在2009-2017年期间，从喀拉拉邦各医院因急性呼吸道疾病住院的患者共收集了5 555根口咽拭子(补充图1)。沙一)。基于实时PCR的分析导致1，520例甲型H1N1流感病毒呈阳性.在H1N1阳性病例中，男性743例(48.88%)，女性777例(51.12%)(附图)。S2)。年龄分析表明，18~35岁年龄组的阳性率最高(43.22%)，<1岁组的阳性率最低(0.92%)。甲型流感病毒感染患者的中位年龄为28岁(范围小于1岁-55岁)(附图)。S3)。每月数据分析表明，甲型H1N1流感主要在2009-2017年期间从5月至8月之间传播(补充图1)。S4)。在本研究中，我们旨在分析自2009年8月至2017年4月甲型H1N1流感亚型HA和NA基因的分子进化和遗传特征。
H1N1病毒的进化特征
本研究分析的H1N1株HA和NA基因的平均进化率为5.16×10。−3和4.27×10−3替换/场地/年份。在我们的研究中发现的h1n1株的进化率与以前的报告是相当的。27表明H1N1株的进化速度是相对一致的。Tajima对全长序列比对的D统计结果表明，在印度甲型H1N1流感(H1N1)的演化过程中，有一个强大的净化选择。D−1.685580的值哈和−2.110059纳).
为了更好地了解2009-2017年期间印度甲型H1N1流感病毒的进化趋势，从我们的研究中分离出的甲型H1N1流感病毒的HA序列(补充表)沙一)与本地分离的印度和全球菌株(补充表)一起分析。S2)。用贝叶斯马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)方法重建HA基因系统发生树，指数松弛时钟模型估计发散时间。28,29,30..贝叶斯方法产生的最大Clade可信度树揭示了H1N1进化的时间模式，这与它的隔离期是一致的(图)。1)。此外，发现印度菌株的HA具有类似的变异，因此，在系统发育过程中，印度分离株与全球分离株具有相似的聚类(图一)。1；补充图。S5)，世界卫生组织自2009年至2017年的年度报告中也报告了类似的情况31..2009-2010年期间在印度流行的H1N1病毒(补充表)S3)聚集在第1、3、4和7类中(附图1、3、4和7)。S6)。2011年之后，大多数H1N1病毒属于预先建立的第6组，其次分类为6A、6B、6C和6B.1。据观察，2017年所有H1N1株都属于6B.1亚类，在基因上与2017年至2018年疫苗株A/密歇根/45/2015相似(补充图1)。S6)。类似于HA，NA序列的系统发育分析是使用MEGAX中实现的最大似然方法进行的。32软件包(补充表)S4；补充图。S7)。我们还观察到，系统发育的主要类群是以时间方式构建的，印度菌株与同年在世界范围内流传的H1N1株聚集在一起。
图12009年至2017年，来自印度和全球的甲型H1N1流感病毒的系统发育树被报告，其分支因分离年份而变红。用贝叶斯马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)方法重建82株印度株和90株全球株HA基因的系统发育树41,42以及利用指数松弛时钟模型估计发散时间。使用tracerv.1.7.1可视化了跟踪文件43.
HA结构域的明显遗传和结构变异
2009-2017年期间分离的甲型H1N1流感病毒HA氨基酸序列与参考株(A/California/04/2009)和疫苗株(A/California/07/2009)相比，有几个氨基酸替换。在HA蛋白中共发现18个替换位点，其中5个突变位于抗原位点，1个突变位于受体结合位点(见表)。1)。2009年以来在印度流行的H1N1株的特征是P100S/S220T/I338V突变，即可能的受益突变。2010年期间，H1N1病毒没有遇到其他变异体，而是以前报告的变异频率随频率变化而传播。2011年，在病毒种群中引入了替换E391K，并在随后的几个季节中得到了固定。据观察，尽管在2012年期间有轻微的H1N1流感活动，但新的病毒进化出了更多的替换物-S202T和S468N。以前的研究表明，s202t取代会增加受体结合亲和力。33..2013年，在大多数病毒中观察到了另外三个取代D114N/K300E/E516K的病毒，并成为随后流感季节的特征。在2014年分离的病毒被发现存在两个新的突变K180Q和A273T。重要的是，K180Q突变株区分了2013年以前传播的菌株和2013年以后传播的菌株(表)1)。2015年，印度甲型H1N1流感活动出现了不可预测的增长，除前几个季节确定的固定突变外，还观察到两种替换：A13T和S101N。人们还注意到，2009年大流行期间90%以上的病毒中存在的突变T214A在2010年至2014年期间消失，但在2015年再次出现。1)。据报道，HA基因中存在T214A替换，从而降低了结合亲和力。33..2016年，大多数H1N1病毒的特征是R62K和V537A两种变异体，它们在2017年逐渐消失。在2017年传播的病毒中，发现了另外四个替换物I233T、S179N、S181T和I312V，其中S181T和I312V在印度分离株中与全球循环株相比是独特的突变(见表)。1).
表1与参考株A/California/04/2009和疫苗株A/California/07/2009相比，2009-2017年期间甲型流感(H1N1)株HA蛋白的突变情况。 一种基于同源性的模拟HA变异结构与2009年加州参考株相比显示，甲型H1N1流感病毒株的已知突变不太可能改变HA的整体三维三级结构(rmsd=0.986)(图1)。2A；补充图。S8)。P100S、S101N、D114N、S179N、K180Q、S181T、S202T、T214A、S220T和I233T在H1N1病毒头区的替换较多。S8)包括4个抗原结合位点(S179N、K180Q和S181T-sa；S202T-SB；S220T-Ca)和一个受体结合位点(I233T)的变化。在突变体K180Q中，Lys的侧链通过其与F 134和W 140芳香环的CH2结构参与C-H-Π相互作用。Lys的氨基还参与了N-H-Π/阳离子-Π与芳香环的相互作用.而在突变的谷氨酰胺侧链中，其酰胺基与F 134侧链的芳香环相互作用，导致Π-Π相互作用，对二级结构没有影响。为了确定所记录的突变对其功能的影响，接下来我们使用分子动力学模拟方法对这些突变进行了结构分析。我们假设，这些突变在结合位点及其周围的功能效应可能会破坏或改变其向进入的糖基配体的方向，或触发配体结合的构象变化，这对其毒力可能很重要。
图2HA蛋白的三维结构和分子动力学模拟分析。(A)2009年大流行H1N1 HA，PDB：3 UBE和变异HA的重叠结构，结合位点残基和抗原位点残基分别以红色和蓝色突出显示。突变残基在2009年大流行H1N1 HA结构中被强调为绿色和紫色。(B)HA结构域上单取代I233T的构象位移。(C)在HA域中312位异亮氨酸与异亮氨酸的构象偏差破坏了Ile 312-Ile302的一个重要相互作用，导致Ile 302参与的小β片的解离，从而破坏了第二片(图中更右)的不稳定，最终在C-末端区域(图中的最右边)诱发了大量的非局域性。(D,E2017年分离物(A/Kerala/RGCBH 5/2017)的结构与类似的HA 2009结构在介电介质中相对于高介电情况下的根-均方偏差(A/Kerala/RGCBH 5/2017)。灰色是中等介电，黄色是高介电.(D)2017年分离株HA结构域(A/Kerala/RGCBH 5/2017)。(E)类似A/California/2009的HA域。
I233T突变对糖链特异性的影响
HA结构域中的单取代I233T可能会破坏I 233与V 237之间的亲脂接触，从而降低其pH稳定性。2B)。这种分子内的变化预计将改变由氨基酸230-242形成的环的构象，该氨基酸是糖胶结合位点的一个组成部分。主干构象的前景预计会引起活性部位的轻微加宽，这通常会降低受体的特异性。然而，这种构象变化也会干扰E 240和一对H供体(T 150和A 151骨架酰胺)之间的静电稳定作用。如图所示。2B这些相互协调的内分子改变-我们在所有2017年印度H1N1分离株中都注意到-将把E 240转移到通常用于糖胶结合的空间。此外，E 240谷氨酸侧链的柔韧性也能容纳糖链，因此，具有这种性质的高度极性侧链很可能影响结合动力学。
HA结构域的S181T和I312V突变导致级联结构功能的影响。
S181T和I312V突变是从印度分离的H1N1株特有的。对抗原区的结构分析显示，在所有被分析的2017年印度分离株中发现的S181T突变，将破坏侧链β片H键的稳定和内翻，可能导致双链片脱钩或移位。虽然注意到的双链片并不靠近任何糖基化位点，但如我们的动态模拟所观察到的那样，片状断裂很可能会通过蛋白质的其余部分产生级联的结构影响。在2017年分离物中观察到的突变I312V可能会破坏N 293糖基化位点附近的一个小疏水结(I 312、I 303和P 321)的稳定性，这可能对糖基化倾向产生影响。异亮氨酸到缬草碱的突变会导致亲脂性的轻微下降，但对于一个象观察到的那样小的结，预计足以改变结构。野生型和I312V HA之间的构象偏差，这是从加速分子动力学模拟得到的。2C表明异亮氨酸对缬草碱的突变既不能消除小的疏水结，也不会改变Gln 293糖基化位点的出现。然而，令人惊讶的是，异亮氨酸对缬草碱的取代破坏了一个重要的Ile312-Ile302相互作用，导致了Ile 302是其中一部分的小β片的分解，从而破坏了第二张纸的稳定性(图)。2C，进一步的权利在图中)，导致一个诱导实质的非局部在C-终端领域(图1)。2C，在图中是最右边的)。我们认为，I312V突变将对三聚体的生存能力产生重大影响，或者(可能更有可能)对三聚体的最终构象产生影响。
HA蛋白中pH依赖性的结构通量
对中介电介质中HA结构域与2017年印度H1N1分离株高介电情景下HA结构域的分子动力学模拟表明，2017年分离株HA结构域的潜在pH效应(pH值在2.950~6.109之间)明显高于2009年菌株(pH2.798)。较低的均方根值反映了由于2017年H1N1病毒在这里的少数分离物，为了更好的pH稳定性和有效的变性而作出的预测。然而，同样有可能的是，在pH-压力下，这些分离物的结构可能会适应一种新的结构，这种结构可能在某种程度上有利于病毒的存活或传染前景。这些观察还表明，适应不同的宿主需要一个最佳的pH膜融合。具有较高pH融合的HA突变体可能比其他突变体具有更高的复制效率。在这一背景下，对2017年分离物相对于2009年高RMSD结构的结构变化进行更深入的分析令人惊讶地发现，pH依赖的结构通量对2017年分离株有利(图1)。2D，E)。这些假设的未来验证预计将进一步揭示pH稳定的意义，将其作为2017年分离株HA结构域所观察到的突变的主要动机之一。
接下来，我们对阴离子-阴离子相互作用作为不同菌株的相对pH稳定性的中介物进行了相似的接近性分析。相比之下，我们对His-Cat稳定机制的分析强烈地表明，尽管阴离子稳定有很大的随机趋势，但2017年菌株已调整其HA结构域，以获得更有效的利用(或耐受性)pH-胁迫。我们的分析还表明，其中一个或两个残基(Glu275和Glu422)很可能参与大多数2017年分离株的阴离子-阴离子相互作用，但不参与2009年分离株的负离子相互作用，这可能是由于2017年分离株的位置敏感。请注意，275和422位置由于构象转移而参与阴离子-阴离子相互作用，这是2017年分离物中的大多数，因此，这些观察突出了已知HA突变对其功能的“间接”后果。相比之下，2009年分离物拥有一个阴离子对(Asp390-Glu391)，在2017年的分离物中消失，这是所有2017年HA形式的E391K突变的直接结果。
NA结构域的明显遗传和结构变异
对2009~2017年在印度流行的H1N1病毒的NA蛋白序列进行了分析，并与A/California/07/2009号疫苗株的NA进行了比较。在大流行初期，我们还注意到NA结构域上的几个定义突变(V106I&N248D)变得固定-类似于HA结构域。大流行期间观察到的大多数氨基酸替换没有持续到大流行后期，几个新的突变，如V241I和N369K，在大流行后期NA蛋白中占主导地位(补充表)。S5)。序列分析表明，NA结构域的17个突变发生在2009年H1N1谱系的不同时间点(补充表)。S5)。有趣的是，甲型H1N1流感病毒H275Y和N295S突变已被证明与多重耐药有关。34然而，在本研究中分析的H1N1株中没有观察到这些突变。同样，我们也没有注意到先前在i 223，h 275，q 313和i 427位置上发现的NA突变，它们与神经氨酸酶抑制剂结合在一起。35,36,37,38.
根据侧链的大小、形状和性质，NA结构域突变可分为1组：I34V、L40I、V241I、V264I和I321V；第2组：N44S、N200S、N270K、N369K、N386K和K432E。第1组NA突变涉及疏水氨基酸，含有异亮氨酸，既存在于环中，也存在于β链中，预计对二级结构元素没有影响。第2组NA突变N44S、N200S位于极性分子和中性分子之间，但侧链大小不同，N~K或K~E替换出现在环表面。从分子水平上看，残基20-27可以在突变蛋白中获得完整的螺旋结构。在突变的结构中，该片段中的大部分残基具有对应于ϒ-回转的扭转角。这种完全转化为螺旋形式的起源是由于突变的I34V，由于空间弛豫和非极性侧链之间疏水相互作用的开始。同源性模拟的变异NA结构与参考文献的比较表明，突变并不影响蛋白质的整体三维结构(rmsd=0.486)(图1)。3A).
图3NA蛋白的三维结构和分子动力学模拟分析。(A)2009年大流行H1N1 NA、PDB：3 TI6和变异NA的叠加结构。突变残基以绿色突出显示。(B突变K432E对神经氨酸酶活性位点的影响表明，K432E突变在活性/催化位点附近引起了一个大的环移位，在E 432(变异)和R 368残基之间形成了一个新的盐桥，从而缩小了空穴。(C与E 277和R 292发生代偿性底物相互作用。E 432/R 371盐桥的形成剥夺了抑制剂的静电药效团特征(R 371阳离子侧链与配体羧酸盐结合)。
进一步的分子动力学分析表明，NA结构域的K432E突变在神经氨酸酶活性位点附近形成了一个新的盐桥。我们发现，K432E突变在活性/催化中心附近引起了一个大的环移位，由于E 432(变异)和R 371之间形成了一个新的盐桥而使空腔变窄。3B)，除一个RGCB 2017分离物外，所有2017年分离物均未检出。虽然抑制剂的核二氢-4H-吡喃-2-羧酸比底物的核心2-羟基氧烷-2-羧酸小，但其体积大小与最小的可想象底物大致相同，因此，与胺/胍有关的药效基团可能在这些构象变化中发挥重要作用。关于K432E对调节Zanamavir或oseltamavir作用的功能影响，这些观察表明，E 432/R 371盐桥的形成将使抑制剂失去一个关键的静电药效团特征(R 371阳离子侧链与配体羧酸盐结合)。名义上，盐桥预计也将剥夺底物的这种相互作用。然而，更大的基片环饱和(椅子，而不是应变椅子)和一个额外的羟基的存在将导致与E 277和R 292的补偿底物相互作用(如图所示)。3C)，防止这些残留物用于抑制剂。预计这种突变可能会对神经氨酸酶抑制剂的结合动力学产生不成比例的影响，从而损害目前使用的治疗性抑制剂的有效性。
总之，我们的研究揭示了甲型H1N1流感病毒在印度流行后与全球流行期间的进化关系。此外，突变、结构和功能分析表明，HA和NA结构域的区域获得性突变可能与必需的局部维持适应能力有关，从而达到有效的人类传播能力。在印度，过去两年来，在人类人口中检测到的甲型流感病毒感染数量空前增加，这可能反映了更好的检测技术，或者需要不断进行监测，以监测甲型流感病毒的任何变化，这些变化可能增加其在人口中传播和毒力的可能性。本文的研究结果为开发下一代不同空间的治疗抑制剂提供了一个更好的洞察力，以计算循环分离物中观察到的突变。此外，本文介绍的结果为开展一项更广泛的研究提供了理由，该研究涉及设计下一代有效分子的方法-此外，还提供了通用工具，对受影响人群进行可预见性筛选。
