的其他宿主蛋白来抑制IFN反应，包括IFN调节因子3(Irf 3)的磷酸化。22,23,24,25,26..这些观察表明，流感病毒的NS1蛋白直接抑制mtDNA释放到胞浆，或完全激活依赖于mtDNA的rig-i/mavs信号是流感病毒感染细胞释放mtDNA所必需的。为了解决这些可能性，我们用ΔNS1流感病毒感染了EGFP或NS1转染的HEK293FT细胞。ns1蛋白显著抑制ΔNS1流感病毒作用下mtDNA的胞浆易位。1g)。接下来，我们研究了Mavs是否是流感病毒诱导的mtDNA释放所必需的.为此，我们用ΔNS1流感病毒感染了WT或Mavs缺陷的HEK293FT细胞。引人注目的是，我们发现在Mavs缺陷的HEK293FT细胞中，流感病毒诱导的mtDNA释放减少了。氢)。为了提供明确的证据证明小牛对流感病毒诱导的mtDNA释放负有责任，我们进行了一个互补实验。在ΔNS1流感病毒感染后，从慢病毒中表达的完整小牛能够完全恢复Mavs缺陷MEFs触发胞浆mtDNA释放的能力(如图1所示)。1I)。以前的研究已经证明bax/bak在mtdna释放到胞浆中起着关键作用。27,28..在sev感染的情况下，病毒激活的irf 3与bax结合，易位到线粒体，并导致细胞色素c的释放。29..事实上，感染ΔNS1流感病毒比WT病毒引起更多IRF 3磷酸化(补充图)。3A)。此外，WT和ΔNS1流感病毒均以Mavs依赖的方式诱导IRF 3磷酸化(补充图)。3B)。此外，ΔNS1流感病毒感染后，bax基因敲除HEK293FT细胞后，细胞内mtDNA的释放明显降低。1J)。这些数据表明，流感病毒刺激mtdna向胞浆释放，而mtdna在流感病毒感染时释放则需要依赖Mavs的信号。

流感病毒M2蛋白触发胞浆mtDNA释放

接下来，我们研究了流感病毒刺激mtDNA释放的机制。为了鉴定能刺激mtDNA释放到胞浆中的流感病毒蛋白，我们用编码流感病毒蛋白的表达质粒转染HEK293FT细胞。值得注意的是，我们发现流感病毒M2蛋白足以在转染的HEK293FT细胞中触发mtDNA的释放。2A)。流感病毒M2蛋白是一种质子选择性离子通道，在病毒进入和萌芽过程中对病毒的脱衣起着重要的作用。30..为了检测m2离子通道的活性是否需要诱导mtdna的释放，我们用编码流感病毒M2蛋白的表达质粒(M2del)从跨膜区(M2del)转染HEK293ft细胞。29–31)。这些氨基酸是M2离子通道活性所必需的。31..值得注意的是，mtDNA在转染M2del29-31质粒的细胞中完全缺失。2B)。细胞透性钙对细胞的作用2+-螯合剂BAPTA-AM，而不是抗氧化剂Mito-tempo，一种清除线粒体ROS的清除剂，在不影响M2蛋白表达水平的情况下，显著阻断流感病毒M2蛋白释放胞浆mtDNA。2C)。此外，M2诱导的细胞胞浆mtDNA释放是Mavs依赖的(图一)。二维空间)。接下来，我们研究了M2离子通道活性对mtDNA释放的要求是否可以通过感染缺乏M2蛋白29-31氨基酸的重组流感病毒来再现。为此，我们构建了缺乏rgPR 8/m2del蛋白29-31氨基酸的重组流感病毒(rgPR 8/m2del)。29–31病毒)(附图。4A)。与我们上一次报告一致32，rgPR 8/m2del29–31病毒未能刺激从LPS启动的骨髓来源树突状细胞(BMDC)或巨噬细胞(BMMS)释放IL-1β(补充图)。4B，c)。虽然，rgPR 8/M2del的感染程度29–31HEK293FT细胞中的病毒与WT rgPR8病毒相似(附图)。4D，e)，M2del29–31与WT病毒感染的细胞相比，病毒显着地减少了HEK 293 FT细胞中mtDNA的释放(图一)。2E)。另外，金刚烷胺敏感的重组流感病毒(rgPR 8/M2)N31S)33金刚烷胺作用下HEK293FT细胞mtDNA的释放明显减少(图1)。2F)。我们先前证明，流感病毒M2蛋白的离子通道活性对caspase-1的激活是必不可少的。32..此外，已有的研究表明caspase-1或caspase-11切割的gsdmd能诱导质膜孔的形成。34,35,36..这些观察促使我们检查GSDMD是否参与了流感病毒感染时线粒体mtDNA的释放。与以前的结果一致35，GSDMD残基1-275过表达(GSDMD)1–275)在HEK 293 FT细胞中，细胞死亡(附图)。5A)。然而，我们发现GSDMD1–275仅表达不足以触发线粒体mtDNA的释放(补充图)。5B)。此外，流感病毒刺激mtDNA向胞浆释放的HEK293FT细胞没有表达可检测到的GSDMD(补充图)。5C)。这些数据表明M2蛋白的离子通道活性对流感病毒感染细胞mtDNA的释放具有重要意义。

EMCV病毒蛋白2B刺激mtDNA释放

接下来，我们希望确定其他RNA病毒的病毒蛋白，即跨膜形成孔的病毒蛋白，是否能刺激mtDNA释放到胞浆中。感染EMCV后24h内，HEK293FT细胞mtDNA的释放呈MOI依赖性。3A，b和补充图。1A)。流式细胞术和共聚焦显微镜分析证实，EMCV可诱导胞浆中dsDNA含量升高(见图)。3C，d)。我们曾证明，EMCV病毒2B通过刺激Ca激活NLRP 3炎症小体。2+从胞内储存到胞浆的通量37..因此，我们接下来研究EMCV的2B蛋白是否足以触发mtDNA释放到胞浆中。值得注意的是，在HEK293FT细胞中，2B蛋白的过度表达显著增加了mtDNA向胞浆中的释放(如图所示)。3E)。此外，BAPTA-AM处理HEK293FT细胞可阻断EMCV感染所致mtDNA的释放或2B蛋白的过度表达，而不影响2B蛋白的表达水平。3F，g)。这些结果表明，流感病毒和EMCV病毒的Vroporin活性对mtDNA的释放是必不可少的。

流感病毒刺激cgas-和ddx 41依赖的β基因

考虑到mtdna触发cgas依赖的天然免疫反应18,19,27,28流感病毒或EMCV感染细胞的胞浆mtDNA可能引发cGAS依赖的抗病毒免疫应答。为了验证这一想法，我们用流感病毒感染了cGAS-、Sting-或Mavs缺陷的原代肺成纤维细胞。腺病毒诱导的IFN-β基因表达在很大程度上依赖于cGAS和STING(附图)。6)。值得注意的是，在流感病毒或EMCV感染的cGAS-、Sting-和Mavs缺陷细胞中，IFN-β基因的表达明显降低。4A，b和附图。7和8)。由于HEK 293 FT细胞不表达可检测到的cGAS蛋白水平，我们建立了稳定表达EGFP的HEK 293 FT细胞或分别称为EGFP-293 FT或cGAS-293 FT的HEK 293 FT细胞。虽然cGAS的过表达降低了SING的表达水平(补充图)。9我们可以在cGAS-293 FT细胞中检测到刺痛(见图)。4C)。重要的是，cGAS-293 FT细胞在流感病毒或EMCV感染后显著增强了IFN-β基因的表达。4D)。此外，流感病毒在感染后24小时内在SIN-A 549细胞或原代肺成纤维细胞中诱导高水平的cGAMP(图1)。4E，f)。由于TRIM 32介导的K63连接的SING泛素化在Sev或HSV-1诱导的抗病毒免疫应答中起重要作用。38利用CRISPR/Cas9系统建立TRIM 32基因敲除A 549细胞(附图)。10A发现TRIM 32基因敲除针刺A 549细胞显著降低流感病毒感染后IFN-β基因的表达(附图)。10b)。这些数据表明，在流感病毒感染时，cGAS依赖的信号可能被激活.

虽然HEK293FT细胞没有表达可检测到的cGAS蛋白水平(见图)。4C和补充图。9我们发现ΔNS1流感病毒诱导的IFN-β基因表达依赖于HEK293FT细胞的SING(附图)。11A，b)。这使得我们考虑到其他DNA传感器可能在流感病毒感染后诱导IFN-β基因表达中起作用。在逆转录病毒感染的情况下，DDX 41识别rna/dna混合逆转录中间体。39..此外，mtdna还含有与dna杂交的RNAs。40..这些观察促使我们研究流感病毒诱导的细胞胞浆mtDNA是否会触发DDX 41依赖的天然免疫应答。为了解决这一可能性，我们用siRNA靶向处理HEK293FT细胞。DDX 41(补充表)1)。虽然dx 41在d2sc细胞(小鼠髓系直流电系)中被击倒，但对流感病毒诱导的干扰素-α/β的产生没有影响。41我们发现，感染WT或ΔNS1流感病毒后，DDX 41基因敲除HEK293FT或cGAS-293 FT细胞后，IFN-Δ基因的表达明显降低。5A和补充图。11C，d)。此外，还抑制了布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)，该激酶磷酸化ddx 41以促进诱捕诱导干扰素-β基因的表达。42，化学抑制剂LFM-A13可显著降低流感病毒诱导的cGAS-293 FT细胞中IFN-β基因的表达。5B)..为了证实DDX 41在流感病毒诱导的IFN-β基因表达中的重要性，我们利用CRISPR/Cas9系统建立了DDX 41基因敲除-A 549细胞。12A)。虽然DDX 41-基因敲除-A 549细胞释放了相当水平的mtDNA进入胞浆中流感病毒感染(补充图)。12bDDX 41基因敲除A 549细胞可明显降低流感病毒感染后IFN-β基因的表达。5C)。在逆转录病毒感染的情况下，DDX 41识别rna/dna混合逆转录中间体。39..因此，我们接下来测试了核糖核酸酶H(RNase H)对流感病毒感染后干扰素-β基因表达的影响。尽管用RNase H处理ΔNS1流感病毒感染细胞的纯胞浆提取物并没有改变细胞内mtDNA的水平(图1)。5D转染RNase H处理的细胞液可显著降低HEK293FT细胞中IFN-β基因的表达。5E表明rna/dna杂交在流感病毒诱导的IFN-β基因表达中起重要作用。siRNA靶向治疗SIN-A 549细胞的实验研究DDX 41不影响流感病毒感染后cGAMP的水平。5F)，该突变对DDX 41毒刺的招募至关重要。42，对苯丙氨酸(Y414F)抑制干扰素-β基因的表达。5G，h)。这些数据表明DDX 41在流感病毒诱导的IFN-β基因表达中起着重要的作用.

我们进一步研究了mtDNA在流感病毒诱导的干扰素-β基因表达中的重要性.为此，我们生成了mtdna缺失的ρ。0HEK293FT(附图)13A)。ρ0HEK293FT细胞在ΔNS1流感病毒感染后抑制线粒体DNA释放到胞浆中(补充图)。13B)。虽然mtDNA的缺失并没有改变DDX 41、Rig-I、Mavs和SING的表达水平(补充图)。13C)、ρ0HEK 293 FT细胞感染ΔNS1流感病毒后显著降低IFN-Δ基因表达(附图)。13D)。类似地，ρ0cGAS-293 FT细胞感染WT或ΔNS1流感病毒后显著降低IFN-Δ基因表达(附图)。14表明mtDNA在流感病毒诱导的IFN-β基因表达中起重要作用.这些数据表明，流感病毒感染以细胞类型特异性的方式刺激cGAS-和DDX 41依赖的IFN-β基因的表达。

流感病毒NS1蛋白与mtDNA相关

流感病毒NS1蛋白与dsRNA无序列特异性结合，防止dsRNA激活蛋白激酶(PKR)介导的抗病毒应答43,44,45,46,47..此外，据报道，流感病毒ns1蛋白结合细胞dsdna抑制抗病毒基因的转录。48..这促使我们考虑流感病毒NS1蛋白可能与胞浆mtDNA有关，从而抑制cGAS-或DDX 41依赖的天然免疫应答。为了解决这一可能性，我们首先进行了亚细胞分离和免疫沉淀研究。ΔNS1流感病毒感染HEK293FT细胞后，标记的NS1或M2蛋白在HEK293FT细胞中被抗标志抗体或对照抗体免疫沉淀。虽然流感病毒的NS1蛋白与dsDNA在流感病毒感染细胞的胞浆中没有共定位(附图)。15我们发现在感染ΔNS1流感病毒后，标记的NS1蛋白与胞浆mtDNA共同免疫沉淀(如图所示)。6A和补充图。16)。同样，流感病毒NS1蛋白与抗dsDNA抗体共沉淀。17a，b)。此外，抗dsDNA抗体与cGAS、DDX 41和TFAM共免疫共沉淀于WT PR8流感病毒感染后的cGAS-293 FT细胞中(附图)。17B)。此外，生物素标记的45 bp干扰素刺激DNA(ISD)免疫共沉淀与NS1和DDX 41在cGAS-293 FT细胞感染后，WT PR8流感病毒(补充图)。18)。由于ns1蛋白中38位和41位的两个碱基氨基酸对其dsrna或dsdna结合活性很重要。45,48,49我们接下来研究了这两个氨基酸(R38和K41)在NS1蛋白和mtDNA之间的作用，发现在感染ΔNS1流感病毒后，标记的R38A/K41A NS1突变体减少了与胞浆mtDNA的关联(如图1所示)。6A)。因此，R38A/K41A NS1突变体不能抑制ΔNS1流感病毒感染后mtDNA的胞浆易位和IFN-Δ基因的表达。6B)。此外，感染一种表达突变体NS1 R38A/K41A蛋白(rgPR 8/ns1)的重组流感病毒。38/41A与WT病毒感染细胞相比，与WT病毒感染的细胞相比，可检测到的mtDNA水平和Sting依赖的IFN-β基因表达水平明显提高，而不影响NS1蛋白的表达水平。6C，d)。这些结果表明，流感病毒NS1蛋白可能通过其RNA结合域与mtDNA结合，从而阻断诱杀依赖的IFN-β基因的表达。

NS1蛋白抑制mtDNA免疫刺激潜能

由于流感病毒的NS1蛋白与mtDNA相关，我们接下来研究NS1蛋白是抑制dsDNA还是mtDNA介导的IFN-β启动子活性。R38A/K41A NS1蛋白对dsDNA或mtDNA介导的IFN-β启动子活性有明显的抑制作用。7A)。这使得我们考虑了mtDNA相关蛋白(包括NS1或TFAM)的缺失可能会增强mtDNA刺激天然免疫反应的能力。与上一次报告一致18在稳态条件下，TFAM耗竭增强了细胞内mtDNA的检测水平和IFN-β的基本表达水平(图1)。7b，c)。此外，TFAM缺失显著提高了流感病毒感染后可检测到的胞浆mtDNA和干扰素-β基因表达水平。7C)。此外，用蛋白酶K处理流感病毒感染细胞的纯胞浆提取物时，TFAM和NS1蛋白都会被耗尽(如图所示)。7D)以及流感病毒感染后可检测到的胞浆mtDNA水平的提高(图一)。7E和补充图。19)。因此，用蛋白酶K处理的流感病毒感染细胞胞浆提取物转染cGAS-293 FT细胞，与未处理的流感病毒感染细胞对照提取物相比，显著增强了IFN-β基因的表达。7F)。此外，我们发现感染EMCV而不是流感病毒或腺病毒降低了TFAM(补充图)的表达水平。20)。这些结果表明，流感病毒的NS1蛋白可能与mtDNA结合，逃避胞浆DNA传感器的识别。

连接蛋白43增强SING依赖性抗病毒反应

cgas检测胞浆dna可产生第二信使cgAMP，通过缝隙连接触发旁观者细胞的抗病毒免疫。12..因此，我们接下来检查先天免疫信号是否从流感病毒感染的细胞转移到邻近细胞。为此，我们用ΔNS1流感病毒感染了cGAS-293 FT细胞。在感染后9h，将未感染的WT细胞或未感染的HEK293FT细胞与病毒感染的cGAS-293 FT细胞共培养15h(见图)。8A)。我们发现，当βNS1流感病毒感染的Δ病毒感染的cGAS-293 FT细胞与含刺缺陷的HEK293FT细胞共培养时，Δ基因的表达明显降低。8A)。此外，缝隙连接抑制剂卡贝诺酮能显著抑制ΔNS1病毒诱导的IFN-β基因的表达和IRF 3的磷酸化，而不影响M2蛋白的表达水平。8B，c)。因此，我们接下来研究缝隙连接蛋白43(Cx 43)在流感病毒感染诱导干扰素-β基因表达中的作用。ΔNS1流感病毒感染的cGAS-293 FT细胞Cx 43基因敲除后，ΔNS1流感病毒感染的cGAS-293 FT细胞与Cx 43-足够的HEK293FT细胞共培养时，Δ-NS1流感病毒感染的cGAS-293 FT细胞的IFN-β基因表达显著降低(图一)。8D，e)。这些结果表明，细胞间通过缝隙连接来增强流感病毒感染细胞到旁观者细胞的抗病毒免疫是必要的。

cGAS或针刺缺乏症对流感病毒复制的影响

最后，我们希望探讨mtDNA释放对流感病毒感染后肺组织cGAS/Sting依赖性干扰素-β基因表达的影响。在感染流感病毒的WT小鼠中，细胞浆mtDNA在支气管肺泡(BAL)液中的释放在第2天开始明显。在第4天达到顶峰。(无花果)9A)。同样，从第2天开始，WT小鼠肺组织中IFN-β的mRNA水平也开始明显升高。在第4天达到顶峰。(无花果)9B)。此外，我们还发现感染流感病毒的CGAS、SINT和MavsKO小鼠肺组织中IFN-β的表达水平明显低于WT小鼠(见图)。9C，d)。因此，我们接下来评估了cGAS和针刺缺乏对流感病毒体内复制的影响。与上一次报告一致50感染小鼠肺内病毒滴度在5d时，WT与MavsKO小鼠相当。(无花果)9E)。同样，与WT小鼠相比，cGAS缺乏对肺内病毒滴度没有显著影响(图1)。9E)。相比之下，与WT小鼠相比，KO小鼠的肺内病毒滴度明显升高(图1)。9E)。虽然这些数据共同表明了诱捕依赖的信号在诱导干扰素-β基因表达和限制流感病毒在体内复制中的重要性，但cgas和其他dna传感器仍有可能诱导冗余信号通路，以细胞类型特异性的方式限制病毒复制。

讨论

先天免疫系统利用模式识别受体来检测病原体相关的分子模式，如病毒核酸。TLR 7和Rig-I检测流感病毒RNA时，NLRP 3检测流感病毒感染后细胞内离子通量。我们曾证明，病毒毒素(如流感病毒M2或EMCV2B蛋白)的离子通道活性对nlrp 3炎症体的激活是必不可少的。32,37..我们在此发现了一种以前未知的机制，即流感病毒和EMCV通过病毒蛋白的活性刺激mtDNA释放到胞浆中。mtDNA在流感病毒或EMCV感染后的胞浆易位刺激cGAS-和DDX 41依赖的先天抗病毒免疫应答。考虑到在细胞内离子环境中，病毒毒素引起的干扰伴随着锰的存在。2+从膜包被细胞器流出，病毒毒素的离子通道活性可能是提高cgas对dsdna的敏感性所必需的。51.

我们的数据表明，与WT病毒相比，感染ΔNS1流感病毒可促进细胞内mtDNA的释放和诱杀依赖的IFN-β基因的表达。几种可能的机制可以解释流感病毒的NS1蛋白如何抑制mtDNA向胞浆的释放和流感病毒感染的针刺依赖性识别。首先，流感病毒的NS1蛋白可能是通过抑制mtDNA的rig-I/Mavs依赖信号来抑制mtDNA的胞浆易位的(图一)。10)。事实上，我们发现流感病毒以小牛依赖的方式刺激胞浆mtDNA的释放.在sev感染的情况下，病毒激活的irf 3与bax结合，易位到线粒体，并导致细胞色素c的释放。29..此外，先前的研究表明bax/bak在mtdna释放到胞浆中起着关键作用。27,28..同样，我们发现bax基因敲除显著降低了流感病毒感染后细胞内mtDNA的释放。Bak/bax大孔的形成引起线粒体内膜突出，刺激线粒体DNA向胞浆释放。52..这些细胞质mtdna可以根据tfm与mtdna的比例，被包装成不同层次的高阶结构。53(无花果)10)。考虑到cgas优先结合了不完全的类核子结构或U转dna。54，TFAM的交叉结合连接胞浆U型转DNA53在流感病毒感染诱导cGAS/Sting依赖的IFN-β基因表达中起重要作用。其次，由于流感病毒的NS1蛋白与mtDNA相关，并且抑制了可检测到的胞浆mtDNA水平，因此NS1蛋白可能通过胞浆DNA传感器识别mtDNA来掩盖mtDNA。10)。事实上，我们发现，用蛋白酶K处理流感病毒感染细胞的纯胞浆提取物，可以提高流感病毒感染后可检测到的胞浆mtDNA水平。因此，用蛋白酶K处理的流感病毒感染细胞胞浆提取物转染cGAS-293 FT细胞，与未处理的流感病毒感染细胞对照提取物相比，可显著提高IFN-β基因的表达，提示流感病毒NS1蛋白可能与mtDNA结合，逃避细胞内DNA传感器的识别。10).

流感病毒-通过膜融合过程诱导人单核/巨噬细胞样细胞系THP 1产生Ⅰ型干扰素(ifn-α/β)，但与cgas无关。15..此外，dx 41在小鼠髓系d2sc细胞中的敲除对流感病毒诱导的干扰素-α/β的产生没有影响。41..此外，基因敲除对流感病毒诱导的干扰素-β基因表达无影响。16..相反，我们的数据显示流感病毒刺激小鼠(原代肺成纤维细胞)和人(HEK 293 FT和A 549)细胞中cGAS-、DDX 41-和Sting依赖性IFN-β基因的表达。此外，我们还发现，流感病毒在感染后24小时内在SIN-A 549细胞或原代肺成纤维细胞中诱导了高水平的cGAMP。此外，cbx和cx 43基因敲除对细胞的抑制作用也抑制了β基因的表达.这些数据共同表明，流感病毒感染以一种特定于细胞类型的方式刺激叮咬依赖的通路，而细胞间通过缝隙连接的通讯在向旁观者细胞传播叮咬依赖的抗病毒信号方面起着重要作用(图1)。10).

虽然cGAS是流感病毒感染后肺内IFN-β基因表达最大的要求，但与WT小鼠相比，cGAS缺乏对肺内病毒滴度无明显影响。相反，在体内限制流感病毒复制所必需的是叮咬依赖的信号.这一结果的一个可能的解释是，cGAS和其他DNA传感器导致了限制流感病毒在肺组织中复制所需的冗余信号通路。另一种可能是，毒刺依赖的翻译抑制可能会限制流感病毒在体内的复制，而不依赖于小牛。16..因为cGAS限制了黄病毒的复制，包括登革病毒和西尼罗河病毒。17,55，cgas对每种rna病毒的抗病毒作用可能不同。55.

总之，我们的发现大大扩展了我们对流感病毒和EMCV如何触发mtDNA释放到胞浆并刺激cGAS-和DDX 41依赖的先天抗病毒免疫反应的理解。因为线粒体dsRNA释放到胞浆会触发mda 5依赖的先天抗病毒信号。56我们的结果提示，病毒毒素引起的线粒体功能障碍可能在诱导小牛依赖的先天抗病毒免疫反应中起作用。更好地理解RNA和DNA传感通路在病毒感染反应中的相互作用，将有助于开发治疗病毒感染和相关疾病的新的治疗策略。

方法

小鼠

年龄和性别匹配的C57BL/6J从日本SLC公司获得。作为WT对照。cGAS−/−, 刺GT/GT(C57BL/6J-Tmem173gt/J)小牛−/−小鼠从杰克逊实验室购买(分别为026554、017537和008634)。所有动物实验均按照东京大学动物护理和使用委员会的规定进行，并经东京大学医学院动物实验委员会批准。

细胞和病毒

为制备BMMS，采用Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(DMEM；Nacalai Tisque)冲洗取胫骨和股骨骨髓。用DMEM+10%热灭活胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(L-谷氨酰胺)和30%L 929(由岩崎明子博士提供)培养骨髓细胞，培养上清中加入巨噬细胞集落刺激因子(37°C)，培养5d。对BMDC，取上述胫骨和股骨骨髓，在含10%热灭活FBS、L-谷氨酰胺和5%J558L杂交瘤细胞(由Heung Kyu Lee博士提供)的RPMI 1640培养基(Nacalai Tesque)中培养5天，培养上清液中含有粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。每隔一天更换一次含GM-CSF的培养基。为获得原代肺成纤维细胞，采用剃须刀片切肺，在含有0.25%胰蛋白酶和0.5mmEDTA的DMEM中，37°C下孵育30 min。然后，通过使用无菌注射器的70μm细胞过滤器(BD)，机械地将单个肺消化成单细胞悬液。离心后(200×g在完全的DMEM培养基中再悬浮5 min，在10 cm的培养皿中培养10d。cGAS−/−刺GT/GTMEF按标准程序从胚胎中产生。HEK293FT细胞(#R70007，Invitrogen)和A 549细胞(#CCL-185，ATCC)在添加10%FBS的DMEM中维持。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞(由长谷川Hideki博士提供)在Eagle的最小必需培养基(E-MEM；Nacalai Tisque)中培养，附加10%的FBS。

在35℃条件下，在10日龄可育鸡卵的尿囊腔中培育了WT/PR8流感病毒，共培养2d。本研究采用质粒反向遗传学方法，产生了重组流感病毒，包括WT A/PR8流感病毒(简称rgPR 8)。2)57..在胶原包被的6孔板上转染HEK 293 FT细胞，共转染8个病毒RNA表达质粒和表达PA、PB1、PB2和NP的质粒(Takara Bio)。转染48h后，用1μg/ml乙酰化胰蛋白酶在37℃培养15 min。离心后(600×g细胞上清液在6孔板中接种MDCK细胞，在含1μg/ml乙酰化胰蛋白酶的Opti-MEM中培养2~3d，拯救重组流感病毒。这些重组流感病毒在37℃稳定表达流感病毒NS1蛋白的MDCK细胞或MDCK细胞中培养2天。58..所有实验所用的EMCV在L 929细胞中培养15h，37˚C。人腺病毒5型来源于ATCC(VR-1516)。病毒在−80°C保存，病毒滴度以流感病毒MDCK细胞和EMCV L 929细胞为标准菌斑法定量。用50%组织培养感染剂量(TCID)测定腺病毒滴度。50)测定。实验感染是在东京大学医学科学研究所的BSL-2设施中进行的。东京大学医学科学研究所的伦理委员会批准了所有的实验规程。

流感病毒感染

在37°C条件下，以1~10的MOI感染细胞1h，用完全的DMEM培养24h，不使用胰蛋白酶。

在鼻内感染时，腹腔注射戊巴比妥钠(Somnopentyl，Kyoritsu Seiyaku Co.，日本东京)，然后在鼻内应用30μ1的病毒悬液(10 0 0 Pfu)进行感染。

抗体

用肽合成法(FITPPPRFPTISL)提供的2B蛋白C端区免疫兔，获得抗EMCV2B抗体(1：1000)。抗甲型流感病毒M2蛋白(14C2，Cat#ab5416；1：1000)和抗dsDNA(35I9 DNA，Cat#ab27156；1：600)的单克隆抗体购自ABCAM。从Sigma-Aldrich公司获得抗旗标单克隆抗体(M2，Cat#F 1804；1：1000)，兔抗国旗多克隆抗体(Cat#F 7425；1：10，000)和钙蛋白(Cat#C 4731；1：2000)。反绿色荧光蛋白(GF 200，猫#04363-66；1：10，000)来自纳卡拉泰斯克(日本京都)。抗-cGAS(D1D3G，猫#15102；1：1000)，抗DDX 41(D3F1Z，猫#15076；1：1000)，抗刺(D2P2F，猫#13647；1：1000)，抗小牛(猫#3993；1：1000)和抗TFAM(D5C8，Cat 8076；1：1000)是从细胞信号技术(美国丹弗斯，美国)购买的。抗流感病毒ns1(ns1-23-1，猫#sc-130568；1：1000)，抗HA(F-7，猫#sc-7392；1：1000)，抗-myc(9E10，猫#sc-40；1：1000)，抗微管蛋白(DM1A，猫#sc-32293；1：2000)，抗-Tom20(FL-145，Cat#sc-11415；1：1000)，抗-mfn 2(XX-1，cat#sc-100560；1：1000)，抗连接素43(F7，cat#sc-271837；1：1000)是从圣克鲁斯生物技术公司购买的。小鼠抗大鼠单克隆抗体(Alme-1，CAT#AG-20B-0009-C100；1：1000)来自Adipogen.

慢病毒载体

为了产生表达cGAS蛋白的慢病毒，将编码cGAS蛋白的全长cDNA克隆到pLenti6.3/V5-Topo载体(Invitrogen)中。用脂质体2000(Invitrogen)将表达cGAS的3μg表达pLenti6.3/V5-Topo载体与ViraPowerPackageMix(Invitrogen)共转染HEK293FT细胞。24h后用新鲜培养基代替培养基。转染后72~96h，取含慢病毒的上清液。一种编码无关蛋白的慢病毒(EGFP)作为对照。58..将含有10μg/ml聚戊烯的砧木病毒接种到HEK293FT细胞中。24h后用新鲜培养基代替培养基。最后，在含杀菌素的完整培养基(10μg/ml)中培养2~3周，杀死未转染的细胞。

基因敲除细胞系的建立

将单个引导rna的每个靶序列克隆到pX 458(Addgene，#48138)中，然后对寡核苷酸对进行退火(补充表)。3)。转染HEK293FT或A 549细胞，培养2~3d。用流式细胞仪(FACS)对EGFP阳性细胞进行分类，形成单个集落。基因缺失经测序和免疫印迹证实。每个基因都有代表性的克隆进行实验。

mtDNA缺失ρ0细胞株的建立

如上文所述，HEK 293 FT或cGAS-293 FT细胞在添加10%fbs、丙酮酸(100μg/mL)、溴化乙锭(EtBr)(500 ng/mL)和尿苷(50μg/mL)的dmem培养基中培养2周。59..用以下引物定量PCR证实mtdna的缺失：人mtDNA向前，5‘-cctagataacacgcaat-3’，反向，5‘-tagaaggatggtagagag-3’；人β-actin向前，5‘-ctggaggtgaagggaca-3’，反向，5‘-aagacttcctgtaacatgca-3’(补充表3‘)。4)60,61..mtdna的相对量是mtdna与编码β-actin的核dna的比值。

胞浆提取物中mtDNA的检测

用含150 mM NaCl、50 mM HEPES pH7.4和20μ/ml洋地黄素(Nacalai Tesque)的缓冲液2 ml灌洗气管和肺收集Bal液，测定肺组织中胞浆mtDNA的释放量。将HEK293FT、A 549、原代肺成纤维细胞或MEFs再悬浮于含150 mM NaCl、50 mM HEPES pH7.4、20μg/ml洋地黄素(Nacalai Tesque)的5 0μ1缓冲液中。匀浆在端旋转器上孵育10 min.离心后(1000×g(3)3次，上清液转移至新鲜管中，离心时间为17，000×次。g10分钟。用QIAQuick核苷酸去除试剂盒(QIAGEN)从这些纯的胞浆组分中分离出胞浆mtDNA。用QIAamp DNA小试剂盒(QIAGEN)从全细胞提取物中提取mtDNA。用mtDNA引物对纯细胞和全细胞提取液进行定量PCR检测：人mtDNA前向，5‘-cctagataacaccgcaat-3’和反向，5‘-tagaagagcatggtagagag-3’；小鼠mtDNA向前，5‘-gccagatatagatagcattccc-3’，反向，5‘-gttcatcctgtttgctcc-3’(补充表)。4)60,62..相对胞浆mtDNA水平按mtDNA总量进行归一化。模拟感染或EGFP转染细胞的值设置为1。

定量PCR

用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中提取总RNA，用寡核苷酸(DT)引物反转录成cDNA。SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)and a LightCycler instrument(Roche Diagnostics)were used for quantitative PCR with the following primers：human IFN-βforward，5′-ctcctggctaatgtctatca-3′，and reverse，5′-gcagaatcctcccataatat-3′；humanβ-actin forward，5′-ctggaacggtgaaggtgaca-3′，and reverse，5′-aagggacttcctgtaacaatgca-3′；mouse IFN-βforward，5′-gcactgggtggaatgagactattg-3′，and reverse，5′-ttctgaggcatcaactgacaggtc-3′；mouse GAPDH forward，5′-accacagtccatgccatca-3′，and reverse，5′-tccaccaccctgttgctgta-3′37,61,62流感病毒np向前，5‘-agacatctgacatgaggac-3’，反向，5‘-gtcaaaggaaggacgatc-3’(补充表)4).

干扰素-β报告试验

cGAS-293 FT细胞接种于24孔板上，共转染p125-luc(东京大学Taniguchi T.Taniguchi)100 ng，pRL-TK 2.5纳克，聚(da：dt)或mtDNA 100 ng，pCA 7-EGFP，pCA 7-旗帜-ns1或pCA 7-国旗-ns1(r38A/k41A)。58,61..转染24h后，用双荧光素酶报告分析系统(Promega)对细胞进行裂解，检测荧光素酶活性。将数据归一化，以了解转染对肾荧光素酶活性的影响。

ELISA法

24小时收集无细胞上清液。用双抗体(EBioscience)酶联免疫吸附试验(ELISA)分析上清液中IL-1β的存在情况。32..cGAMP ELISA(开曼化学)按制造商的指示进行。

流式细胞术

Cells were fixed and permeabilized using a Cytofix/Cytoperm kit(BD Biosciences)，and intracellularly stained with mouse monoclonal anti-dsDNA(35I9 DNA，Cat#ab27156；Abcam；1:600)，anti-connexin 43(F-7，Cat#sc-271837；Santa Cruz；1:100)antibodies，or rabbit polyclonal antibodies against influenza virus M2(1:600)or EMCV 2B(1:600)proteins followed by FITC-labeled goat anti-mouse IgG(Cat#405305；BioLegend；1:300)，PE-labeled goat anti-mouse IgG(Cat#405307；BioLegend；1：300)，或FITC标记的驴抗兔IgG(猫#406403；生物传说；1：300)。流式细胞术用FACSVerse流式细胞仪(BD生物科学)进行分析。最后的分析和图形输出是使用Flowjo软件(TreeStar，Inc.)进行的。所有样本均根据前向散射(FSC)和侧散射(SSC)进行门控，以排除细胞碎片或死亡细胞。

共焦显微镜

将SIN-A 549细胞接种于24孔成簇板上，感染PR8病毒或EMCV。在指定时间点，用含4%甲醛和1%TritonX-100的PBS固定和渗透。然后用pbs洗涤细胞，用抗流感病毒NS1(猫#gTX125990；GeneTex；1：1000)、抗dsDNA(AC-30-10，猫#CBL 186；Chem图标International，Inc.；1：500)或抗-Tom20(FL-145，Cat#sc-11415；Santa Cruz；1：200)抗体孵育细胞，然后用Alexa Fluor 488-共轭驴抗鼠IgG(H+L)孵育(Cat#A21202；Life Technologies；1：5000)；1：5000)，或Alexa Fluor 568-结合山羊抗兔IgG(H+L)抗体(猫#A 11036；生命技术；1：5000)。共聚焦显微镜下观察染色细胞(LSM 5；Zeiss)。

免疫共沉淀(co-ip)和westernblot分析

对于mtdna-蛋白复合物的共ip，在胶原包覆的10 cm培养皿中的HEK293ft细胞的亚汇合单分子层中，转染了12μg的pca 7-egfp，pca 7-fgd-M2，pca 7-牌号ns1，或pca 7-牌号ns1。38/41A58..转染后24h，用ΔNS1流感病毒感染细胞24 h，用蛋白G-Sepharose(GE Healthcare AB)在4°C下孵育60 min，分别用M2、Cat#F 1804、Sigma或正常小鼠IgG 1(Cat#sc-3877、圣克鲁斯)抗体在4°C下离心，用共沉淀缓冲液(50 mM Tris[pH7.5]、150 mM NaCl、1%TritonX-100、1mmEDTA)冲洗5次。用QIAQuick核苷酸去除试剂盒(QIAGEN)从这些蛋白复合物中分离mtDNA。用mtDNA引物进行定量PCR(补充表)4).

对于ISD蛋白复合物的共ip，将cGAS-293 FT细胞在胶原包被的10 cm培养皿中的亚汇合单层转染12μg生物素标记的isd。转染后9h，细胞被WT-A/PR8流感病毒感染。感染后15h，用PBS冲洗细胞，再用1ml注射器和21英寸针反复灌注30次，将细胞溶于1ml PBS中。匀浆在800×离心条件下离心。g上清液在4°C下孵育10 min，用链霉亲和素琼脂糖(热科学)在4℃下孵育60 min。用离心法得到配合物，用PBS洗涤5次。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(10-15%凝胶)对沉淀配合物中的多肽进行分离，并在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(固定化-P；微孔)上进行电泳。The membranes were incubated with mouse anti-influenza A virus NS1(NS1–23–1，Cat#sc-130568；Santa Cruz；1:1000)，rabbit anti-cGAS(D1D3G，Cat#15102；Cell Signaling Technology；1:1000)，rabbit anti-DDX41(D3F1Z，Cat#15076；Cell Signaling Technology；1:1000)，rabbit anti-TFAM(D5C8，Cat#8076；Cell Signaling Technology；1:1000)，or rabbit anti-Flag(Cat#F7425；Sigma；1:10，000)antibody，followed by incubation with horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG(Cat#115-035-003；杰克逊免疫研究实验室；1：10，000；或抗兔IgG(猫#G 21234；生命技术；1：10，000)。然后用Chemi-Lumi One Super(Nacalai Tesque)处理PVDF膜，用LAS-4000微型仪器(GE Healthcare)检测和显示化学发光信号。源数据文件中提供了所有全长的西部印迹。

统计分析

统计学意义采用非参数单因素方差分析(ANOVA)和PRISM软件(8版；GraphPad软件)进行检验。P-<0.05的数值被认为是有统计学意义的。