CD11c +细胞上CD40的耗尽会加剧NASH期间的代谢综合征并改善肝脏炎症

在哺乳动物细胞中，质膜的内外小叶具有不同的磷脂。磷脂酰丝氨酸(PS)通常局限于内部(细胞质)膜小叶。在此，我们报告了人类致病菌的粘附素CPn 0473。肺炎衣原体它与人体细胞的PM结合，诱导PS外化，但却没有诱导细胞凋亡。PS外化在接触传染性的人细胞中增加。CPNCPn 0473细胞表达增加，暴露于CPn 0473细胞减少CPN表达下调CPn 0473。CPn 0473与含有PS的合成膜特异结合，促进孔隙形成。不对称巨单层囊泡(GuVS)中PS仅限于内小叶，说明CPn 0473在没有其他蛋白质的情况下诱导PS外化。因此，我们鉴定CPn 0473是一种细菌PS转运子，能够在感染期间进行特异性和凋亡无关的PS外化，从而扩展了细胞内病原体进入宿主细胞的机制。

哺乳动物质膜(PM)表现出明显的磷脂(PL)不对称性，这种不对称性是由ATP驱动的特定脂质转运体(flppases，floppase)建立和维持的。1,2..磷脂酰丝氨酸(Ps)从PM的内到外小叶的跨膜运动称为外化，这一过程是由杂乱酶执行的，它发生在凋亡细胞(通过吞噬细胞触发细胞清除)和血小板活化过程中。3,4..然而，诱导或调节PS外化的精确分子机制尚不清楚。

肺炎衣原体是一种重要的细胞内革兰氏阴性菌病原体，可感染上呼吸道和下呼吸道，并与包括动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病在内的多种慢性疾病有牵连。5..传染性衣原体(EB)通过受体介导的内吞进入宿主细胞，并在膜结合的包涵体中复制。6,7,8,9..我们以前确认CPn 0473为CPN-特异性粘附素参与EB内化，表明重组CPn 0473(RCpn 0473)剂量依赖性地促进EB进入宿主细胞，从而促进感染。10.

在这份手稿中，我们证明衣原体粘附素cpn 0473与带负电的pls结合，其C末端插入到宿主细胞PM中。CPn 0473作为PL转运体，将宿主细胞PS从PM的胞内小叶转移到胞外小叶。CPn 0473介导的PS外化不诱导细胞凋亡。CPn 0473与合成的不对称膜结合，导致PS从内(PS-高)向外(PS-低)小叶方向移位。PS通过CPn 0473易位可促进宿主细胞对传染性衣原体EB的摄取。

CPn 0473与带负电荷的pls有关

为了进一步研究蛋白质的功能，我们筛选了相互作用的伙伴，并发现重组rCPn 0473与脂质体有很强的结合作用。1A)。用含有不同脂类的硝化棉条进行的测试表明，rCPn 0473与各种带负电的pls结合(补充图1)。1A)。用已确定的脂质混合物制成的巨大单侧囊泡(Guvs)证实了rCPn 0473对带负电荷的pls的特异性，并证实rCPn 0473不结合由磷脂酰胆碱(DOPC)组成的磷脂酰胆碱(DOPC)。显著的是，rCPn 0473对PS(DOPS)的亲和力明显高于对磷脂酸(DOPA，PA)的亲和力，而对磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PI(4，5)P2)的亲和力未被识别(图4，5)。1B，c)。将脂质混合物中PS的含量从5%提高到20 mol%，增强了rCPn 0473的结合。1D)，可与完全绑定PS的阳性对照rLactC 2相媲美。11(补充图。1A-c、图1.1E)。作为入侵CPNEBS通过富含胆固醇的膜结构域发生。10,12我们还测试了添加胆固醇的GUV膜，这确实增加了与GVS的结合。有趣的是，rCPn 0473变异体缺乏与人类细胞结合所需的结构域(BD，AA 307-356)。10依附于GVS，而去除残留物1-171(对促进EB内化至关重要)10)废除了相互作用。相反，CPn 0473的第176个AA与OmcB的融合使后者能够坚持含有PS的GVS(图1)。1E，f，补充图。1C).

重组CPn 0473优先与磷脂酰丝氨酸(PS)相互作用。a全长rCPn 0473与脂质体结合(L-α-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、碳水化合物和其他脂质)。用Westernblots分析颗粒(P)和上清液(S)组分。n=3)。b, crCPno 473 FL与巨单层囊泡的结合效率。由磷脂酰胆碱(DOPC)和指示的脂类组成的GUVS与Dylight 488标记的蛋白质(DOPS：磷脂酰丝氨酸、DOPA：磷脂酸、PI(4，5)P2：磷脂酰肌醇4，5-二磷酸)共同孵育。(每个实验检测了≥75微粒子，n=3)。平均±标准差(S.D.)标尺：10米。dPS浓度对rCPn 0473结合的影响平均±S.D.(n=2)。eRLactC 2(≥60 GVS)的结合n3)，rCPn 0473缺失变异体(≥50μmol/L)，n=2)和OmcB衍生物到GVS。fl：全长，BD：宿主细胞结合域，AA：氨基酸.平均±S.D.f中使用的CPn 0473变体e..所有小组：*P < 0.001, **P < 0.01 and *P < 0.05, n.s. not significant (P>0.05)(学生的两份样本t测试)。源数据作为源数据文件提供

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有效的衣原体感染依赖于对PS的识别

评估PS与感染的相关性CPN，我们感染了ps缺陷突变株Cho-psa 3。13..我们观察到CPN相对于野生型CHO-K1细胞的感染，表明PS对感染是重要的(图1)。2A)。接下来，我们测试了rcpn 0473介导的EB内化过程中的促进作用是否依赖于宿主细胞ps。10..rCPn 0473预处理后CHO-K1细胞的内化EBS确实比牛白蛋白(BSA)处理的细胞增加，但在rCPn 0473预处理的PS缺陷细胞系中未见效果(图一)。2B)。重要的是，rCPn 0473在K1和PSA 3细胞之间的结合没有显着性差异(补充图)。1D)。总的来说，这些数据表明CPn 0473与PS结合，PS对rCPn 0473介导的EB内化和传染性的增强是必不可少的。

肺炎克雷伯菌特异性诱导磷脂酰丝氨酸(PS)外化。a传染性肺炎克雷伯菌野生型(WT)和PS缺乏(PSA 3)CHO细胞中的EBS(MOI=10)n=3)。平均±S.D.WT CHO细胞的感染性为100%。平均±S.D.b内化的qRT PCR分析CPN..用rCPn 0473(100 g/ml)预处理CHO WT和PSA 3细胞(2 HPI)EBS一式三份，感染前1h(MOI=10)。n=3)。平均±S.D.cPS的外化肺炎克雷伯菌EBS早期感染。用衣原体EBS感染Hep-2细胞(MOI=10)。固定前用Annexin-V-Fluos染色，再用DAPI和抗EGFR抗体染色。标尺：2.5米。d指示的衣原体种类对PS的外化作用。用衣原体EBS感染Hep-2细胞1h(MOI=10)。外部ps被染色，如c..平均(三倍)±S.D。(n=3)。所有小组：*P < 0.001, **P < 0.01 and *P < 0.05, n.s. not significant (P>0.05)(学生的两份样本t 测试)。源数据作为源数据文件提供

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有趣的是，在稳态条件下，PS仅限于PM的内部小叶。14，在感染时被外化。CPN15..实际上，当我们决定CPN-PS外化感染细胞与荧光Annexin-V16，早在感染后5分钟(Pi)就可观察到粘附ebs周围的信号，而热灭活则是一种信号。CPNEBS不诱导荧光。2C)。在60 min时，83±9%CPNEBS为Annexin-V-阳性(±=标准差(SD)。二维空间)。有趣的是，CPN带附件蛋白-V信号的EBS具有物种特异性，仅为15±3%。C.沙眼血清E和血清LGV仅有9±1%的EBS表现出Annexin-V荧光。二维空间)。为了证实这一结果，我们通过CPN使用rLactC 2，并在EB入口站点再次检测到外部化的ps。有趣的是，两者CPN和rLactC 2信号聚集在霍乱毒素(CtxB)阳性的、富含胆固醇的膜结构域。17(补充图。2A).

CPN 0473诱导PS外化

因为CPn 0473是特定于CPN，而且只有CPNEBS显示了大量的PS外化，我们检测了rCPn 0473本身是否能通过与rCPn 0473共同孵育Hep-2细胞诱导PS易位。事实上，我们通过Annexin-V和rLactC 2-荧光强度(FITC)观察到PS在rCPn 0473结合位点的时间和剂量依赖性，而不结合PS的三重AAA突变体rLactC2-FITC不能染色rCPn 0473结合的细胞(图1)。3A-c，补充图。2B)。重要的是，当使用FITC标记的PI(4，5)P2-PLCγ的结合域和HGS的PI(3)P结合FYVE结构域(附图)。1A，e，f)，我们没有检测到磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PI(4，5)P2)和磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)，这是另外两个负电荷的pls，通常仅限于PM的内小叶，在Hep-2细胞中加入rCPn 0473后被限制在宿主细胞表面(补充图1)。2C)，证明rCPn 0473对PS的特异性。Annexin荧光程度与rCPn 0473用量相关，并随时间的延长而增加，孵育15 min后第一次可被检测到(如图所示)。3B，c，补充图。3A)。由于钙的进入可能触发细胞PS暴露，我们在Hep-2细胞的培养基中测试了不同的钙浓度。值得注意的是，rCpn 0473诱导的PS外化水平并不因细胞外钙水平的升高而增强。3B).

重组CPn 0473诱导磷脂酰丝氨酸(PS)外化。体外PS染色采用Annexin预先固定和抗体染色。a–f. a–c荧光分析显示rCPn 0473具有时间和浓度依赖性的PS外化。有代表性的图像显示在a，标尺：10米。b重组CPn 0473(100 g/ml)在不同钙水平DMEM培养基(1.8m)中外化PS对Hep-2细胞的荧光分析M)，平方(2.8米)M)、三角形(4.8米)M)。平均±S.D.(n=3)。crCPn 0473对PS外化的浓度依赖性平均±S.D.(n=3)。d胆固醇耗竭5米MMβCD降低rCPn 0473诱导PS外化的效率。标尺：10米。e凋亡标记蛋白caspase-3和PARP的Westernblot分析。2.5倍培养诱导细胞凋亡MStauroporine(Stspr)箭头标记不活跃的Proaspase-3(P36)、全长PARP(P 113)和裂解的PARP(P89)。n=3)。f涂敷肺炎克雷伯菌1级EBSMrCPn 0473在1 HPI(MOI=10)时可提高PS外化水平。采用Westernblotting法测定CPN 0473水平。给出了一个典型实验的平均值。n=3)。g用特异性抗体预孵育rCpn 0473可减少PS外化.肺炎克雷伯菌在MOI=20的条件下，用CPn 0473特异性抗体(稀释1：100)预孵育EBS。每个实验至少分析70 DAPI和CPn 0473阳性的EBS。平均±S.D.(n=2)。所有小组：*P < 0.001, **P < 0.01, and *P < 0.05, n.s. not significant (P>0.05)(学生的两份样本t测试)。源数据作为源数据文件提供

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CPn 0473介导的PS外化是非凋亡的

CPn 0473诱导的PS外化过程的进一步表征表明，它对甲基-β-环糊精(MβCD)的胆固醇消耗敏感，不依赖完整的皮质微管和肌动蛋白网络作为诺康唑或细胞松弛素D处理的证据(图)。三维空间，补充图。3B-d)。PS外化是细胞凋亡的标志，它是由caspase-3蛋白水解激活和PARP失活引起的。重要的是，在rcpn 0473或CPN-受感染的细胞，与斯多菌素处理的凋亡细胞形成对比(图一)。3E)。重要的是，Hep-2细胞接触衣原体粘附素rPp 21或rOmcB并不能诱导PS外化(补充图1)。4A).

其次，在Hep-2细胞感染前，调节感染性EBS表面CPn 0473的含量。用rCPn 0473包覆EBS可产生与EB相关的PS信号，其强度是未处理的EBS的3倍以上，并与EBS相关的CPn 0473总量有很好的相关性(图1)。3F，补充图。4B)。相应地，用抗CPn 0473抗体预处理可在EB表面阻断内源性CPn 0473，相对于未处理的EBS，其PS外化降低(如图所示)。第三代，补充图。4B)。暴露于抗Pmp21抗体对PS外化影响不大。

为了确定CPN 0473负责PS外化的区域，我们首先测试了缺少BD结构域的变异(补充图)。1D)10..rcpn 0473Δbd不能结合hep-2细胞10并且，正如预期的那样，未能诱导PS外化。同样，缺失第一个171 aa的缺失变异体也无法将PS具体化，因为它不能与PS结合。然而，缺少AA 150-255的变异体仍然能够将PS外部化，这表明N端AA 1-149对于PS外化是必不可少的(补充图1)。4C).

CPn 0473通过C端插入宿主膜

到目前为止所提供的数据与CPn 0473本身是PS变送器的假设是一致的。为了阐明rCPn 0473在与宿主细胞PM结合过程中的膜定位，以His标记的rCPn 0473为位点，经半胱氨酸(Cys)单独加于N-或C末端，与Hep-2细胞共同孵育，Hep-2细胞经β-巯基乙醇处理。如果生物素化的末端Cys可以被β-巯基乙醇还原，生物素部分就会丢失。事实上，经N-末端生物素化CPN 0473处理后，只有6±5%的蛋白质保持生物素化，而39%(±1%)的C末端修饰形式在还原剂作用下存活下来，表明C末端可能被插入宿主PM中(如图所示)。4A)。事实上，ProtScale Hphob在C端(TM，AA 396-425)附近预测了一个跨膜区域。18(无花果)4B)。为了确定rCPn 0473结合是否改变了膜的完整性，我们在Alexa 594标记的rCPn 0473或TM缺失变异体(ΔTM)存在下，监测了羧基荧光素(CF)负载的DOPS-guvs的稳定性。与rCPn 0473 FL孵育后，在5 min内，管腔内的CF信号下降，随后是腔内Alexa 594信号的增加。虽然在~2.5 min内出现50%的CF(mW：376.32 Da)丢失，但达到最大吸收量Alexa594-rCPn0473(mW：55 kDa)的50%需要8.5min。相反，ΔTM变异体与含PS的GUVS的结合并不改变腔内CF荧光，也不会导致腔内Alexa 594荧光增强(图1)。4C-E)。因此，rCPn 0473与DOPS-guvs的结合使膜能渗透到小分子和大分子，而不影响整体的guv稳定性。

rCPn 0473作为衣原体磷脂酰丝氨酸转运酶。arCPn 0473在宿主细胞膜上的定位。Cpn 0473的N端或C端单半胱氨酸变异体在与Hep-2细胞孵育前均被生物素化.用β-巯基乙醇处理连接在Cys末端残基上的可接近(即细胞外)生物素，用链霉亲和素在Westernblots上分析与该蛋白连接的量。在westernblot下面给出了平均残留生物素(n=3)。b缺乏ProtScale Hphob预测的跨膜结构域(ΔTM)的CPn 0473缺失变异的原理图。BD：宿主-细胞结合域。c–erCpn 0473的结合影响含PS GVS的完整性。用羧荧光素(CF，1：100稀释)预负载DOPS-GUVS，并与Alexa 594-偶联rCPn 0473、rCPn 0473ΔTM或未处理(漂白)孵育。CF荧光强度c和Alexa 594d在guv腔中进行了分析(至少15 guv)(n=2)。在实验过程中，水平虚线显示了信号强度(0%、50%和100%)的差异。虚线表示达到信号强度50%偏移时的时间点。有代表性的图像显示在e..鳞片：10Δm，全长度rCPn 0473与rCPn 0473 TM有显着性差异.f, g不对称的guv是在以下基础上制备的。19..在rcpn 0473存在或不存在的情况下，fITC标记的重组rLactC 2作为ps的标记，与以ps为主的gvs孵育。走出-GUV)或内部(PS)客栈-指南)传单。有代表性的观点载于f..比例尺：用ImageJ软件对10mrLactC2绑定进行量化。背景强度设置为1(分析最多24 GVS)(n=3)。g..数据表示为方框和晶须图。中线代表平均分数，上四分位数和下四分位数包含平均50%的数据，而晶须则显示所有数据的最小值和最大值。差异的显着性取决于不同时间点(0 min或30 min)。所有小组：*P < 0.001, **P < 0.01, and *P < 0.05 (Student’s two-sample t测试)。源数据作为源数据文件提供

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CPn 0473是一种衣原体ps变送器。

为了直接检测rcpn 0473的ps转运活性，我们制备了以一种膜单张为主要载体的gvs。19,20..用FITC-rLactC 2验证PS不对称。外页混合携带PS的GUV(PS)走出-GUV)与rLactC 2在0 min时立即产生较强的FITC荧光，随着时间的推移，荧光强度逐渐下降。携带PS的GVS主要定位于内小叶(PS)客栈-GUV)在相同条件下几乎不显示FITC-rLactC 2荧光。4F，g)。然而，当PS客栈-GUVS预负载FITC-rLactC 2，即rLactC 2染色的内小叶PS，产生明显的荧光，证实PS不对称(图1)。4F，补充图。4D，e).

关键是，同时暴露PS客栈-GVS对体外rCPn 0473和FITC-rLactC 2立即产生FITC-rLactC 2荧光，并在随后30 min内增加(图1)。4F，g)。另一方面，当PS走出-用FITC-rLactC 2预处理的GUV暴露于外部rCPn 0473，未观察到FITC-rLact2在内小叶处的荧光(补充图)。4D，e)。这些结果反对rCPn 0473的干扰机制，从而支持合成膜系统内(PS-高)到外部(PS-低)小叶的定向rCPn 0473介导的PS易位。

我们的数据显示CPN粘附素CPn 0473作为一种脂类转运体，在附着病原体周围的宿主细胞PM上介导PS外化。因此，我们将这种蛋白质称为Lipp(用于“脂依赖性内化促进蛋白”)。Lipp是在粘着的表面上发现的。CPNEBS10..我们的模型暗示Lipp通过其BD结构域与PM通过一个尚不清楚的细胞表面结构与富含胆固醇的微区相互作用。Lipp-PM相互作用很可能导致蛋白质内部构象的变化和寡聚化.这些变化使Lipp的N端结构域与PM相互作用，并将PS从双层的内部转移到外部小叶，从而促进了EB的内化。与已知的完整膜翻转酶和杂合酶相比，这个场景可以解释为什么Lipp转运复合物的组装和活性作用较慢。值得注意的是，lipp活性既不需要ATP也不需要钙。2+，虽然胞内ATP-或Ca有潜在的有益作用2+-目前不能排除商店的可能。因此，Lipp是第一个已知的脂质转运蛋白，可以从细胞外侧进入PM的内部小叶。

外部面部PS定位如何支持EB内化？CPN是一种专性细胞内病原体，EB内化对感染至关重要。因此CPN可能已经发明了PL转运酶的活性，作为一种机制暴露特定的宿主细胞配体，即PS，然后Lipp粘附素可以与其结合。表面暴露的PS在细胞凋亡清除和血细胞凝血过程中也起着配体的作用.此外，PS外化促进了HIV的吸收。21..然而，在后一种情况下，PS暴露是通过激活的人杂乱酶发生的。外界的ps也被发现在宿主细胞进入宿主细胞过程中被其他细菌病原体所起作用，但其潜在的机制尚不清楚。21,22,23.

PS的移位也会调节PM的结构。在稳态条件下，负离子PS仅限于PM的内小叶及其头部受到静电排斥，受到胆固醇的限制(同时富集于内小叶)。24,25..粘附EB周围的特异性PS移位增加了外面小叶的负电荷密度，在缺乏足够胆固醇的情况下，由于静电排斥作用，在内陷膜边缘会向外弯曲，从而支持EB内吞。这一过程可能是由宿主支架蛋白促进的，这些蛋白质可以增强膜的弯曲，从而形成囊泡。26..最后，短暂的PS消耗来自附着周围的内部PM传单。CPNEBS将导致特殊的PS结合蛋白重新定位，通常发现与内双层传单有关，否则会影响进入过程。因此，我们的发现不仅有助于我们了解宿主与病原体之间的基本相互作用，而且表明抑制PS暴露和/或病原体-PS相互作用可能为细菌和病毒疾病的治疗开辟一条途径。

化学品和抗体

从Sigma-aldrich、羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯(β-ctxB)及脂类化合物dp、pI(3)P、pi(4，5)P中分离得到m cd、nococozin、细胞解离液1×、AP-偶联链霉亲和素、cf和fITC结合的霍乱毒素B亚基(fitc-ctxB)。2，DOPA，TR-DHPE来自生命技术，庆大霉素来源于Invitrogen，蛋白酶K来自Milli孔隙，SYBR绿色PCR主混合来自应用生物系统。Stauroporine，抗caspase-3抗体(1：100，westernblot，WB)，抗PARP抗体(1：100，WB)和Annexin-V由Christoph Peter(分子医学研究所，Hu，Düsseldorf)提供。并吞也是直接从罗氏获得的。Ez-LinkHPDP-生物素、细胞松弛素D和罗丹明/法洛司汀是从热科学公司获得的，脂质膜条是从螯合物生物科学中得到的。Commercially available antibodies were obtained from the following sources：anti-β-actin(#A1978，1:2000(WB))from Sigma-Aldrich；Alexa488-and Alexa594-conjugated anti-rabbit and anti-mouse antibodies from Life Technologies(all 1:200(Immunofluorescence(IF))；anti-GST(#C2309，1:1000(WB))from Santa Cruz；anti-PentaHis(#34660，1:2500(WB))from Qiagen；AP-conjugated anti-mouse(#S372，1:7500(WB))and anti-rabbit(#S3731，1:7500(WB))from Promega；抗内毒素(30701，1：4(IF)，抗肾小管蛋白(Acris)，抗EGFR(#MA5-13269，1：50)来自Invitrogen.抗Pmp 21(1：50(WB)；1：10(IF)和抗CPn 0473(1：25(WB)；1：5(IF)由Eurogentec在兔体内产生，抗MOMP(1：100(WB)由圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心(G.钟)产生。实验中使用的磷酸盐缓冲盐水(Pbs)缓冲液由137米组成。MNaCl，2.7米MKCL，10米M纳2HPO4，1，8米MKH2阿宝4..汉克的缓冲盐水溶液(热科学，#14175-053)由5.3m组成MKCL，0.4米MKH2阿宝4，4.2米MNaHCO3、137.9米MNaCl，0.3米M纳2HPO4、5.6米M D-葡萄糖。

DNA调控与蛋白质表达

大肠杆菌XL1用蓝(Stratagene)进行质粒扩增，用折纸菌(Novagen)进行蛋白表达。通过体内同源重组构建质粒酿酒酵母表达EBY 100(Invitrogen)的绿色荧光蛋白表达株YKM 2。所有编码序列均通过PCR从衣原体基因组DNA或从人基因组DNA中提取的cDNA中扩增出来，其两端有40个碱基对长的同源区，可克隆到相应的目的载体中。酿酒酵母6(补充表)1)。OMcB(AA 40-100)的结合域肺炎克雷伯菌用一个C末端的His-标记进行表达，并将N-末端与GST融合.GST、Pmp 21、CPn 0473 FL和缺失变异体均以His标记蛋白的形式表达。乳糖粘附素的PS结合域(表达克隆由加拿大多伦多大学S.Grinstein博士提供)16(Addgene质粒#15247)用GST标记C。PI(4，5)P2-磷酸肌醇-磷脂酶Cγ结合区(PLCγ)和肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物(HGS/Hrs)的PI(3)P结合区用GST标记(由Dominik Spona，HHU，Düsseldorf提供)。GST-和His标记蛋白分别用Sigma-Aldrich和Chiagen提供的协议进行纯化，并在Westernblots上进行分析。

上皮细胞培养

在含6%CO的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、维生素、非必需氨基酸、两性霉素B(2.5g/ml)和庆大霉素(50 g/ml)条件下，培养人Hep-2细胞(上皮性喉癌，ATCC编号：CCL-23)。2..CHO细胞(中国仓鼠卵巢，ATCC编号：CCL.)61)在含6%CO的37°C条件下，在含FCS、维生素、非必需氨基酸、两性霉素B(2.5g/ml)和庆大霉素(50μg/ml)的F12K培养基中培养。2..野生型CHO-K1和ps缺陷的CHO细胞系psa 3PSSA编码PS合成酶I活性的基因)由日本福冈九州大学O.Kuge博士提供。13..用含PS脂质体(30 M)的F12K培养基培养CHO-PSA 3。

衣原体的繁殖

用Hep-2细胞株进行衣原体(病人分离株)的传代.细胞在含6%CO的37°C环境中，在含FCS、维生素、非必需氨基酸、两性霉素B(2.5g/ml)和庆大霉素(50μg/ml)的DMEM GlutaMax中培养。2. 肺炎克雷伯菌GID和C.沙眼将血清L2(L2/434/Bu)和E(DK-20)分别在1.2g/ml环己酮存在的Hep-2细胞中培养，用30%的胃泌素(Schering)纯化EBS。采用CHO细胞株进行粘附和感染实验。

免疫荧光显微镜

显微镜用Nikon EclipseTi-E C2共焦显微镜(DS-Chi1MC摄像机)进行。用NIS元件软件(Nikon)组装共焦图像。感染细胞在室温下用96%甲醇固定5 min，或在4°C下用3%对甲醛固定20 min，必要时用2%皂甙渗透，然后用抗体或标记蛋白染色。在此情况下，0.5%的皂甙存在于整个染色过程中。非特异性结合位点被2%BSA阻断，抗体在0.05%吐温-20溶液中溶解。

粘附试验

对10层完全汇合的细胞进行粘附性分析。6在37°C条件下培养Hep-2细胞或CHO细胞，用含可溶性重组蛋白(100μg/ml)的融合细胞在4°C上覆盖15、30或60 min，观察可溶性重组蛋白与Hep-2细胞或CHO细胞的结合情况。经广泛洗涤后，细胞分离，球团化(300×5 min)。g)和重新悬浮在HBSS(100升)。然后用抗His抗体免疫印迹法定量结合重组蛋白。

膜定位试验

为了分析rCPn 0473 FL与宿主细胞PM结合时的定向性，在N-端或C端添加单一半胱氨酸(Cys)修饰C-末端His标记蛋白。这两种变体随后在1米处的cys残基上被生物素化。MEDTA使用0.05g EZ-Link HPDP-生物素每克蛋白在冰上浸泡4h.每种生物素化形式(100μg/ml)与融合的Hep-2细胞在37℃下孵育30 min。细胞在冰上冷却，用100米孵育。Mβ-巯基乙醇(10 Min)去除细胞外生物素。经广泛洗涤后，分离细胞，用细胞解离液，球团化(300×5 min)。g)和重新悬浮在HBSS(100升)。然后用抗His抗体免疫印迹法定量结合重组蛋白。用AP-偶联链霉亲和素测定末端Cys结合生物素残留量，并用ImageJ对抗His信号和负荷控制进行量化。

用PS缺陷细胞系检测感染

野生型CHO-K1与ps缺乏的CHO细胞系psa 313在缺乏PS脂质体的F12K培养基中饥饿2天。M)。在感染EBS(MOI=40)之前，用含PS脂质体的F12K培养基(30 HPI)代替EBS培养基。M)，用冷冻-解冻-超声法(下文解释)和环己酮(1.2微克/毫升)制备。50 HPI时，用HBSS洗涤细胞，甲醇固定。包涵体用探测仪染色。在3幅大图像(3×3张，放大60倍)(三倍)中计数包涵体数目，用标准显微镜法测定感染性。

为定量重组蛋白对EB内化的影响，将融合的CHO细胞用含相关重组蛋白的250 ml细胞培养液(100 g/ml)，孵育1h，冷却至4°C，加入纯化的EBS(MOI=40)，4℃孵育1h，37℃下孵育2h，进行内化。用HBSS广泛洗涤去除游离EBS后，用0.5×胰蛋白酶/EDTA溶液(Invitrogen)分离CHO细胞和非内化EBS，37°C连续离心15 min，1000×离心去除EBS。g和250×g..使用先前描述的协议的修改版本，qPCR对内部化进行了量化。27..用酚-氯仿法从感染细胞中提取DNA，用200 ng RNase处理的DNA，用SYBR绿色PCR主混合(应用生物系统)和16条S rRNA引物(正向：CCAACACCTCACGGCGAG，反向：CGCCTGAGGAGGTACACTCGC)检测衣原体DNA和GAPDH引物(正向：TGGTACACACACAGGGG，反向：GTGAGGGAGATCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG在95°C下，qPCR的反应顺序为5 min，随后依次为60次循环(95°C 15 s，60°C 15 s，68°C 30 s)(ABI棱镜7000，应用生物系统)。与GAPDH相比，16个S基因拷贝数为2。−ΔΔCT27.

膜脂条法

采用含15种不同生物活性脂样品(100 Pmol)的硝化纤维素膜条(EraconBiosciesInc.)，按照供应商提供的协议进行了PL结合试验。The lipids tested were glyceryl tripalmitate(GT)，diacylglycerol(DAG)，PA，PS，phosphatidylethanolamine(PE)，phosphatidylcholine(PC)，phosphatidylglycerol(PG)，cardiolipin(CL)，phosphatidylinositol(PI)，phosphatidylinositol-(4)-monophosphate，(PI(4)P，phosphatidylinositol-(4，5)-diphosphate(PI(4，5)P2)，phosphatidylinositol-(3，4，5)-triphosphate(PI(3，4，5)P3)，cholesterol(Chol)，sphingomyelin(SM)，and 3-sulphogalactosyl ceramide(Sulfatide).用含3%(wt/vol)脂肪酸的PBS-T(0.1%v/v吐温)在室温(RT)条件下，与重组蛋白(1g/ml)在PBS-T(+3%BSA)中孵育1h，阻断硝化纤维素膜。然后用PBS-T清洗三次膜，用抗His或抗GST抗体检测结合蛋白。

脂质体拉拔实验

55%脂质体L-α-DOPC、20%磷脂酰乙醇胺、碳水化合物和其他脂类(Sigma-Aldrich，IV-S型，#P-3644)采用冷冻-解冻-超声法制备(J.Wiese，Heinrich-Heine University Düsseldorf)。脂质在氯仿和丙酮中再悬浮，RT搅拌2h。经4°C沉淀后，脂类在二乙醚中溶解，在氮下干燥。PL-颗粒溶于HBSS，水浴(30×5s)。经PD 10柱传代纯化后，与重组蛋白(5g)在室温下孵育20 min，终量为100μl，脂质体在16000×15 min内造粒。g取上清液，用100μmol/L的PBS再悬浮。然后用免疫印迹法分析颗粒和上清液组分的不同组分。用抗His抗体检测重组蛋白。

GUV结合试验

GVS是通过电合成法制备的，其实质是描述的。28,29..涂脂的ITO切片在真空下干燥一夜。以下脂质混合物(以mol%为单位)分散在两张ITO幻灯片上[为成像目的添加荧光脂质德州红DHPE(生命技术)]：DOPC/德州红DHPE：99.75/0.25，DOPC/TR-DHPE/胆固醇：74.75/0.25/25，94.75/0.25/5 DOPC/tr-DHPE/DOPS，74.75/0.25/5/20 DOPC/TR-DHPE/DOPS/胆固醇，59.75/0.25/20/20，DOPC/Tr-DHPE/DOPS/胆固醇，94.75/0.25/5 DOPC/TR-DHPE/DOPA，74.75/0.25/5/20 DOPC/TR-DHPE/DOPA/胆固醇，DOPC/TR-DHPE/DOPS/胆固醇，94.75/0.25/5 DOPC/tr-DHPE/PI(4，5)P2，74.75/0.25/5/20 DOPC/TR-DHPE/PI(4，5)P2胆固醇，69.75/0.25/10/20 DOPC/TR-DHPE/PI(4，5)P2胆固醇或69.75/0.25/10/20 DOPC/TR-DHPE/PI(3)P/胆固醇。将两片ITO与蔗糖填充(10%，w/v)之间的间隙结合，在RT下孵育1.5h(电形成)。在Dylight 488标记的rCPn 0473(100 g/ml)中加入GUV，用共聚焦荧光显微镜(Nikon EclipseTi-E和A1R共焦激光扫描仪，60倍油靶，NA=1.49)立即观察。图像采集和分析采用NIS-Element(Nikon)。

GUV脂质移位试验

不对称guv是按照前面描述的方式编写的。19..以下脂质混合物(以mol%为单位)用于制备GVS：60/20/20，DOPC/DOPS/胆固醇和80/20 DOPC/胆固醇。每片膜的总脂重115克，在矿物油中重新悬浮(每小叶200微升)。外叶用500升葡萄糖(1M)与200微升的脂质混合物。内叶用50升蔗糖(1M)加入200升脂肪混合物，用碎料混合。混合的内小叶含量在外小叶期顶部被轻轻地插入。该管在2000×分时离心。g3分钟。GUS被洗涤并在葡萄糖中重新悬浮(1)M)。为检测内小叶中PS的含量，采用FITC标记的重组乳酸粘蛋白(rLactC2-FITC，10g/ml)与蔗糖混合，并与内小叶脂质混合，按上述方法进行。用rLactC2-FITC(10μg/ml)孵育外叶GUVS，监测其PS水平。用rCPn 0473(20μg/ml)与rLactC 2(10μg/ml)共同孵育。PS易位通过图像J分析，通过测量rLactC2-FITC信号与GVS相关。测量了一个GUV上三个不同位置的最大光强的中位数(每次实验最多24微微管)，并与背景信号强度进行了比较。与GVS相关的LactC2-FITC信号强度(其中PS仅限于内小叶)设置为1。

细胞PL外化试验

用0.6μg/L的膜联蛋白和30μmol/L膜联蛋白染色缓冲液(0.1)孵育Hep-2细胞，检测细胞内PS外化程度。MHEPES pH 7.4，4.4K NaCl 5mMCaCl2)，或用30μl重组FITC标记的PBS(LactC 2，100 g/ml)中的乳酸结合区(LactC 2，100 g/ml)在4℃下固定30 min，再与PFA固定。用重组FITC标记的γ和FYVE的30μl分别检测磷脂酰肌醇PI(4，5)P2和PI(3)P。作为对照，PIP生物传感器与PFA固定的Hep-2细胞孵育，经皂甙预处理，使细胞内PIP-结合。

重组蛋白处理后的Pl外化分析如下：融合Hep-2细胞被含100μg/ml重组蛋白的250 l培养基覆盖。细胞在37℃下与蛋白溶液孵育不同时间，用上述脂类标记物进行PL外化分析。通过使用Nikon NIS软件测量总FITC来量化外化PS的数量。

PS外化CPN感染分析如下：将合流的Hep-2细胞与含感染性EBS的250μl培养基(MOI=10)覆盖。为了观察包被重组蛋白的EBS对PS外化的影响，将EBS添加到100μl的蛋白溶液中(1μg/L)。M)在感染前4℃孵育30 min(MOI=10)。在100 ml抗血清悬液中加入EBS，4°C孵育2h，37°C允许感染持续2h，用Annexin-V Fluor LactC 2进行分析。只有4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚染色和抗脂多糖(CPN)或反MOMP(C.沙眼)衣原体EBS阳性。

凋亡试验

为诱导人上皮细胞凋亡，将合流的Hep-2细胞孵育于含2.5%的无血清培养基中。M为检测rcpn 0473对细胞凋亡的诱导作用，将细胞与100 g/ml蛋白孵育至16h，为分析感染早期细胞凋亡情况，将hep-2细胞感染。CPN37°C洗涤1h，经广泛洗涤后，细胞分离，球团化(300×5 min)。g)并重新悬浮在100升HBSS中。用Caspase-3和PARP特异性抗体进行Westernblotting分析.