促炎刺激可抑制巨噬细胞膜突起，而与病细胞共培养可增强巨噬细胞膜突起。 以往的研究发现，促炎骨髓来源的巨噬细胞(Bmdms)与未刺激或抗炎细胞相比，表现出更圆的有丝分裂形态。 27 ..为了研究隧道纳米管的形成，我们用脂多糖/干扰素γ或IL-4/IL-10向M(LPS/IFNγ)或IL-4/IL-10向免疫调节性M2样巨噬细胞(IL-4/IL-10)的方向分化，用LPS/IFN-2治疗小鼠BMDMs和永生化的IC-21腹腔巨噬细胞，诱导分化为M(IL-4/IL-10)。我们使用多种测试方法来表征成熟巨噬细胞极化标记物的表达，严格验证了我们的研究成果。 离体 极化实验系统首先，我们对差异表达的mRNAs和蛋白质进行了分析，观察了多种促炎症标记物如诱导型一氧化氮合酶(INNOS)的表达增加。 iNOS )、白介素-6( 伊-6 )和白细胞介素-1β( IL-1β )γ治疗后，抗炎指标如： 镉206 , YM1 和 Fizz 1 IL-4/IL-10刺激后(图1)。 1A，b ，补充图。 沙一 )28 ,29 ..此外，M(IL-4/IL-10)具有较高的ARG 1酶活性，ARG 1是组织修复的重要生物合成调节剂，而M(LPS/IFNγ)则促进单核细胞趋化蛋白1(MCP 1)的胞外分泌(如图1所示)。 1C，d )，一种有效的促炎趋化因子，调节巨噬细胞的迁移和浸润。 30 ..最后，用流式细胞仪分析极化BMDM，观察促炎标志物CD 80和CD 126或抗炎CD 206表达的变化。 1E )31 ..为了评估极化后巨噬细胞的存活能力，我们还用WST-1检测了细胞增殖，WST-1在这两种机制中均降低了细胞增殖，但对IL-4/IL-10刺激则无明显影响。 P =0.0015)和IC-21巨噬细胞( P < 0.0001) compared to non-treated controls (Fig. 1F )。相比之下，AnnexinV和Propidium碘化钠染色细胞的凋亡在治疗组之间没有变化(数据未显示)。合在一起， 离体 治疗在mRNA和蛋白质水平上产生预期的标记表达变化，证实我们的系统复制了预期的极化结果。
图1 LPS/IFNγ极化抑制BMDMs和IC-21巨噬细胞突起形成。( a )代表M(LPS/IFNγ)和M(IL4/IL 10)标记与内务控制相关的mRNA表达的条形图 GAPDH 在BMDMS和IC-21巨噬细胞中，经48小时前和抗炎巨噬细胞极化，与未处理细胞比较(n=5)。( b )有代表性的表达极化相关标志蛋白的免疫印迹-21巨噬细胞和未治疗的对照组。MCP 1和iNOS是M(LPS/IFNγ)标记，而ARG 1和CD 206是M(IL-4/IL-10)标记物。CD 68是一种泛巨噬细胞标记物，微管蛋白作为负载对照(n=2-4).( c )图描述了独立极化处理后细胞裂解液中M(IL-4/IL-10)标记物ARG 1酶活性的标准化比色法测定(n=3)。( d )用ELISA法测定MCP 1细胞因子在极化后分泌到培养基中的条形图(n=3)。( e 流式细胞仪分析显示M(LPS/IFNγ)标记CD 80和CD 126或M(IL-4/IL-10)标记CD 206在BMDM极化后的表达频率(n=3)。( f 用WST-1细胞增殖试剂测定BMDMs和IC-21巨噬细胞在极化处理后3d的细胞增殖(n=3)。( g )代表对照M(LPS/IFNγ)或M(IL 4/IL 10)-极化BMDM和IC-21巨噬细胞的广域荧光图像。较大的显微照片为5×5块的拼接图像。缩放插入显示自动图像处理选择突出-阳性(绿色)或负(红色)细胞。见附图。沙一 用于方法描述和示例。( h )极化BMDM和IC-21巨噬细胞突起阳性细胞的百分位数定量。盒晶须直方图中的每个数据点是一个拼接区域，每个实验分析5个区域(n=3)。( i )EGFP的典型荧光图像 + ic-21共培养三天，与WT(左)或 环磷酰胺 −/− (右)Dsred + 成纤维细胞。盒装插入显示出自动检测分析中EGFP的百分比。 + 突出阳性细胞在直方图中显示(n=3)。( j )极化EGFP的典型荧光图像 + IC-21巨噬细胞和 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞共培养。直方图显示对照组或M(LPS/IFNγ)和M(IL 4/IL 10)巨噬细胞有突起的百分比(n=3)。所有标度条：500标度M.所有条形图显示为平均±标准差(SD)。 P 数值由单向方差或学生的值决定。 t -测试。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
在对处理后的细胞进行成像后，我们还观察到M(LPS/IFNγ)形态在BMDMs和IC-21中都会向更圆的表型转变(如图所示)。 1g )。我们开发了一个图像分析工作流程，利用ImagePro Premier基于长度、宽度和圆度等特征，使用可定制的形态过滤自动检测和量化荧光膜突起(附图)。 S2 )。通过分析使用宽视场关键荧光显微镜获得的更大的拼接图像，我们的高通量方法使荧光细胞突起的自动、快速和无偏分析能够一次从数十个细胞到数百个细胞。使用该算法，我们观察到与未处理的巨噬细胞相比，与未处理的巨噬细胞相比，刺激γ/IFN后，bmdms和ic-21巨噬细胞的突起频率显著降低约50%。 P < 0.001) (Fig. 氢 )。相比之下，M(IL-4/IL-10)BMDM突起频率与对照组相比差异无统计学意义，而IC-21则略有下降。
我们试图通过每种细胞因子或刺激物刺激BMDM来扩展我们的突出频率发现。我们观察到，与未治疗或M(IL-4/IL-10)相比，脂多糖或干扰素γ本身对减少突起形成的作用是相同的(附图)。S3 )。此外，就像M(IL-4/IL-10)BMDM一样，我们再次检测到M(IL-4)或M(IL-10)BMDM的突起频率与未治疗对照组相比没有差异。最近的证据表明，结核病感染会引起M(IL-10)巨噬细胞TNT形成增加，但直接用IL-10刺激bmdms似乎并不能再现这种表型。 32
我们以前曾报道过，与小鼠囊性成纤维细胞共培养ic-21巨噬细胞可促进tnt的形成。 7 ..我们使用我们的新的自动成像系统复制了这些实验，并观察到与病鼠共培养的ic-21巨噬细胞膜突起形成的增加。 环磷酰胺 −/− 成纤维细胞与野生成纤维细胞的比较 P =0.007)(图1。 1I )。促炎刺激这些共培养物可以减少巨噬细胞源性突起的形成，而成纤维细胞没有明显的形态学改变(见图)。 1J )，确认我们以前的数据(如图所示)。 氢 )。这些数据表明，促炎症M(LPS/IFNγ)巨噬细胞产生的膜突起少于免疫调节M(IL-4/IL-10)细胞，且病变的囊性细胞在共培养时促进巨噬细胞的突起形成。
巨噬细胞衍生的膜突起类似于隧穿纳米管。 由于还没有发现tnt特异性标记物，我们主要根据巨噬细胞衍生膜突起的形态来研究它们的特性；tnt是长而动态的富含肌动蛋白的管道，从质膜延伸而不与底层接触。 33 ,34 ..巨噬细胞共培养的细胞骨架免疫染色显示，所有突起都富含肌动蛋白，有些细胞还含有微管蛋白核心。 2A )，巨噬细胞介导细胞器转移所产生的较厚TNT的一个独特特征 26 ..通过Z叠的高分辨率成像和利用ImagePro生成三维重建来显示突出物。 2B ，补充录象带 1 和 2 )。BMDMs和IC 21巨噬细胞均有EGFP阳性突起延伸至下层以上。EGFP突起的Termini与DsRed成纤维细胞体相邻，可能提示膜融合，并通过细胞膜间连接促进TNT的稳定。此外，我们还将bmdms与cts共培养。 −/− 细胞松弛素B(CytoB)的成纤维细胞被报道为一种肌动蛋白破坏稳定剂，可阻止TNT的形成和抑制细胞器的贩运。 35 ,36 ..细胞B治疗24小时可消除BMDM中的膜突起，并在细胞B去除数天后恢复扩张(如图所示)。 2C ).
图2 一些巨噬细胞突起与TNT结构、行为和形态相似。( a BMDMs和IC-21细胞免疫组化共聚焦显微镜观察细胞骨架成分-肌动蛋白(红色)和微管蛋白(绿色)。较薄的(箭头)和较厚的(恒星)凸出在两种细胞类型中。标尺条：10分贝( b )3D Z-EGFP的堆栈重建 + BMDM或IC-21细胞(标记M)与 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞(标记F)。盒装插入突出，延伸到盘子表面(箭头)和休息沿底层(箭头)。见补充录像 1 和 2 ..标尺条：10分贝( c )描述EGFP的有代表性的缝制显微照片 + BMDMS治疗后细胞松弛素B(CytoB)的清除与未治疗对照组比较。XY图显示在每种情况下，随着时间的推移，突起阳性细胞的百分比(n=每组3个区域)。标尺：500分贝( d )单独和共同培养的EGFP BMDM的代表原始共焦显微照片和测量图像 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞。首先对原始图像进行自动突出检测(INSERT)，盒晶须图(右)显示BMDM单独和共培养时阳性细胞的百分位数量化。凸出检测软件很少捕捉到完整的形状，因此将结果作为指导，通过沿法向膜曲率的估计，盲目地从细胞体中分离出凸出物。然后使用ImagePro测量凸出；面积测量显示在顶部图像上，长度显示在底部。标尺：100分贝( e )盒和晶须图(顶部)和频率直方图(下)描绘面积，长度，圆度和纵横比的测量单独与在共培养。圆度计算为物体与直径等于物体最大Feret直径的圆的比值，以0~1.0的标度表示，1.0是一个完美的圆。长宽比是日食的长轴和短轴的比率，相当于物体的长轴，其值较高，意味着一个更细长的物体。Rout测试识别并排除的异常值。用高斯线性回归拟合直方图的曲线。 P 由单向变异系数或学生值决定的数值 t -测试。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
为了进一步表征凸起，我们分析了自动检测区域的形状和大小。我们单独或在与dsred的共培养中播种和拍摄同等数量的EGFP bmdm。 环磷酰胺 −/− 成纤维细胞。我们首先使用我们的图像分析工作流程来确定共培养细胞中有突起的细胞的百分比高于仅使用bmdm的细胞百分比( P =0.046)(图1。 二维空间 )。以自动检测区域为指导，盲目地从细胞体中分离出完整的突起，然后用ImagePro测量得到的区域。在这两种情况下，我们测量了242个单独的突出，发现平均突出面积为380.5±145.4米。2 平均长度为45.00±15.41μm，由于TNT的多样性，细胞类型之间的“标准”尺寸有很大的差异。37 ..尽管如此，大多数作者报告的平均tnt长度在17.7m(Jurkat T细胞)到44m(arpe-19视网膜色素上皮细胞)之间，而最长的突起长度可达120 mm2，证实我们的测量结果与tnt是一致的。 34 ,38 ..出乎意料的是，我们还发现，由共培养的巨噬细胞产生的突起更大、更长，这意味着它们不是圆形的，大轴与小轴的比例更大(如图所示)。 2E )。这些数据不仅证实了相当比例的突起似乎具有适当的大小可视为TNT，而且还强调了病变膀胱细胞的存在对突起形态和频率的影响。这特别有趣，因为以前的工作已经表明，较厚的巨噬细胞tnt优先运输细胞器。 26
最后，我们分析了巨噬细胞极化后参与TNT形成的几个基因的表达情况，以评估TNT相关基因的差异表达(附图)。 S4 )。在M(LPS/IFNγ)bmdm中，我们观察到mhcⅡ类蛋白白细胞特异性转录本1(mhcⅡ)的mRNA表达增加。 Lst 1) ..相比之下，M(lps/IFNγ)bmdms表达的rho家族gtp酶细胞分裂控制蛋白42同源性降低。Cdc 42 )。我们没有检测到其他tnt相关基因的变化，例如 M-SEC ，这是外囊复合体的一个组成部分，它直接促进TNT的形成，我们也没有检测到蛋白质表达的任何变化(数据未显示)。 39 ..这种TNT标记在极化后的表达变化是有趣的，但需要对蛋白质活性和定位进行深入的研究，以揭示极化与TNT形成之间的任何机制联系。因此，就突起特征而言，聚焦于结构、行为和形态是更可靠的方法，以表明在我们的共培养条件下自动观察到的巨噬细胞衍生突起的很大一部分代表。 善意 TNTS。
巨噬细胞与囊性细胞的共培养不仅增加了溶酶体，而且增加了线粒体的细胞间转移。 为了研究巨噬细胞极化对TNT介导的细胞间细胞器贩运的潜在影响， 环磷酰胺 −/− 和WT DsRed + 成纤维细胞与ic-21巨噬细胞共培养，融合蛋白为cystinosin-egfp或ffp，后者是弗里德里希共济失调的线粒体铁螯合剂。 40 离体 活体显像显示含囊藻毒素-EGFP的溶酶体或含fgfp的线粒体从巨噬细胞转移到患病小鼠。 环磷酰胺 −/− 或 FXN −/− 成纤维细胞 7 ,8 ..高倍镜三维重建证实dsred细胞质内存在EGFP阳性细胞器。 + 成纤维细胞，如三维渲染和正交投影所示(补充图。 S5a，b ，补充录象带 3 和 4 )。溶酶体转移经TNT样结构证实(附图)。 S5c 、视频 5 ).
我们使用另一种图像分析算法来量化溶酶体和线粒体从巨噬细胞转移到成纤维细胞的效率，该算法类似于我们开发的TNT量化算法，该算法测量dsred定义的感兴趣区域(Roi)中EGFP点(“供体”)的频率。 + “受体”细胞(附图) S6 )。75，000 cystinosin-egfp或frataxin-egfp-表达IC-21巨噬细胞和50，000 dsRed的共培养 + WT或 环磷酰胺 −/− 成纤维细胞培养3天后固定，单独培养成纤维细胞作为对照。 3A )。荧光显像显示，两种囊藻毒素-EGFP溶酶体的数量显著增加( P =0.042)和相合素-EGFP线粒体( P =0.019) 环磷酰胺 −/− 成纤维细胞与WT成纤维细胞的比较(图1)。 3B，c ，补充图。 S6c )。此外，我们对巨噬细胞进行了共培养实验，以确定其中一种巨噬细胞亚型是否影响细胞间贩运的效果。我们观察到在与M(LPS/IFNγ)巨噬细胞共培养的成纤维细胞中，cystinosin-EGFP阳性溶酶体的出现明显减少。 P =0.045)(图1。 三维空间 ).
图3 胞间转运蛋白-EGFP溶酶体和相合素-EGFP线粒体的转运增加到患病状态。 环磷酰胺 −/− 共培养巨噬细胞后成纤维细胞和炎性极化减弱。( a )具有代表性的联合培养背景对照的荧光显微照片，只有受体DsRed。 + 成纤维细胞。盒装插入描绘了自动图像处理显示供体阳性(绿色)和捐献者阴性细胞(红色)。见附图。 S3 自动化方法。( b )ic-21 cystinosin-egfp与WT或wt共同培养的典型荧光图像。 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞。放大插入突出自动转移量化。箭头表示DsRed中的EGFP信号 + 成纤维细胞。恒星表示由于细胞重叠而被排除的信号。( c )cystinosin或frataxin-EGFP的百分位数定量 + 成纤维细胞通过自动图像分析。每个数据点在一幅拼接图像中代表供体阳性受体细胞的百分比(n=3)。在所有共培养条件下，供体EGFP信号明显多于背景对照，只有成纤维细胞( P < 0.05). (d )极化后巨噬细胞和成纤维细胞共培养中Cystinosin-EGFP的转运频率，与成纤维细胞单独对照比较。直方图显示成纤维细胞的百分比自动确定为EGFP信号阳性(n=5)。所有标度条均为500μm，所有图均表示为均值±SD。 P 由单向变异系数或学生值决定的数值 t -测试。* P < 0.05, **P < 0.01.
为了证实我们的发现使用另一个稳健的分析，我们进行了流式细胞术共培养分析双EGFP-和DsRed-阳性细胞；单独培养的两种细胞类型作为门控对照(图1)。 4A ，补充图。 S7a )。与我们的荧光成像结果一致，在共培养中观察到约70-90%的双阳性群体。 环磷酰胺 −/− 两种囊素-EGFP的成纤维细胞( P =0.0168)或兄弟会素-EGFP( P 与WT成纤维细胞共培养相比，巨噬细胞=0.0371。 4B )。EGFP的另一种控制 + 和德斯莱德 + 分选前混合的细胞不能产生双阳性细胞，这表明延长共培养是必要的，以促进细胞间的相互作用，从而产生绿色荧光蛋白。 + 德雷德 + 人口(附图) S7b )。此外，促炎巨噬细胞极化也显著减少了cystinosin-EGFP和Fr ataxin-EGFP的转移。 4C )。总之，这些数据表明，疾病细胞促进了溶酶体和线粒体从巨噬细胞向成纤维细胞的转移，而促炎症极化则抑制了这一过程。
图4 流式细胞术证实细胞间的转运增加到患病。 环磷酰胺 −/− 成纤维细胞受促炎极化抑制。( a )有代表性的dsred(y轴)和egfp(x轴)的FACS图，共培养50，000个细胞，分别为cystinosin-或frataxin-egfp和wt或wt。 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞。EGFP和DsRed门之间的信号被归类为“双阳性”EGFP + 德雷德 + 人口。见附图。 S4 分类和分类策略。( b )EGFP的量化百分比 + 德雷德 + cystinosin或frataxin-egfm巨噬细胞与wt或wt共培养中的双阳性细胞 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞。复制物由多种小鼠成纤维细胞共培养而成(n=4)。( c )共培养物与cystinosin或frataxin-egfp和fgfp共培养后双阳性细胞频率的定量。 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞(n=3)。所有图均为均值±SD。 P 由单向变异系数或学生值决定的数值 t -测试。* P < 0.05, **P < 0.01.
hspc在移植肾内的巨噬细胞 环磷酰胺 −/− 小鼠似乎优先表达M(LPS/IFNγ)标记 如 离体 极化提示促炎M(LPS/IFNγ)巨噬细胞对TNT的形成和细胞器转移均有影响。 体内 大鼠HSPC移植后巨噬细胞表型 环磷酰胺 −/− 老鼠。我们将WT EGFP HSPC移植到 环磷酰胺 −/− 接受小鼠尾静脉注射如前所述 14 并通过对肾脏切片进行免疫染色分析巨噬细胞极化标记物(附图)。 S8 )。我们观察到EGFP之间的鲁棒共定位。 + HSPC后代与巨噬细胞标记CD 68(附图) S8a )。出乎意料的是，与抗炎标志物ARG 1、CD 206或CD 163(补充图)相比，CD 16/32或MHCII等M标记物(LPS/IFNγ)与干细胞子代的共定位更为丰富。 S8b )。在其他组织如肿瘤上检测抗体以确定阳性免疫反应(补充图)。 s8c )。这些数据表明 体内 促炎症巨噬细胞在囊虫病HSPC移植后负责组织保存。
抗炎巨噬细胞极化破坏 瑞秋2 −/− HSPC对HSPC移植效果及TNT形成无影响 为了确定促炎症巨噬细胞是否负责HSPC移植后囊虫病的组织保存，我们对巨噬细胞极化进行了基因修饰，以评估缺陷是否阻止了HSPC移植后囊虫表型的挽救。这个 瑞秋2 −/− 小鼠模型，破坏造血特异性rho家族gtp酶 瑞秋2 ，是由于其在肌动蛋白细胞骨架重组和巨噬细胞极化中的作用而被选择的。 41 ,42 ..由于RAC 2能促进M(IL-4/IL-10)巨噬细胞的分化，促炎症性M(LPS/IFNγ)巨噬细胞在基因敲除中富集。 瑞秋2 −/− 小鼠 43 ,44 ,45 ..一个非常相似的家族成员，RAC 1，也在巨噬细胞突起的生物发生中起着作用，这些巨噬细胞突起包括侵入性巨噬细胞、扁平苔藓和TNT。 42 ,46
测试 瑞秋2 消除对HSPC移植效果有任何影响。 瑞秋2 −/− 将转EGFP基因的小鼠移植到2个月大鼠体内。 环磷酰胺 −/− 接受者老鼠。 环磷酰胺 −/− WT EGFP移植小鼠 + 或 环磷酰胺 −/− EGFP + 用HSPC分别作为对照物，证明对预防囊虫病有效或无效。 14 ..用EGFP定量测定HSPC的植入量 + 三组移植后外周血细胞差异无显着性(WT−平均为71.5%)， 环磷酰胺 −/− −75.6%和 瑞秋2 −/− −为65.9%。移植后6个月处死小鼠，采集标本进行生化和表型鉴定.对WT HSPC受体组织胱氨酸含量的评估导致肝脏、脾脏和肾脏中胱氨酸负荷的显著减少。 环磷酰胺 −/− HSPC-移植动物，如预期(图1)。 5A )。令人惊讶的是，移植 瑞秋2 −/− HSPC使胱氨酸含量下降到与WT HSPC对照相同的水平。此外，救援 环磷酰胺 在组织中的表达在WT和 瑞秋2 −/− HSPC-移植 环磷酰胺 −/− 老鼠(图1. 5B )。综合起来，这些数据表明 瑞秋2 −/− HSPC移植完全能够恢复病变组织的功能。
图5 促炎巨噬细胞富集 体内 通过移植 瑞秋2 −/− hspc对hspc的疗效无影响。 环磷酰胺 −/− 小鼠或BMDM TNT形成 离体 . (a )用质谱法测定脾脏、肝脏和女性肾脏中胱氨酸含量的直方图。 环磷酰胺 −/− 荷瘤小鼠(n=5)， 环磷酰胺 −/− HSPC(n=4)，以及 瑞秋2 −/− HSPC(n=4)。只有女性肾脏才能显示出来，因为先前的观察表明，肾脏需要按性别进行分析。 16 在最小的受体组中，只有2名男性。( b )小鼠mRNA定量 环磷酰胺 移植表达 环磷酰胺 −/− 小鼠脾、肝、肾。直方图表示 环磷酰胺 相对于内务管理控制的表达式 GAPDH . (c )具有代表性的肾切片共焦显微照片 环磷酰胺 −/− 荷瘤小鼠 瑞秋2 −/− HSPC(绿色)，用巨噬细胞标志F4/80(红色)和核染色DAPI(蓝色)探测。箭头表示EGFP HSPC后代与F4/80表达的共定位。( d )共焦显微照片，显示肾脏切片。 环磷酰胺 −/− 小鼠移植WT(顶)或 瑞秋2 −/− (下)EGFP HSPC显示薄的EGFP TNT样突起从细胞体外延伸。冷冻切片用抗GFP染色以提高HSPC后代的可见度，然后用罗丹明phallodin探测tnt样结构(箭头)内的肌动蛋白。标尺条：10分贝( e )从WT或 瑞秋2 −/− 骨髓共培养 环磷酰胺 −/− 德雷德 + 成纤维细胞和评估频率的突出使用自动分析软件(见补充图。 沙一 )。直方图显示BMDM阳性率的量化(n=3)。标尺：500分贝( f )条形图显示了与内务控制相关的各个体促炎和抗炎巨噬细胞极化基因的mrna表达。GAPDH 在WT或 瑞秋2 −/− BMDM(n=3)。( g )条形图显示了从WT或WT衍生的条件培养基中促炎性MCP 1细胞因子分泌的测量。 瑞秋2 −/− BMDM采用ELISA法评定(n=3)。( h )棒状图表示M(IL-4/IL-10)标记物ARG 1酶活性在WT或 瑞秋2 −/− BMDM通过与空白的标准曲线(n=3)进行归一化。( i )共焦显微照片 瑞秋2 −/− BMDM微管蛋白(绿色)和肌动蛋白(红色)细胞骨架免疫染色 瑞秋2 −/− BMDM突起只有肌动蛋白(箭头)，其他也含有微管蛋白(箭头)。除另有说明外，所有标尺为10公分。所有图均为均值±SD。 P 价值观由单因素方差分析或学生决定。 t -测试。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
然后用免疫荧光法对肾脏切片进行免疫细胞浸润分析，观察两组间的共定位情况。 瑞秋2 −/− EGFP、HSPC、F4/80、CD 68等巨噬细胞标记物。 5C )，表明典型的巨噬细胞分化仍未改变。我们还检测到gfp tnt样突起在两个肾内。 瑞秋2 −/− 而WT HSPC受体的肌动蛋白染色阳性，这是TNT的另一个特征(见图)。 5D )。这些数据证实，剔除hspc的细胞保留形成tnt样突起的能力。 体内 .
最后，我们对分离到的bmdms的突起行为和极化表型进行了研究。 瑞秋2 −/− EGFP小鼠 离体 ..我们量化了新分离的WT EGFP的共培养。 + 和 瑞秋2 −/− EGFP + BMDM 环磷酰胺 −/− 成纤维细胞使用我们的突出检测成像算法(补充图。 沙一 )，并观察到wt-和wt之间的突出频率没有显著差异。 瑞秋2 −/− -BMDM( P =0.0472；图1。 5E )。然后我们分析了极化标记，并证实了与WT BMDM相比， 瑞秋2 −/− BMDMs向M(LPS/IFNγ)倾斜，没有任何外在刺激(图)。 5F-h )。然而，我们注意到基因的mRNA表达变化的幅度总体上不是很大。 肿瘤坏死因子α , 伊-10 或 (图1) M(LPS/IFNγ)巨噬细胞治疗 离体 (无花果) 1A )或基因型之间没有显着性差异( iNOS , Arg 1 或 (中六) (无花果) 5F )。即使如此，与WT相比，mcp 1分泌明显增加，arg1酶活性显著降低，进一步证实了wtbmms的促炎表型。 瑞秋2 −/− 巨噬细胞 5G，h )。然而， 瑞秋2 −/− EGFP BMDM仍然形成类似TNT的管子，由肌动蛋白和微管蛋白细胞骨架组成。 5I )位于地下表面之上(数据未显示)。综合来看，这些结果表明，当极化表型 瑞秋2 −/− EGFP + bmdms向M(lps/IFNγ)表型倾斜，既形成tnt样突起，又形成tnt样突起。 瑞秋2 −/− HSPC移植效果不受影响。
