微生物代谢产物脱氧胆酸通过减弱炎症性环氧合酶信号传导来控制产气荚膜梭菌诱导的鸡坏死性肠炎 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

微生物代谢产物脱氧胆酸通过减弱炎症性环氧合酶信号传导来控制产气荚膜梭菌诱导的鸡坏死性肠炎

摘要

坏死性肠炎(NE)产气荚膜梭菌由于在消费者偏好和监管压力下预防性抗生素的使用减少，感染再次成为一种在世界范围内流行的家禽疾病。缺乏可供选择的抗菌策略来控制这种疾病，主要是由于对NE的发病机制、微生物群和宿主反应之间的关系的了解有限。在此我们发现次级胆汁酸脱氧胆酸(DCA)的微生物代谢副产物(DCA)在低至50 M时，对82.8%的胆汁酸代谢有抑制作用。C.香水在胰大豆肉汤中生长(P<0.05)。序贯最大艾美耳球虫和C.香水挑战对肉鸡的去甲肾上腺素(NE)、严重的肠道炎症和体重(BW)损失有显著的诱导作用。1.5g/kg DCA日粮可显著降低这些不良反应(P<0.05)。在细胞水平上，DCA可减轻NE相关回肠上皮细胞死亡，显著降低固有层细胞凋亡。有趣的是，DCA减少了C.香水侵袭回肠(P<0.05)，不改变细菌回肠腔内定植。分子分析表明，DCA显著减少了炎症介质。InFγ, 利塔夫, IL1β，和MMP 9回肠组织中mRNA的积累。机理研究表明C.香水炎症介质表达增加(P<0.05)InFγ, 利塔夫，和Ptgs 2鸡脾细胞环氧合酶-2(COX-2)基因。阿司匹林抑制COX信号转导可显著减轻γ诱导的脾细胞炎症反应.与离体试验中，雏鸡饲喂0.12g/kg阿斯匹林能保护雏鸡免受NE引起的体重丢失、回肠炎症和肠道细胞凋亡的影响。总之，微生物代谢产物DCA通过减轻炎症反应，防止NE引起的体重丢失和回肠炎症。这些微生物群保护鸟类免受NE感染的新发现，为开发下一代抗NE抗菌药物提供了新的选择。

导言

抗菌药物耐药性是新出现的挑战之一，需要从农业到卫生保健采取立即和可持续的对策。1..抗菌药物耐药性的增加导致了多重耐药微生物或“超级细菌”的出现。最近，一个“超级臭虫”大肠杆菌美国报道了对最后一种抗生素-大肠杆菌素(Colistin)耐药的菌株。2..在医疗和农业实践中过度使用抗菌药物，加剧了新出现的耐药微生物的发作。1..然而，由于降低生产效率和增加疾病，撤回鸡肉生产中的抗菌药物给养鸡业带来了新的问题。最大艾美耳球虫-和产气荚膜梭菌-致坏死性肠炎(NE)3..Ne是一种多因素疾病，每年损失数十亿美元，对养鸡业具有重大的经济影响。4..尽管世界范围内没有临床NE爆发，但2013年至2014年，挪威东南部的亚临床NE(胆管肝炎)发病率翻了一番，与饲料中抗菌药物的使用减少有关。5..急性去甲肾上腺素的临床症状包括水到血(暗)腹泻，严重抑郁，食欲下降，闭上眼睛，和皱褶羽毛。对死鸟或重病鸟的解剖显示，肠道通常被气体膨胀，非常易碎，含有一股恶臭的棕色液体，可见明显的坏死病变。6..在细胞水平上，去甲肾上腺素鸟类表现为肠道炎症，绒毛和地穴呈弥漫性和凝固性坏死，免疫细胞浸润到固有层，隐窝脓肿。7,8..尽管在了解影响去甲肾上腺素预后的危险因素方面取得了进展，例如C.香水毒力、球虫病和饲料9缺乏有效的非抗菌策略。

人和动物的肠道含有数万亿的微生物，这种肠道微生物区系调节着各种宿主的功能，如肠屏障、营养和免疫平衡。10,11,12..肠道微生物对粒细胞增多和新生儿反应的调节大肠杆菌K1和肺炎克雷伯菌脓毒症13，提示微生物在保护宿主免受全身感染中的关键作用。在肠道层面，几十年前就有报道称粪便移植是为了防止婴儿沙门氏菌鸡感染14..最近，微生物区系移植对复发的人类表现出巨大的成功。艰难梭菌感染15和梭状芽孢杆菌代谢次生胆汁酸已被证明可以抑制艰难梭菌感染16..肝脏合成的胆汁酸在肠道中释放，并由肠道微生物区系代谢成二级胆汁酸的最终形式。17..二次胆汁酸脱氧胆酸(DCA)与多种人类慢性疾病有关，如肥胖、糖尿病和大肠癌。18,19..近年来，小鼠厌氧菌及其代谢产物dca已被发现用于预防和治疗。空肠弯曲菌通过抑制宿主炎症信号通路诱导无菌小鼠肠道炎症20..然而，胆汁酸是否在NE的发病机制中发挥作用尚不清楚。

Ne经常与球虫病的发病同时发生。21..鸡球虫病与强免疫反应和肠道炎症有关。22,23..球虫引起的肠道炎症可能会提供一个良好的环境。C.香水过度生长、毒力表达和入侵21. C.香水产生各种毒素24引起非鸡模型溶血、上皮屏障功能障碍、组织坏死和严重炎症。25,26..在炎症信号通路中，环氧合酶(Cox)催化的脯氨酸调节细胞增殖、凋亡和迁移等多种活动。27，胃肠道分泌物28体温29、发炎30，疼痛感31..的另一种剪接基因cox-1和cox-3Ptgs 1，在肠道细胞中表达，并保持肠上皮细胞的完整性。诱导型COX-2(Ptgs 2)活性与各种炎症疾病有关，包括炎症性肠病32和辐射引起的小肠损伤33..COX-2增加肠道屏障通透性和肠道屏障的细菌易位。34,35..矛盾的是，COX-2通过前列腺素D促进炎症反应。236..虽然非选择性的环氧合酶抑制剂阿司匹林用于预防各种慢性疾病，但它会对健康的肠道造成肠道炎症。37..然而，COX信号在去甲肾上腺素中的作用尚不清楚。

目前，关于NE的发病机制、微生物群和宿主炎症反应之间的关系，目前还知之甚少。因为DCA会衰减C.空肠-肠道炎症20并防止离体生长艰难梭菌16，同属成员C.香水我们推测微生物区系代谢产物DCA通过抑制肠道炎症而减弱NE。我们发现DCA能减少NE所致的肠道炎症，C.香水入侵，肠道细胞死亡，体重减轻。阿司匹林阻断炎症性COX信号通路可减轻NE所致的肠道炎症。这些针对去甲肾上腺素的微生物群DCA和COX抑制剂的新发现为预防和治疗提供了新的策略。C.香水-诱发疾病。

材料和方法

胆汁酸抑制C.香水测定法

胆汁酸抑制试验空肠弯曲菌生长38, 103CFUC.香水接种于10 ml胰大豆汤(TSB)中，加入0.5%硫代赖氨酸钠，加入牛磺胆酸(TCA，0.2mm，终浓度)，胆酸(CA，0.2mm)，DCA(0，0.01，0.05，0.1，0.2mm)，或0，0.2，1mm岩性胆酸(LCA)或熊去氧胆酸(UDCA)。在厌氧条件下，将不同处理的细菌肉汤在42℃下(16~18h)隔夜培养。在试管中观察到细菌的生长是为了抑制(透明肉汤)或不抑制(混浊的肉汤)。用OD法测定细菌的生长情况。600NM使用分光度计(纳米滴，热费雪)。

鸡实验

动物实验与动物研究相一致：在现场实验(https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines)。这些实验得到了阿肯色州大学护理和使用委员会的批准。每组13只0日龄肉用雏鸡，分别来自科布-凡特里斯·哈特奇里(SiloamSprings，AR)。在环境控制的隔离室中，将雏鸡颈部标记，随机分配到地板笔上，用新的松屑作为垃圾，适合于生物安全水平(BSL)Ⅲ的动物实验。为这些鸟提供了各自的食物和水。[医]锂，第5天温度维持在34°C，然后逐渐降低，到第26天达到23°C。这些鸟类在0至10天期间以玉米-豆粕为基础的起始饲料喂养，在11-26天内饲喂种植者的饲料。基础饮食如前面所述。39..处理日粮中添加1.5g/kg CA或DCA(均来自阿尔法·伊索)。饲料中不添加抗生素、球虫或酶。E.Maxima约翰·巴塔博士亲切地提供了M6株，这是1973年安大略省兽医学院的一株卵囊分离物。这个E.Maxima如前文所述，在鸡中繁殖40..发现的卵囊如先前描述的那样被孢子化了。41. C.香水来自德克萨斯州大学公园USDA-ARS的捐赠42,43多重PCR法证实α-毒素阳性42,44..冰冻的别名C.香水在TSB+硫代甘酸钠(TSB)+巯基乙酸钠(Nag)中培养一夜，进行去甲肾上腺素激发试验，并将其依次稀释和镀在胰大豆琼脂+巯基乙酸钠上，计数CFU。在以前的实验中，受此病毒感染的鸟类C.香水单独没有显示任何NE的迹象，并有可与未受感染的鸟类相比的体重增加(数据未显示)。在目前的实验中，鸟类感染了20，000粒孢子。E.Maxima18天和10岁的卵母细胞/鸟9CFUC.香水/23天和24天的鸟。分别测定0日龄、18日龄、23日龄和26日龄时的体重和采食量。禽类感染后每日监测其健康状况。试验组在23日龄和26日龄处死4只体重平均的鸟类。由于在去甲肾上腺素模型中常在上回肠出现大体坏死病变，因此采集了所有死鸟的回肠组织和消化道标本进行RNA和DNA分析。回肠组织长度为8cm，采用瑞士轧制法进行H&E染色和组织病理学分析。用NikonTS2荧光显微镜获取图像。盲肠炎症评分采用H&E瑞士滑片(4张幻灯片(鸟类)/治疗)。简单地说，每个瑞士滚动滑梯被划分为4个区域，并被打分.再加上上述四个区域评分，计算组织病理学总积分。下面的评分表是根据以前的牙周炎来制定的。45,46结肠炎评分系统47评分0：未见炎症、绒毛和隐窝完整；评分1：绒毛固有层和隐窝的少量浸润细胞或绒毛微小缩短；评分2：绒毛和地穴层固有层浸润细胞较多，绒毛缩短>1/4，水肿或隐窝增生；评分3：绒毛固有层、隐窝、粘膜下层和肌层明显浸润细胞，绒毛缩短>1/2，水肿或增生和再生；评分4：坏死、绒毛弥漫性、溃疡、隐窝脓肿或跨壁炎症(可扩展至浆膜)。

末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法

用TUNEL法观察肠组织细胞凋亡情况。48..将回肠组织切片与二甲苯浴分离3次，再用100%、95%、70%乙醇进行再水化。用TUNEL液(5M荧光素-12-dUTP(Enzo生命科学)、10 MdATP、1mm pH 7.6 Tris-HCl、0.1mm EDTA、1U TDT酶(Promega)在37℃下孵育90 min。切片用DAPI反染，显示细胞核。用NikonTS2荧光显微镜对荧光绿色凋亡细胞进行评价和成像。每片有代表性的3个区域的绿点作为凋亡细胞计数，用ImageJ计数细胞核蓝点为总细胞。49Nikon Nd2阅读器的粒子分析及其插件。结果显示，每1，000只小肠细胞中就有凋亡细胞。

实时PCR技术检测mRNA和mRNA的表达C.香水定量化

用TRIzol提取回肠组织或脾细胞总RNA。20,50..用M-MLV(NE Biolab)制备cDNA.在Bio-Rad 384井实时定量PCR系统上，用SYBR绿色PCR主混合物(Bio-Rad)检测促炎基因的mRNA水平，并将其归一化为GAPDH..量化C.香水肠腔定植或组织侵袭，回肠消化或组织称重，打珠，用酚氯仿法提取dna。20. C.香水在消化和组织中使用C.香水用qPCR扩增16S rDNA引物。PCR反应按照制造商的推荐进行。使用了以下基因引物：

Cp16S_前进：5‘-CAACTTGGGGCTGCATTCC-3’；Cp16S_反向：5‘-GCCTCAGCGTCAG-3’；MMP 9向前：5‘-CCAAGATGTGCTCACCAAGA-3’；MMP 9-反向：5‘-CCAATGCCCACTTCTCAAT-3’；利塔夫前进：5‘-AGATGGAAGGGAATGAACC；利塔夫反向：5‘-GACGTGTCAATCATCTGG-3’；IL1β向前：5‘-GCATCAAGGGCTACAAGCTC-3’；IL1β-反向：5‘-CAGGCGGTAGAAGATGAAGC-3’；InFγ_前进：5‘-AGCCGCATCACAACATA-3’；InFγ_反向：5‘-TCCTTTTGAAACTCGGAGGA-3’；Ptgs 2向前：5‘-ACCATTTTTCAACCTTTGC-3’；Ptgs 2-反向：5‘-CCAGTTGCTCTCTCTCC-3’；GAPDH_前进：5‘-GACGTGCAGCAGACTA-3’；GAPDH-反向：5‘-CTTGGACTTTGCAGAGG-3’。用ΔΔCT方法计算褶皱改变的基因表达51和GAPDH作为内部控制。

荧光原地杂交(鱼)

C.香水在回肠组织中，使用了类似于先前描述的FISH分析来显示组织。47..简单地说，组织切片被分离，与鱼探针杂交，洗涤，用DAPI染色，用NikonTS2荧光显微镜系统成像。Cp85a18：5‘/Cy3/TGTTGAGATggcc-3’的FISH探针序列52被用来探测C.香水类似于上一次报告50..离体福尔马林固定5μ厚切片，室温下在溶菌酶(300 000单位/ml溶菌酶；Sigma-Aldrich)缓冲液(25 mm Tris pH7.5，10 mm EDTA，585 mm蔗糖，0.3 mg/ml牛磺胆酸钠)中孵育15 min，在46°C下与寡核苷酸探针(30%甲酰胺、0.9 M氯化钠、20 mM Tris 7.5和0.01%十二烷基硫酸钠溶液中5 ng/μl的最后浓度)进行杂交。组织切片在48°C(0.9 M NaCl，20 mm Tris pH7.2，0.1%SDS，20%甲酰胺，10%葡聚糖硫酸盐)中洗涤20 min，在蒸馏水中洗涤10s。切片用DAPI染色2 min，室温干燥，用50%甘油固定。C.香水在肠道组织中，用NikonTS2荧光显微镜显示，并在结果部分提供了每种治疗的有代表性的图像。

C.香水-利用原代脾细胞诱导炎症反应

脾细胞的分离与前面描述的相似。53..将鸡脾切除后，用结霜玻璃片将其均匀化成脾细胞，并加入含2%胎牛血清、2mm L-谷氨酰胺、50 mm2巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。经溶化红细胞后，收集到的细胞在2×10的条件下被镀。6细胞/井在6井板。细胞经1.2mm阿司匹林预处理45 min。然后用小鼠INFγ(1μg/ml，Pepro Tech)、鸡INFγ(1μg/ml、IBI科学)或C.香水(多重感染100)。细胞在细胞因子或细胞因子作用2或4小时后在TRIzol(Invitrogen)中进行RNA分离。C.香水分别治疗。

膳食阿斯匹林抗NE

饲喂0和0.12g/kg阿司匹林的鸟类，按上述方法饲养、感染并取样。收集回肠组织病理学图像和评分。采用原位末端标记法(TUNEL)对鸟类回肠切片进行细胞死亡评估，并对凋亡细胞进行定量分析。还测量了阿司匹林对体重增加的影响。

统计分析

为离体胆汁酸C.香水生长、数据先用单因素方差分析进行显着性差异分析，然后用Prism 5.0软件进行Bonferroni多重比较检验。对于其他数据，使用非参数Mann-Whitney对处理之间的差异进行了两两分析。U使用Prism 5.0软件进行测试。结果部分和图表中显示了具体的两两比较。样本(个别鸟类或细胞水井)的体重，组织学和其他测试的数量列在各自的亚切片的方法部分。在所示平均值的处理±标准差中，以样品的平均值表示值。实验被认为具有统计学意义P其值均<0.05。

道德操守认可和参与的同意

所有的动物协议都得到了阿肯色州大学费耶特维尔分校动物保护和使用委员会的批准。

结果

DCA防止C. 离体喷射器生长

根据以前的发现和目前的知识状况，我们推断DCA可以防止C.香水增长。为了检验这个假设，离体进行了抑制实验，其中C.香水在厌氧条件下，在TSB中接种巯基乙酸钠。TSB还添加不同浓度的胆汁酸，包括共轭原胆汁酸TCA、原胆汁酸CA和次生胆汁酸DCA。结果表明，DCA抑制。C.香水0.1%(−33.8%)和0.5mm(−82.8%，清肉汤)与对照比较，Tca(−16.4%)和CA(−8.2%)对细菌生长(混浊肉汤)均无明显的抑制作用(如图0.2)。1A)。然后，我们检查了其他次级胆汁酸是否也是抑菌作用在TSB。有趣的是，C.香水石胆酸(LCA；−22.6和−23.8%)和熊去氧胆酸(UDCA；−10.0和−25.3%)分别在0.2和1mm时抑制生长。1B)，与DCA相比，效果要差得多。

DCA预防去甲肾上腺素引起的鸡回肠炎症反应

进一步探讨DCA是否降低了球虫E.Maxima-和C.香水-诱导雏鸡去甲肾上腺素，饲喂CA或DCA饲料。因为球虫病和NE会引起严重的肠道炎症7,8研究了DCA对鸡去甲肾上腺素(NE)的影响。取上回肠组织为瑞士卷，经H&E染色后进行组织病理学分析。值得注意的是，E.Maxima(Em)感染引起严重的肠道炎症(ILeitis)，如免疫细胞浸润(黄色箭头)进入固有层，隐窝增生和轻度绒毛高度缩短与未感染的鸟类(图一)。2A)。Ne鸟的肠系膜坏死、融合(绿箭)、大量免疫细胞浸润、绒毛明显变短等表现为严重的肠系膜炎。相反，DCA饮食显着地减轻NE所致的髓炎和组织病理学评分(如图所示)。2B)而CA饮食也能降低NE所致的髓炎和组织病理学评分。

DCA抑制NE诱导的肠细胞坏死和凋亡

因为炎症常常导致细胞死亡54在此基础上，研究细胞死亡是否与DCA抑制NE诱导的葡萄膜炎有关.由于难以在鸡组织学切片中找到可靠的检测细胞凋亡或坏死的抗体，我们首先采用了高倍镜下的经典组织学分析方法。健康对照鸟绒毛上皮细胞核(深蓝色)分布在基底膜附近(黄色破折线右侧，图)。3A左下角)。Em和NE禽类炎症绒毛上皮细胞的细胞核则从基底膜向顶端膜分散，表明这些鸟类绒毛上皮细胞死亡。与此形成对照的是，DCA饮食可防止上皮细胞核向根尖侧移位，提示细胞死亡减少。为了进一步研究绒毛细胞死亡，采用TUNEL法检测细胞凋亡的后期。与组织病理学结果一致的是，球虫病和NE诱导的绒毛固有层散在(Em)或浓缩(NE)凋亡细胞(绿点)在DCA处理的鸟体内细胞凋亡减弱(图1)。3B)。用ImageJ计数凋亡细胞(TUNEL，Green)和总细胞(DAPI，蓝色)。与组织病理学结果一致的是，DCA降低了NE诱导的细胞凋亡。3C).

DCA减少C.香水侵袭、NE诱导的炎症反应和生产力丧失

给予DCA抑制C.香水生长离体，这是合乎逻辑的，DCA也可能减少C.香水去甲鸟肠道过度生长。为了检验这种可能性，C.香水采用实时聚合酶链反应(PCR)技术测定肠腔内的定植水平。C.香水16S rDNA。令人惊讶的是回肠腔C.香水DCA鸟类的定殖率与NE对照无显着性差异(图5)。4A)，而两组鸟类的组织病理学有明显差异。推测NE发病的主要驱动因素是病原侵入组织，而非病原菌的腔内定植水平。为了确定细菌入侵的程度，我们分离了回肠组织中的总DNA。C.香水用实时PCR法测定。DCA衰减率超过95%C.香水侵入回肠组织(见图)。4B)。为了更好地了解细菌组织的侵袭分布，我们使用了荧光技术。原地杂交(鱼)技术我们发现C.香水在NE对照鸟类发炎的绒毛和隐窝固有层中存在较深的细菌，在DCA鸟类回肠组织中几乎不能检测到该细菌(见图)。4C)。因为DCA减少了C.香水采用实时PCR技术，观察DCA对回肠组织中多种促炎介质的影响。C.香水诱导性炎症InFγ, 利塔夫(肿瘤坏死因子α)，以及MMP 9鸡回肠组织中mRNA的积累，DCA饲喂鸡的影响分别为51%、82%和93%。4D).

体重(BW)是肉鸡生产性能的重要指标之一，反映了肉鸡去甲期间的集体反应。生产力结果表明，与饲喂对照日粮(开放式、倾斜线和点状条形)相比，0~18日龄时，DCA(实心黑栏)而非CA(垂直线栏)日粮促进了鸟类的日增重。5)。体重增益在受感染的鸟类中减少E.Maxima(Em)(倾斜线和斑点条)在18-23天(球虫病阶段)相比，非感染鸟类(开放酒吧)。后继C.香水感染降低了23~26日龄(NE期)雏鸟的NE对照(虚线)体重增长(NE期)，而Em鸟类(倾斜线期)体重增加。与组织病理学分析相一致的是，与去甲肾上腺素对照相比，DCA可防止球虫病和NE期生产力的丧失。有趣的是，与去甲肾上腺素对照相比，原胆汁酸CA饲料可减轻NE期的体重下降，但在球虫病期则不起作用。

COX抑制剂阿司匹林C.香水脾细胞炎症反应

炎症事件形成肠道疾病，以炎症反应为靶点可减缓疾病的进展，如炎症性肠病。55和弯曲菌病53..为了研究宿主炎症反应在去甲肾上腺素诱导的肠系膜炎中的作用，我们使用了鸡脾细胞原代培养系统，类似于以前的报道。47..从鸡体内分离出的脾细胞被感染。C.香水(MOI 100)持续4小时。结果表明：C.香水炎症介质增加InFγ, 利塔夫 (肿瘤坏死因子α), MMP 9和Ptgs 2(蛋白COX-2)mRNA的积累分别是未感染脾细胞的1.54倍、1.69倍、1.72倍和8.65倍。6A)。因为cox-2是炎症反应的重要介质。32，考克斯抑制剂阿司匹林被用于C.香水-感染鸡脾细胞。有趣的是，阿司匹林没有减少C.香水-诱导炎症基因表达(数据未显示)。然后我们推断出考克斯信号的作用C.香水-诱导炎性细胞因子。用重组鸡的炎症细胞因子INFγ(ch-INFγ)在阿司匹林存在下刺激脾细胞。阿司匹林降低c-INFγ诱导的炎症基因表达InFγ, 利塔夫 (肿瘤坏死因子α)，以及MMP 9分别为44%、45%和65%。6B)。由于未发现鸡肿瘤坏死因子α，故采用小鼠INFγ(mINFγ)和mtnfα。阿司匹林还能降低小鼠INFγ(mINFγ)诱导的炎症基因的表达。InFγ, 利塔夫，和MMP 9分别减少41%、27%和45%。7A)。同样，阿司匹林可降低mtnfα诱导的炎症基因的表达。InFγ, 利塔夫，和MMP 9分别减少49%、53%和27%。7b)。这些数据表明C.香水诱导炎性细胞因子和COX-2，同时阻断考克斯信号传导，减少炎症细胞因子诱导的反应，提示阿司匹林对去甲肾上腺素有害的炎症反应具有保护作用。

阿司匹林可减轻去甲肾上腺素引起的小肠炎、肠道细胞凋亡和生产力损失。

为了从功能上评价阿司匹林对去甲肾上腺素诱导的小肠炎的保护作用，肉鸡饲喂阿司匹林饲料(ASP)。E.Maxima和C.香水如前所述。取回肠组织进行组织病理学分析。NE鸟回肠坏死严重，免疫细胞浸润，绒毛变短(见图)。8A)。值得注意的是，ASP可减轻NE所致的肠道炎症和组织病理学评分(如图所示)。8A，B)。在细胞水平上，ASP可降低NE诱导的绒毛固有层免疫细胞凋亡。8C，D)。在生长性能上，在0-18日龄时，ASP鸟类的生长速度比对照的要慢(见图)。9)。这是因为阿司匹林能抑制所有的COX异构体，而COX-1和-3对肠道内稳态和生长都很重要。在23~26日龄的NE阶段，ASP可使NE诱导的体重损失减少60%，而在18~23日龄的球虫期，ASP与NE的损失无显着性差异(P>0.05)。

讨论

尽管NE在无抗菌素时代已重新成为世界范围内流行的一种鸡疾病。5缺乏对去甲肾上腺素的全面分子机制的了解，严重阻碍了抗菌药物的开发以控制本病。56..多种毒力因子艾美耳球虫和C.香水在鸡肉生产中，对去甲肾上腺素的控制效果不明显。9,57提示NE发病过程中的重要分子/因素被忽视，如微生物群和宿主反应等。我们报道了微生物代谢产物DCA通过减少鸡炎症性Cox信号通路来抑制鸡NE。这些新发现为探索新的抗菌药物控制方法提供了途径。C.香水-诱发疾病。

控制微生物及其代谢产物防治传染病是一个相对较新的概念。粪便移植在几十年前就被用于预防婴儿S.感染14..微生物群在人类易感性中起着重要作用。艰难梭菌感染58..厌氧菌C.镰刀-转化的二级胆汁酸防止艰难梭菌发芽生长16..LCA和DCA对胆汁酸CA的抑制作用艰难梭菌蔬菜生长与毒素生产16,59..然而，二次胆汁酸是预防还是治疗？艰难梭菌人类或动物模型中的感染尚不清楚。最近发现口服灌胃DCAC.空肠无菌小鼠肠道炎症20..基于这些知识，我们推断DCA可以防止E.Maxima-和C.香水-诱导鸡去甲肾上腺素。事实上，膳食DCA可以防止NE及其相关生产力的丧失。肠系膜炎的减少与减少是同时发生的。C.香水肠道组织浸润，肠道炎症和细胞死亡。有趣的是，DCA没有减少C.香水回肠腔内定植，提示DCA的作用机制与肠道腔内定植排斥无关，可能是通过调节炎症等其他因素。

在细胞水平上，去甲肾上腺素所致鸟类的肠道表现为严重的小肠炎症，表现为大量免疫细胞浸润固有层，绒毛破裂，隐窝增生。60,61..炎症常导致细胞死亡。54..正常肠上皮细胞具有极性62它们的核位于基底膜上63，而应激性死亡(凋亡或坏死)细胞则失去极性。64它们的细胞核从基膜向顶端膜扩散65..肠道炎症对于清除入侵的微生物和解决炎症也是至关重要的，而过度的炎症会导致更多的细菌入侵和进一步的附带损害和炎症。66..感染细菌经常劫持炎症途径，以获得生存和入侵优势。例如,沙门氏菌香豆素在小鼠肠道引起广泛的炎症，并在炎症上茁壮成长。67..有趣的是，S..胎粪感染对新生鸡淋巴细胞耗竭的免疫抑制作用68..不像S..初生鸡伤寒菌感染、球虫感染引起鸡的强免疫反应和肠道炎症22,23..此外，在目前的研究中，NE鸟类比Em鸟类更容易发生肠道炎症。与“过度炎症”模型相一致的是，严重肠道炎症的NE鸟表现出广泛的免疫细胞浸润，炎症细胞因子基因表达增加，上皮细胞增生和死亡(细胞核分散和凋亡)。相反，DCA可减轻肠道炎症和炎性细胞因子，改善其生长性能，减少NE的病理改变。与抗炎降NE的理论一致，阿司匹林阻断炎症性COX-2信号通路可减轻肠道炎症、绒毛细胞凋亡和NE诱导的BW丢失。这些结果表明，DCA通过减少炎症信号通路来减弱NE。

不同菌株C.香水产生多种毒素，包括α(CPA)、β(CPB)、epsilon(Etx)、iota(Itx)、肠毒素(Cpe)、坏死性肠炎B样毒素(Netb)等。69..其中，研究人员报道了NetB而非CPA诱导雏鸡去甲肾上腺素。70..然而，NE与NetB阳性没有很强的相关性C.香水在美国71..在我们的NE模型中，NetB健康对照组和NE鸟类回肠消化的基因表达(数据未显示)表明毒素的作用有限。一般来说，C.香水在细胞外钙内流作用下，毒素可诱导细胞凋亡、坏死、死亡和下垂。69..高钙饲料可提高鸡死亡率，降低球虫诱导的去甲肾上腺素模型的生长性能。72提示毒素诱导和钙介导的NE细胞死亡的重要作用。DCA和阿司匹林可减少肠道细胞死亡，提示我们的NE模型可能与毒素有关。今后的工作C.香水毒素，DCA和炎症反应将进行。

与近年来研究中积累的胆汁酸对抗传染性肠炎的证据形成对照。16,20，微生物产生的代谢产物长期以来一直与慢性疾病有关。18..血浆胆汁酸与肥胖患者体重指数增高相关73..2型糖尿病患者血浆去氧胆酸、CA和DCA浓度高于正常人。74..胆汁酸促进脂肪酸的消化吸收可能在疾病发生中起重要作用。此外，食用高脂肪饮食的人结肠中的DCA和LCA含量也会增加。75..粪便中两种胆汁酸的增加与结直肠癌的发病率升高有关。76..DCA氧化损伤基因组DNA77缺乏碱基切除修复氧化DNA损伤与增加小鼠肠道肿瘤的风险有关。78..未来的工作是需要研究DCA如何诱导慢性疾病，但减轻感染性肠炎。

这些数据表明，微生物代谢产物次生胆汁酸DCA通过减少NE诱导的宿主炎症反应而减弱NE。这些发现突出了阐明感染性病原体、微生物群和宿主反应之间的分子关系的重要性。这些发现可用于控制NE和其他肠道疾病，以微生物群和宿主炎症反应为靶点。