血液吸附法提取内皮损伤介质的生物测定 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

血液吸附装置是用来治疗感染性休克，通过吸附炎性细胞因子和尚未完全确定的危险和病原体相关的分子模式。在理想情况下，血液吸附可使微血管内皮细胞(MEC)功能立即恢复，并能迅速从儿茶酚胺依赖和脓毒性休克中恢复。我们测试了一个装置，该装置由直径为450μm的聚苯乙烯-二乙烯基苯核心粒子组成，对疏水化合物具有很高的亲和力。目前的研究旨在证明内皮特异性损伤介质被吸附并可从血液吸附装置中恢复的概念。由于具有良好的临床经验，我们在一种新的内皮生物分析中测试了血液吸附剂释放的蛋白质组分。对MEC增殖和细胞死亡的视频、长期成像进行评估，并结合细胞凋亡和ATP的测定。在柱分离法回收的39个组分中，我们鉴定出3个组分(1)抑制MEC增殖；(2)增加细胞死亡；(3)诱导MEC凋亡。在MEC中加入这3种组分，可降低其ATP含量。这些组分含有约15 kDa的蛋白质和大量的核酸，至少部分被氧化。血液吸附对内皮细胞损伤的预防作用可以通过一种新的内皮生物分析和长期的视频观察程序来解决。在分子水平上研究和确定内皮损伤配体是可行的。结果表明，循环中的核酸与一种尚未确定的蛋白质结合在一起会产生显著的影响，这可能是当病人经历脓毒性休克时炎症恶化的主要危险相关分子模式(湿气)。因此，血液吸附装置可以通过核酸聚集体的结合来限制内皮损伤，从而促进内皮屏障功能的改善。

导言

迄今为止，脓毒性休克病理的复杂性可能解释了为什么针对特定介质的治疗方法基本上失败了。定义感染性休克的标准包括器官功能障碍。1..重要器官功能恶化的原因之一是内皮细胞失去屏障功能。2..在一组创新的治疗方案中，血液净化疗法是维持屏障功能的有希望的策略。3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22..为了验证血液过滤和吸附的有效性，应选择生物测定内皮细胞完整性作为读出参数。

在细胞水平上，活化的白细胞与内皮衬里细胞的免疫相互作用引导促炎症表型，这种表型与弥散性凝血和破坏内皮屏障有关。内皮屏障是生命器官适当的氧气和营养供应的关键，Opal对此进行了评述。等人.23..因此，当宿主的免疫系统试图对抗入侵的病原体时，大量的附带损伤将导致内皮细胞和上皮细胞的屏障功能受损。有趣的是，破坏组织的损伤反应与病原体相关的炎症反应大致相同。24..有充分的证据表明，器官损伤需要一个中介小组，组织再生和重建也是如此。因此，这可能是许多败血症和脓毒性休克临床试验失败的原因之一。23.

尽管这种复杂的分子网络可能导致脓毒症和脓毒性休克中的器官衰竭，但我们试图通过细胞索布吸附法识别在没有白细胞的情况下导致内皮损伤的蛋白质组分。由于缺乏有效的血液吸附方法在脓毒性休克中的临床证据，仅限于病例报告、病例系列和小规模研究，以及需要开展更大规模的对照临床试验。22..实验证据也很少，例如大卫的工作。等人.，用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和败血症血清孵育显示HUVECs细胞层被破坏，而血液吸附后的血清样本对HUVECs无不良影响。8..Gruda和他的同事的研究表明，CytoSorb治疗不仅可以去除细胞因子，还可以消除危险和病原体相关的分子模式(DAMP，PAMPs)，这可能解释了这种治疗方案的显著优势。10..他们的结果离体表明不仅细胞因子，而且阻尼和PAMPs，需要去除，以改善临床结果。疏水性和分子量依赖的筛分功能可能是临床成功治疗的关键。尽管多个介质可能参与了脓毒性休克的病理过程，分子量在10-60 kDa之间，这可能解释了这种血液吸附装置解决脓毒性休克的实验和临床证据。7,9,25我们探讨了根据其影响内皮细胞活力的能力来鉴定和富集所定义的蛋白质组分。

我们去除了吸附在CytoSorb珠上的蛋白质，并对洗脱液进行蛋白质分馏。利用微血管内皮细胞(MEC)，从每个单个细胞中分离得到39个蛋白质组分，并进行适当的生物测定。以单个吸附剂的蛋白质组分为例，研究了其对脑源性内皮细胞增殖、死亡、凋亡和三磷酸腺苷(ATP)含量的影响。这些程序确定了导致内皮损伤的三个组分，而其余的组分基本上是不活跃的。活性组分似乎含有一个特定的蛋白质实体以及被部分氧化的核酸。活性组分现在已经准备好进一步的定性，将病人分成几组，这可能会从血液吸附疗法中受益。

病人、材料和方法

血液吸附细胞索布治疗的临床观察

患者根据我们的重症监护病房(ICU)G1的血液吸附过程指示，使用CytoSorb进行治疗。根据赫尔辛基宣言和乌尔姆大学伦理委员会批准的第150/16号伦理投票，对患者的免疫表型和血浆生物标志物进行分析，并对吸附在CytoSorb柱上的物质进行生化分析，并在患者和志愿者知情的书面同意下收集所有样本。

研究设计如下：患者在脓毒症发病后48小时内进入ICU，并出现血浆白细胞介素-6(IL)-6浓度(>500 pg/ml)和/或肾功能衰竭。当一名病人被登记并计划接受细胞吸附疗法治疗时，在治疗前取一份血样。在治疗过程中，常规检查感染标志物。经过24小时的治疗后，又取了一份血样。CytoSorb吸附盒已立即加工(见下文)。细胞吸附治疗前后进行细胞因子测定和白细胞抗原表达分析。

我们在此报告了一位76岁女性患者经Crawford通路和夹闭内脏和肾动脉手术治疗腹部动脉瘤的生化准备。Singer和他的同事(2016年)诊断脓毒症是由于术后第3天出现了儿茶酚胺依赖的脓毒症休克、血流动力学和乳酸浓度>2mg/dl(儿茶酚胺为0.4g/kg体重(BW)/min，乳酸为4.9 mg/dl)，炎症指标显著升高，包括C-反应蛋白(CRP)：307.6 mg/l；原降钙素(PCT)：5.68g/l；-6：4944 pg/ml；IL-8：308 pg/ml；乳酸脱氢酶(266 U/l)。患者经CytoSorb治疗后，儿茶酚胺用量降至0.05g/kgBW/min，大部分炎症指标下降，包括C反应蛋白(235.5 mg/l)、PCT(4.3mg/l)、IL-6(107.4 pg/ml)和IL-8(63.6pg/ml)，乳酸(5.2g/l)仍在升高。下面的流程图总结了细胞吸附法的临床和实验过程以及实验的建立。

图中的流程图。1描述为我们的临床研究所执行的ICU血液吸附的过程说明，以确定血液吸附所去除的中介物，以及病人的潜在改善。

内皮生物测定

用大鼠胚胎脑组织培养建立微血管内皮细胞(MEC)。在自发转化后，我们克隆了MEC，每一个克隆都有一些形态上的差异，但没有表型上的差异。有一个克隆，称为C2-6，建立了卵石形态的汇合细胞层和自发形成的血管样结构(补充视频)。V1)。在合适的肿瘤模型中，母细胞C2曾被证明能促进胶质母细胞瘤的血管形成。26..C2-6 MEC表达典型的表面标记，包括[医]欧比乌克斯凝集素>30%，DIL-AC-LDL>70%，EN 7/44(内皮和增殖标记物)>80%，因子VIIIa>40%.该MEC细胞对白血病抑制因子(LIF)、生长抑素M(OSM)、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)以及星形胶质细胞上清液均有明显的促增殖作用。星形胶质细胞条件培养液也能诱导CD 36的表达(数据未显示)。p2的亲本克隆，以前曾用于研究lps诱导的细胞死亡。27.

细胞在添加25 mM HEPES、抗生素、10%胎牛血清(FCS优越、极低内毒素(Biochrom.de，德国)和GlutaMAX(美国热渔业网)37°C和5%CO的RPMI 1640中培养。2..当细胞汇合时，用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)分离细胞，并在新瓶中播种。

细胞吸附柱经处理和分馏制备的研究

按照制造商的指示，按照患者的指示，用含0.005%EDTA的磷酸盐缓冲盐水(Pbs)清洗细胞内的血液成分和非吸附的血浆蛋白，直到缓冲液流出明显清澈，并在药盒中没有任何血液成分。详情和图片见附图。沙一..扫描电镜用于测定与细胞吸附珠表面结合的残余蛋白质聚集物和细胞成分(附图)。S2，请注意，治疗后单个珠子上有自由空间)。对吸附在细胞吸附粒上的蛋白质材料进行了加工。本研究显示了一名76岁女性患者的蛋白质分离结果。用50%乙腈在水中分离蛋白，1/10稀释清提取液，然后进行超滤(截留：30 kDa)去除白蛋白。经层析，蛋白质经冻干后再悬浮于2ml(1%三氟乙酸)再悬浮液中。2H中含有80%乙腈和0.1%三氟乙酸的O和5%缓冲液2然后离心10分钟，每分钟4，200转。收集上清液，过滤灭菌，孔径为0.22m。采用高效液相色谱法，流速为1.3ml/min，5 min后开始收集蛋白质，共40 min。这一分离产生了39个蛋白质组分，在新建立的MEC生物测定中进行进一步测试(见附图)。S3).

基于IncuCyteZOOM的视频显微镜和MEC生物检测

显微成像

长期显微镜成像研究，孵化器显微镜IncuCyteZOOM(美国缝匠网)安装在37°C，5%CO。2和百分之百的湿度。在1.5×10的条件下播种C2-6 MEC。4每井细胞进入透明，平底96井板(热裂变材料)在100升RPMI加10%的FCS，Glutamax和抗生素。在12小时内将MEC附着在平板上，显示出良好的形貌，加入试验化合物。1-同型半胱氨酸(Hcy)(Sigmaaldrich.com)在pH为8的50 mm Tris缓冲液中用2倍量的二硫苏糖醇在37℃下作用30 min，作为MEC特异性损伤反应的阳性对照。细胞死亡监测采用碘化丙啶(PI)摄取法(加入终浓度2g/ml)，采用红色荧光滤光片，采集时间为800 ms。用IncuCyteZOOM软件记录相对比图像以确定增殖率.

ATP定量

为了测定细胞质中ATP的含量，将96孔培养的贴壁细胞胰蛋白酶化后再悬浮到90 l中，转移到白色化学发光板中，37°C下5%CO孵育。2确保均匀的细胞层形成。用PBS缓冲液对分离自CytoSorb盒的材料的冻干组分进行重组，其中10μ1加入到最终体积为100μl的96孔中，用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(promega.com)测定其浓度。用Glomax仪器(promega.com)在不同的时间间隔内检测到发光。

Annexin V染色

为检测细胞凋亡和下垂，采用经恒西微修改的方法进行AnnexinV和PI染色。等人.28.

内皮细胞(2×10)5(每毫升)播种3.5cm∅培养皿(热渔网)作为内皮细胞损伤的阳性对照，加入1mm的Hcy(10μg/ml)。细胞分离率为10%(v/v)。

培养24h后，收集贴壁和漂浮的MEC，进行AnnexinV和PI染色，并进行流式细胞分析。最终细胞数为5×104每种培养条件下记录细胞数。

扫描电镜

内皮细胞克隆C2-6接种于玻璃片上，用2.5%戊二醛(Sigma.com)固定，用临界点干燥冲洗脱水。标本经碳/金飞溅处理，日立扫描显微镜在10 keV下显微镜观察。

数据分析

通过对IncuCyteZOOM数据文件的统计分析，使用GraphPad Prism，vs.7进行了双向方差分析.P<0.05及<0.05，差异有统计学意义(P<0.05)。对流式细胞术数据进行定量评价时，使用FlowJovs直方图。

结果

细胞索布衍生蛋白质组分的融合与细胞死亡

我们从细胞吸附物中鉴定出蛋白质组分，对脑源性MEC的活力和增殖有显著的影响。为此，我们使用了一种新建立的生物测定方法，对脓毒症和脓毒性休克中参与受影响器官内皮损伤的介质具有高度的敏感性。图形2连续、每小时观察和测定60h后，显示F1-F39蛋白组分对内皮细胞增殖的影响。F10-F12高度活跃于内皮细胞汇合的下调(图1)。2A)以及内皮细胞死亡(图一)。2B)超过60小时的总时间。在24小时(p<0.001)、10 h(p<0.0001)、25~28小时和35~39小时(P<0.001)时，未处理组与细胞组分生长曲线(p<0.001)存在差异(P<0.05)(详见附图)。S4).

此外，F24在早期时间点(蓝色柱，13~22h后)对细胞增殖有一定的影响。2A其他时间点(40小时、60小时)的汇合度没有显著差异(详见补充资料)。无花果。S4).

视频显微镜也被用来确定细胞在细胞索布衍生蛋白质组分存在和不存在的情况下的死亡。一般情况下，自发内皮细胞死亡水平为8%(每幅图像为30-50个细胞).F10、F11和F12组分60h后细胞死亡率分别为29%、20%和14%(p<0.0001，p<0.01)。F10-F12存在的第一个时间点在观察16h时有显着性差异(p<0.05)。在整个实验过程中，F24组分和其余蛋白质组分均未诱导细胞死亡。与未处理对照组相比，细胞索布组分在32小时(F10)、16小时(F11)和30小时(F12)均有明显差异(p<0.05)。F10和F11的差异有显着性(P<0.0001.0 1)，F12 P<0.0 1，经多元比较、双向方差分析(ANOVA)计算，从第一次统计显着性到观测终点均有显着性差异。这些结果提示，未知内皮损伤因子的浓度在F11中可能最高。注意，F24对细胞活力和汇合性的影响相对较小(图1)。2)。这一事实可能提示F24与F10-F12不同的病理生理学。

综上所述，四种不同的蛋白质组分(F10-F12，F24)对MEC的增殖有明显的抑制作用。其余各组分对MEC的增殖无影响，也不增加细胞死亡。对另外两名患者的血液吸附材料进行了同样的处理，其中一名患者受益于CytoSorb治疗(数据未显示)。应答患者共获得46个蛋白质组分，其中F26-F27对MEC增殖有抑制作用，细胞死亡增加。相反，从无反应病人的血液吸附材料中获得的44个蛋白质组分中没有一个影响MEC的汇合或存活(数据未显示)。这些差异的原因可能与柱分馏的个别洗脱剖面有关，有待进一步调查。

凋亡检测

流式细胞术检测AnnexinV结合和PI染色，探讨凋亡诱导的细胞死亡。根据图中的结果。3与未处理的MEC中8%(6.7%-9.6%)的Annexin V阳性细胞相比，红色组分显示Annexin V结合增强。与CytoSorb组分孵育24h后，F7(18.3%)、F11(25.8%)和F35(20.3%)的MEC凋亡率分别增加18.3%、25.8%和20.3%。参照MEC活力测定法，F11(图1)。2如AnnexinV结合增加所证实的那样，有可能诱导细胞凋亡(如图1所示)。3)。此外，F7和F35组分也能诱导AnnexinV结合增强(图5)。3)，但对MEC活力无影响(图1)。2)。其余各组分孵育24小时后，未诱导AnnexinV与MEC结合。总之，F10-F12直接影响细胞存活率，F11通过诱导细胞凋亡而影响细胞活力，F7和F35诱导AnnexinV结合，但无细胞死亡。2)。由于hcy对mec活力的不利影响，因此在我们的实验中，hcy的降低起到了积极的控制作用。29,30,31,32,33.

同型半胱氨酸介导的MEC细胞凋亡

图形4用长期视频显微镜观察外源性Hcy对MEC的影响.细胞死亡表现为红体计数0.5mm和1mm降低Hcy，培养27h和26h后细胞死亡显著(多重比较双向方差分析，p<0.0001)。与细胞吸附组分的影响不同，经Hcy处理的MEC在30小时后恢复，形成U形曲线的汇合测量结果(图1)。4A)。为了进一步研究Hcy的影响，我们对本构和Hcy处理的MEC进行了扫描电镜观察。5)。未处理的MEC表面基本光滑，而Hcy处理的MEC在其表面表现出微绒毛的延伸形成，此外汇合受损并显著影响细胞与细胞的接触。

蛋白质组分对ATP含量的影响

为了确定对代谢的潜在影响，我们测试了细胞索布衍生蛋白质组分对ATP含量的影响。与所有蛋白质组分孵育6小时和20小时后，测定MEC中ATP含量(如图所示)。6)。6小时后，我们发现当用F2，F5，F6，F7，F8，F25或F39处理MEC时，ATP水平有所升高。5A-C但这种ATP的增加并不反映为增殖增加(Cf)。无花果。2)。20h后，我们发现F8，F9，F11和F14共孵育实验中ATP含量显著降低(图1)。6d-f)。此外，F24降低了ATP含量，但与未处理的MEC对照培养相比差异不显著(P<0.05)。6)。在孵育6小时或向下调节ATP含量趋势不同的组分由柱的蓝色边线标记，而持续损害ATP含量的组分被红边柱标记(即F10-F12，F24)。

血液吸附蛋白组分中的湿配体

通过定量测定包括白蛋白在内的蛋白质组分含量，以及循环核酸/氧化DNA和高级糖基化终产物(AGEs)对细胞信号转导的贡献进行了研究。所有这些材料都可能直接或次要地吸附到细胞的珠表面，因为它们可能与细胞外小泡、血小板和/或凝血产物的脂质双层有亲和力，我们也发现它们附着在细胞囊泡表面(补充)。无花果。S2)。如附图所示。S3白蛋白含量以F19-F24组分最高。7A)。用NanoDrop辅助光谱法测定的高DNA含量限制在F11-F15和F19-F22，范围为1000~4000 ng/ml。7b)。对F11-F22、F24和F39组分进行了氧化核苷酸(特别是8-氧鸟嘌呤残基)的ELISA测定。氧化核苷酸的浓度约为10。−5与总DNA相比，强度较低(见图)。7b，插入图)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测与年龄特异性抗体结合的分子实体家族，所有组分均呈阳性，在F11-F20之间最高，F14最高(0.95μg/ml；图1)。7C)。这些结果是由鉴定聚集体可染色，并呈现特征的形态特征，通过透射电镜确定(补充图)。S5)。进一步研究吸附到CytoSorb过滤器上的蛋白质需要通过阵列格式的分析，包括质谱(Orbitrapb，数据分析正在进行中)。因此，我们在F10、F11和F12中发现了与囊泡转运、凝血和组蛋白修饰相关的蛋白质。在F10-F12中，我们发现与血红蛋白片段有关的肽，而F24中最丰富的肽是伤口愈合和内皮细胞凋亡过程中的元素，此外还有大量的α-1-酸性糖蛋白1和血清淀粉样蛋白A-1(SAA 1)(数据未显示)。所有这些结果都需要从附加的血液吸附柱中分离出的组分进行分析来证实。

总之，脓毒性休克患者细胞吸附物分离后的分子实体对MEC汇合性、细胞层完整性、增殖、ATP含量、MEC凋亡有重要影响。这些特点可能有助于脓毒性休克患者灌注不足和器官衰竭的临床观察。

讨论

脓毒性休克的一个主要病理原因是内皮细胞损伤，导致器官衰竭。Opal和van der Poll对与凝血因子有关的病理进行了较好的回顾。23..从本质上说，可溶性因子和活化的免疫细胞参与了凝血功能的改变，导致内皮通透性增加。威廉·艾尔德得出以下结论：“…很难确定一个单一的成分，它的治疗调制会使脓毒症级联短路，并改善结果。34“，我们的结果提供了进一步的证据，多个蛋白质实体参与不同的途径，以引起脓毒症相关的内皮功能障碍。体内在炎症环境中，白细胞与MEC的相互作用将产生额外的影响。正如一篇优秀的手稿所述，在脓毒性休克模型中，胞浆样受体4和tLR 3引导的非标准炎症体激活共同激活可能是减轻严重程度的靶点。35..其中一个原因是CytoSorb在24小时内大量减少儿茶酚胺治疗，对恢复内皮功能和抑制感染性休克有暴发性的有益作用。我们第一次讨论的炎症介质是通过CytoSorb治疗去除的，类似于以前。34炎症细胞因子(IL-6)和凝血因子的研究9,10，然后用经典的肽生物化学方法对吸附在CytoSorb柱上的蛋白质进行分馏。采用一种新的脑源性MEC生物测定法，采用了一种不带偏见的方法.利用IncuCyteZOOM装置对39个细胞源组分进行了长期视频显微镜检测.这种分析方法具有同时分析的优点。9,10细胞增殖、死亡与形态学36..F10-F12和F24蛋白组分对内皮细胞层的完整性和MEC活力、增殖、ATP含量和细胞死亡相关机制(包括凋亡)有重要影响。我们目前正试图从另外两名患者的血液吸附材料中鉴定影响MEC的个别蛋白质组分，以及从其他8个细胞-Sorb柱中聚合的蛋白质组分。这些结果将帮助我们确定影响MEC活力的蛋白质组分，并确定其含量(Cf)。无花果。7)。在未来的实验中，我们将重点研究F10-F12中发现的15 kDa蛋白质种类(附图)。S6).

以前，有几个体内用动物模型建立内皮细胞功能模型。37..在人类的环境中，内皮细胞功能障碍是无法轻易解决的。体内，但暗示是在实验性LPS剂量后发生的。4..使用离体培养的内皮细胞，功能特征更容易通过形态学和生化参数来解决。最常使用的是HUVEC。8..在这方面，大卫的一份高度相关的报告等人..用HUVEC显示细胞治疗前后血浆样本对内皮完整性的不利影响。8..然而，HUVEC模型依赖于外源生长因子的添加、来源和传代数，并且在建立可复制的检测格式方面受到限制。相比之下，永久性脑源性MEC更适合于重复性测试，如本报告所示。影响内皮功能的人类病理模型已由其他组用小鼠、大鼠和猪来源于微血管和大血管的内皮细胞来模拟。38,39,40..Gruda和他的同事对脓毒症相关的PAMP和湿分子的广泛吸附有利于炎症细胞因子和湿反应，包括高迁移率的高迁移率族蛋白B1(hmbg-1)、c5a和s100a8。10.

39个分离物的分离物(F10-F12和F24)对MEC的影响最大。F10-F12对细胞增殖的影响最大(图1)。2)。在假设涉及哪些因素时，我们认为血管内皮生长因子(VEGF)可能通过增加血管通透性发挥作用，而血管通透性是脓毒性休克中器官功能障碍的主要参数。41..血管通透性增加也可以在我们的模型中解决，因为这个参数与细胞死亡和MEC单层的形态学变化有关，这可能类似于Hcy在早期时间点确定的效应(图1)。5)。细胞凋亡分析离体细胞培养与细胞凋亡增加有关，以F10组分最为明显。因此，F10可能含有大量VEGF或某些尚未确定的血管通透性效应。然而，血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体协调的内皮细胞间的相互作用是非常复杂的，需要更详细的研究。42，该因子及其受体是否参与。一个重要的参数，以识别介体清除的细胞索布处理，包括我们的MEC测定的动力学观察。F10-F12组分需要与MEC孵育10小时以上才能显示其对细胞增殖的特殊影响(图1)。2A，b)，而F24则需要更长的时间(如图所示)。2C)。这些结果反对在MEC细胞损伤中产生高特异性效应，这也是考虑同型半胱氨酸的原因。当使用Hcy作为凋亡细胞死亡的阳性激活物时，在我们的生物分析中(如图所示)。3)29我们发现，Hcy对MEC增殖和诱导凋亡的负面影响不到15小时，而在Hcy处理15小时后，我们观察到MEC层的恢复(见图)。4)。目前尚不清楚MEC层损伤的同型半胱氨酸特异性动力学是否是同型半胱氨酸降解或内源性反调节效应所致。相反，与F10-F12共同孵育的MEC，在观察时间延长到60小时，似乎没有恢复。2A，b)。对MEC损伤的增殖和活力的长期影响也可以通过ATP含量的下降来解释(见图)。6)。ATP的减少是脓毒性休克的一个特征，并为复杂的I和IV呼吸受损提供了证据。43..然而，脓毒症和脓毒性休克患者白细胞中ATP含量的重要性仍有很大的讨论。43..此外，当内皮型一氧化氮合酶(ENOS)受损，诱导型一氧化氮合酶(INOS)被上调时，内皮细胞中电子传递链复合物的增加可能导致ATP的减少。44..同样，炎症刺激引起的eNOS和iNOS之间的失衡也是炎症微血管内皮细胞公认的生物标志物。34..SAA 1是最常见的急性期蛋白之一。据报道，SAA1可以与TLRs和RAGE相互作用。45，激活NFκB，促进细胞因子的产生46..在小鼠模型中，低SAA1通过减缓HMGB 1的释放来改善结果。45..SAA 1与内皮细胞的直接相互作用可诱导ROS的释放，并损害eNOS的活性。47..在动物脓毒症模型中，通过氧化应激和伴随的线粒体功能障碍，证实了衰老对炎症反应的选择性作用。48..这些参数，即氧化应激和线粒体功能紊乱，会导致内皮功能障碍，随后会导致器官功能障碍和脓毒症的高死亡率。48..我们的研究进一步证实了氧化和部分变性分子实体的潜在相关性。通过ELISA定量，我们发现了高水平的氧化DNA，在F11-F15中富集。7)。类似于所描述的细胞吸附血液的性质10，我们发现，潮湿的元素，包括年龄，在多个组分的细胞吸附血蛋白分离物。浓度最高的是F14-F20，而不是F10-F12或F24。阻尼的一个特性是退化。体内由于不溶性β片丰富的聚集体，如在F21和F36，其中染色的蛋白质-Stat染料(补充图)。S5)。重要的是，这些聚集物作为炎症体的强有力的激活剂，作为nacht、lrr和pyd结构域(nlrp-3)的触发因子，最终导致炎症相关的变性。49..然后，氧化DNA和AGEs都会与AGEs的受体RAGE结合，RAGE是一种在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞上高表达的蛋白质。50..RAGE与其配体的相互作用有望导致炎症体的大规模激活。50,51..这些过程可能最能解释形态学的变化和单层破坏，以及应力相关的微绒毛的形成(见图)。5)在我们的MEC中。十一等人..以前已经证明炎症小体的激活可能是由hcy引起的，同时也会导致内皮功能障碍。28.

总之，目前的工作描述了一种基于MEC的生物分析方法来研究血液中的介质，这些物质被细胞索布的血液吸附处理所有效地消除了，并且可以解释细胞索布治疗后脓毒性休克状态的快速解决。这些结果为可溶性血浆衍生因子对内皮细胞屏障功能和活力以及ATP含量的影响提供了证据。初步结果表明，凝血信号通路、囊泡转运和/或组蛋白修饰对不同的分子有不同的贡献，这些作用在血液吸附纯化的各个部位中被确认，从而损害了内皮细胞的存活能力。需要进一步努力解决最有害因素组合的分子性质。

结语

利用我们的MEC生物分析方法，细胞吸附结合的血液吸附化合物对MEC的有害影响已经在生化富集后被确认。这些化合物的部分特征是其氧化核酸和糖基化最终产物的含量。MEC层的功能损害有：(1)延迟增殖和汇合，这可能与组织修复减少有关；(2)细胞死亡和凋亡增加，与器官保护的直接缺陷有关；(3)细胞内ATP含量的变化，以解释内皮在细胞再集和白细胞相互作用中的各种功能失调。未来的计划将集中在亚分馏实验和分子鉴定2-3个主要组分具有最高的生物活性。该结果有望更好地表征细胞吸附法诱导的内皮损伤和临床缓解状态的分子和功能方面。