p38α缺失对小鼠急性肝细胞损伤的保护作用 急性使用四氯化碳(CCL) 4 )，广泛应用于模拟人肝脏对有毒化合物的反应的肝功能衰竭实验动物模型中。 26 ,27 ..CCL 4 是一种强的肝毒素，可导致活性氧的过度产生，膜的脂质过氧化，导致肝细胞死亡和炎症，导致严重的肝毒性。 28 ,29 ..保护肝细胞不受细胞凋亡、炎症和氧化应激的影响，是确保肝细胞损伤后有效组织修复的关键。 4 暴露。首先，为评价p38α在急性肝损伤中的活性，对照组小鼠单剂量注射ccl。 4 并在时程动力学过程中采集肝脏和血清。 1A )。单剂量CCL 4 通过对丙氨酸转氨酶(ALT)血浆中丙氨酸转氨酶(ALT)水平的测定，观察肝细胞溶解引起的肝损伤。 1B )。事实上，在注射ccl后的24小时和48小时(损伤期)，ALT水平开始升高。 4 在60和72小时(恢复期)逐渐下降(如图所示)。 1B )。在此背景下，我们研究了p38α磷酸化/激活在受损肝脏中的分布。用Westernblot方法检测p38α和Thr 180/Tyr 182磷酸化p38蛋白水平。 1C，d )。我们首先观察到p38α的表达在整个动力学过程中是稳定的。 1C )。第二，在静息肝脏(0H)，我们发现P-p38的信号较弱，而p38的磷酸化在ccl后逐渐增强。 4 暴露，伴随着在肝脏中观察到的组织损伤的增加(无花果) 1B 和 2B，c )并在40小时内到达一个平台，直到运动结束(如图所示)。 1C，d )。这些发现提示CCL介导的急性肝损伤。 4 暴露诱导p38α特异性激活。
图1 p38α在急性CCL时被激活 4 暴露。( a )CCL实验过程的原理图表示 4 对照组(CTR)注射。( b )CTR血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平在(0H)和(24H~72H)CCL前、后的平均水平。 4 暴露。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组6例)，*p<0.0 5，*p<0.0 1，*p<0.001(双尾t检验)。( c p38和p38α在ctr小鼠肝组织中的表达(0H)和(24H~72H)ccl后肝组织中p38和p38的表达。 4 暴露。HSC 70用作装载控制。车道显示来自独立生物复制的样本，并且是不连续的(黑线)。显示的图形被裁剪，原始图像是补充数据的一部分。( d P-p38与p38α蛋白水平在(0H)和(24H~72H)CCl前后的密度测定分析 4 注射。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥3/组)。*p<0.001.0 5，*p<0.0 1，*p<0.001(双尾t检验)。
图2 p38α消融对成熟肝细胞的保护作用 4 -肝损伤。( a )CCL实验过程的原理图表示 4 对照组小鼠注射及p38α ΔH 老鼠。( b )CTR和p38α肝脏组织切片的代表型苏木精和伊红(H&E)染色 ΔH CCL后不同时间点小鼠 4 注射。( c )用H&E染色CTR和p38α定量坏死面积 ΔH CCL术后指定时间点肝切片 4 注射。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组7例)，*p<0.0 5，*p<0.001.0 1(双尾t检验).丙氨酸转氨酶(ALT)在CTR和p38α中的平均水平 ΔH CCL术后指定时间点的血清样本 4 注射。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组6例)，*p<0.0 5(双尾t检验).( e，f )相对mRNA水平 胶原1α1 (e )和 胶原3α1 (f )定量PCR检测CTR和p38α。 ΔH CCL术后指定时间点肝标本 4 注射。基因表达水平被归一化为 18S 每个样本的mRNA。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组6例)，*p<0.0 5，*p<0.0 1(双尾t检验).
更好地描述p38α在ccl中的作用 4 p38α(p38α)的损伤、肝细胞特异性缺失 ΔH 通过携带条件性氧氟沙星p38α等位基因(p38α)的小鼠杂交获得。 fl/fl 30 在肝特异性转胸腺肽启动子(TTR-CRE)的控制下表达cre重组酶的转基因小鼠。 31 )。他莫昔芬饮食对p38α肝脏p38α表达的抑制作用 ΔH 虽然p38α在小鼠体内仍有表达，但由于非实质细胞的存在而未被TTR-CRE转基因(补充图所示)。 1A )。有趣的是，随后p38α肝特异性缺失(p38α) ΔH )在稳态条件下，我们没有观察到肝实质内有任何改变的迹象。从这些结果我们得出结论，p38α在成人肝细胞中的表达在稳态条件下并不是维持肝脏稳态的绝对必要条件。
p38α ΔH 小鼠及其各自的对照受到单个CCL的攻击。 4 注射并及时监测肝细胞溶解和肝损伤。 2A )。肝切片的h&E染色显示p38α的肝脏在24小时内已出现明显的坏死。 ΔH 和对照鼠(图1)。 2B，c ，补充图。 1B )。有趣的是，坏死面积逐渐增加，并在60小时后达到高峰。 4 ，使对照组小鼠肝脏在72小时内减少(图1)。 2B，c )。然而，尽管p38α的肝脏在40到48小时内仍有明显的坏死区域。 ΔH 与对照组相比，小鼠坏死强度明显降低(图1)。 2B，c )。相应地，p38α中的ALT水平 ΔH 在这些时间点，小鼠与对照组小鼠相比仍保持着严格的低水平(图一)。 二维空间 )。此外，用caspase-3裂解染色法检测了两组小鼠CCl后24、40和48h肝细胞凋亡情况。 4 治疗(附图) 1C )。我们的观察显示，细胞凋亡反应是连续于CCL的。 4 挑战在p38α中没有受损 ΔH 肝脏和不能解释在p38α相关的虚证环境下坏死面积和谷丙转氨酶水平的下降(补充图)。 1C，d )。排除差动CCL的可能性 4 生物活化可能与对照组和p38α之间肝损伤的变化有关。 ΔH 小鼠，检测主要CCL CYP2E1的mRNA水平。 4 -代谢酶。首先，两组小鼠在稳态条件下CYP2E1 mRNA水平均无差异(补充图)。 1E )。此外，与以前的报告一致 32 ,33 ，CCL 4 治疗后12~24小时CYP2E1 mRNA水平下降，表明CCL的代谢过程相同。 4 两组小鼠的化合物(附图)。 1E )。有趣的是，我们监测了胶原1α1(图1)。 2E )和3α1。 2F )mrna水平，我们发现p38α的肝脏在40小时有上调的趋势。 ΔH 小鼠与对照小鼠比较(图一)。 2E，f )，反映p38α缺乏症早期组织修复反应。这些发现提示p38α消融在成人肝细胞中既能减轻肝损伤，又有利于组织的恢复。
图3 p38α缺乏对急性损伤时肝细胞增殖无明显促进作用。( a )代表的BrdU免疫化学控制(CTR)和p38α ΔH CCL术后指定时间点肝组织 4 注射。( b )BrdU标记的CTR和p38α的定量分析 ΔH 肝脏切片(BrdU的百分比) + 肝细胞)。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组6例)，*p<0.0 5(双尾t检验).( c )代表型磷组蛋白H3(PHH 3)的ctrr和p38α的免疫化学 ΔH CCL术后指定时间点肝组织 4 注射。( d )PHH 3的定量分析 + 肝细胞G2期(左侧)和有丝分裂(右侧)在ctrr和p38α中的表达 ΔH 肝脏(PHH 3的组织学鉴别) + 肝细胞)。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组6例)。*p<0.05(双尾t检验)。( e )调节细胞周期进程的蛋白(Cyclin D1、A2和B1)在CTR和p38α中的免疫印迹 ΔH CCL术后指定时间点肝标本 4 注射。每个分析点显示两个有代表性的样本。HSC 70用作装载控制。车道是非毗连的(黑线)。显示的图形被裁剪，原始图像是补充数据的一部分。
急性CCL诱导的增殖反应 4 不受p38α消融的影响 自从p38αMAPK被大量报道成为细胞增殖的负调控因子，控制G1/S和G2/M细胞周期检查点的诱导。 34 ,35 ,36 ,37 ，我们检查了p38α缺乏对肝细胞增殖反应的影响。 4 暴露。我们监测了溴脱氧尿苷(BrdU)掺入量。 3A )，无论是在Control中还是在p38α中。 ΔH 肝脏在时间过程中的动力学。brdu阳性肝细胞在ccl后40小时即可检测到。 4 两组小鼠BrdU阳性肝细胞百分率均在48h达到高峰，随后逐渐下降(图二)。 3B )。与我们所预期的相反，我们没有在p38α中观察到brdu阳性肝细胞的全球富集。 ΔH 肝脏。事实上，p38α中的brdu免疫反应细胞略有减少。 ΔH CCL后40和48小时肝脏与对照肝脏比较 4 暴露(图) 3B )。为了加强这些有趣的结果，我们用PHH 3标记分析了G2期和有丝分裂的进展。 3C，d )。对p38α中BrdU分析的评价 ΔH 肝脏，ph_3阳性肝细胞百分率在ccl后40h略有下降。 4 与控制肝脏相比，暴露(图1)。 三维空间 )。此外，对细胞周期进展的关键驱动因素(周期蛋白D1(G1期)、A2(S期)和B1(G2/M)的分子分析也没有显示出两组小鼠之间的差异(图一)。 3E )。总之，这些数据表明，p38α缺乏并不影响肝细胞周期在急性损伤。重要的是，我们的发现揭示了p38α缺失引起的肝保护反应在很大程度上与已知的细胞周期检查点的作用无关。
提高抗氧化反应对CCL的保护作用 4 -p38α缺失时介导的损伤 自CCL以来 4 通过强烈的氧化应激反应引起严重的肝细胞损伤。 38 ,39 p38α是肝细胞氧化还原平衡的中介因子。 24 ,25 ,40 我们检测了p38α消融后所观察到的肝保护作用是否可归因于抗氧化反应的增强。
用荧光染料二氢乙烷(DHE)对照组和p38α新鲜冷冻肝切片进行肝脏ros的测定。 ΔH 老鼠(图1. 4A，b )。而ros水平在CCL后24小时没有明显变化。 4 在p38α的肝脏中 ΔH 而对照组小鼠，在40小时，我们确实注意到ros在p38α中积累量明显减少。 ΔH 肝脏(图1. 4A，b )。提示p38α缺乏症可减轻氧化应激。为了深入了解该信号通路，我们研究了Nrf 2介导的信号通路作为抑制小鼠急性肝损伤氧化应激的重要成分。 41 ,42 ,43 ..有趣的是，我们发现了Nrf 2的转录本。 4C )及其下游效应剂HO-1，过氧化氢酶和Gstm 3(图1. 4C )在p38α中明显增强。 ΔH CCL后40小时与对照肝比较 4 受伤了。这些发现提示p38α缺陷可转化为对ccl的保护作用。 4 -至少通过Nrf 2途径诱导ROS的形成。
图4 p38α肝脏抗氧化反应的增强 ΔH 急性CCL后小鼠 4 暴露。( a )对照二氢乙锭染色和p38α的典型图像 ΔH CCL术后24和40小时肝切片 4 . (b )从CTR和p38α染色得到的DHE荧光强度(任意单位)的定量 ΔH CCL术后24和40小时肝切片 4 ..数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组5例)。*p<0.05(双尾t检验)。( c )抗氧化基因的相对mRNA水平 Nrf 2 , HO1 , Gstm 3 和 过氧化氢酶 )定量PCR检测CTR和p38α。 ΔH CCL后24和40小时的肝脏标本 4 ..基因表达水平被归一化为 18S 每个样本的mRNA。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组6例)。*p<0.05，*p<0.001(双尾t检验)。
p38α缺失对急性肝损伤炎症反应的影响 有趣的是，在H&E染色水平上，我们观察到p38α内坏死区的炎症细胞明显增加。 ΔH 与控制肝脏相比(见图)。 5A )。然后我们从肝脏中提取免疫细胞，并证实其在p38α中增加。 ΔH CCL后40h小鼠与对照组小鼠比较 4 受伤(图1. 5B )。有趣的是，在60小时，p38α中的免疫细胞数量减少。 ΔH 肝脏，但仍高于对照组(图一)。 5B )。更进一步，我们监测了趋化信号，这些信号在急性肝损伤中起着至关重要的作用，通过控制免疫细胞的迁移。 44 ..我们发现两种CCL 2都有显著的上调作用(图二)。 5C )和CCL 5(图5)。 5D )40小时后-CCL 4 挑战，表明这些趋化因子有利于p38α中大量的免疫细胞招募。 ΔH 肝脏。
图5 p38α缺乏症提示炎症反应促进有效的组织修复。 a )H&E染色在对照组和p38α免疫浸润中的代表性显微照片 ΔH CCL术后不同时间点肝切片 4 注射。( b )CTR和p38α中每克肝的肝免疫细胞数 ΔH 小鼠在40和60小时后-CCL 4. 数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组5例)。*p<0.05，*p<0.01(双尾t检验)。( C-g )相对mRNA水平 CCL 2，CCL 5，TNFα，TGFβ和IL 1β CTR和p38α定量PCR检测 ΔH CCL术后指定时间点肝标本 4 注射。基因表达水平被归一化为 18S 每个样本的mRNA。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组5例)。*p<0.05(双尾t检验)。
接下来，我们评估了两组小鼠肝组织炎症相关的常见基因。重要的是，在伤后40小时，我们发现 肿瘤坏死因子α (无花果) 5E )和 转化生长因子β (无花果) 5F )不作修改的表达式 IL1β mRNA水平(图1. 5G )表明有一种特殊的炎症味维持组织修复。总之，我们的数据表明免疫细胞的增加可能参与了p38α消融引起的肝保护反应。
最后，为了证明免疫细胞的募集介导了由p38α缺失驱动的肝保护反应，我们在ccl前5小时用特异性中和抗体阻断CCL 2/CCL 5信号。 4 暴露(图) 6A )。我们通过计算从肝脏中提取的免疫细胞数量来验证抗体阻断的效果，发现免疫细胞总数急剧减少(图1)。 6B )两组小鼠。同时，我们发现抗体阻断会导致p38α中肝保护功能的显著丧失。 ΔH 肝脏通过坏死区域的放大(如图所示)。 6C )与减少的抗氧化反应有关(如图所示。 6d )。此外，我们还发现在对照组小鼠肝脏损伤的加重(图一)。 6C )，表明这些肝保护免疫细胞已经存在于p38熟练的肝脏中(如图所示)。 6B )但在p38α缺失下大量招募。有趣的是，我们发现 肿瘤坏死因子α 和 转化生长因子β 成绩单 6E )两组小鼠在CCL后40h同时升高。 4 CCL 2/CCL 5封锁后的挑战(图1)。 6E，f )。提示这两种信号(肿瘤坏死因子α和转化生长因子β)的结合参与了肝保护反应。因此，下调对.的管制 胶原蛋白 1阻断CCL 2/CCL 5后观察到1α1水平。 6f )，证实肝组织修复的衰减性。
图6 阻断CCL 2/CCL 5趋化信号在急性肝损伤时损害肝保护作用，导致p38α缺乏症。( a CCL 2和CCL 5封锁实验过程的原理图。控制(Ctrr)和p38α ΔH CCL后40h处死小鼠。 4 注射。( b )CTR和p38α中每克肝的免疫细胞数 ΔH CCL 2/CCL 5抗体治疗或不治疗小鼠，CCL 4后40小时 4 暴露。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组5例)。*p<0.05，*p<0.01(双尾t检验)。( c )肝组织切片H&E染色分析CTR和p38α的坏死面积。 ΔH CCL 2/CCL 5抗体对小鼠的作用及其在CCL 40小时后的定量研究 4 ..数据表示平均值±扫描电镜( n ≥每组5例)。*p<0.01，*p<0.001，*p<0.0001(双尾t检验)。( d )抗氧化基因的相对mRNA水平 Nrf 2 , HO1 和 Gstm 3 )定量PCR检测CTR和p38α。 ΔH CCL 2/CCL 5抗体治疗或未治疗小鼠肝脏及其在CCL 40小时后的定量 4 ..基因表达水平被归一化为 18S 每个样本的mRNA。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥3/组)。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001(双尾t检验)。( e，f )相对mRNA水平 肿瘤坏死因子α 和 转化生长因子β (E)和 胶原1α1 (F)定量PCR检测CTR和p38α ΔH CCL 2/CCL 5抗体治疗或未治疗小鼠肝脏及其在CCL 40小时后的定量 4 ..基因表达水平被归一化为 18S 每个样本的mRNA。数据表示平均值±扫描电镜( n ≥3/组)。*p<0.05，*p<0.01，*p<0.001(双尾t检验)。
总之，我们的数据清楚地证明了这两种趋化信号的关键要求，即促进免疫细胞的募集，以介导p38α消融所驱动的肝保护反应。
