在妊娠期间，滋养细胞通过表达和分泌各种趋化因子和细胞因子来维持母胎耐受。我们先前的研究揭示了白细胞介素-35(IL-35)在人早孕滋养细胞中的表达.我们发现IL-35在人早孕原代滋养细胞和滋养细胞中均有表达。滋养层细胞抑制人幼稚传统T细胞增殖康夫)并转换被抑制的T。康夫细胞进入它R以一种依赖于IL-35的方式。机制上，来源于IL-35的滋养层细胞通过磷酸化STAT 1和STAT 3介导其功能。体内研究证实，免疫自然流产小鼠的白细胞介素-35水平较低。R35细胞位于母胎界面，中和抗IL-35单克隆抗体可提高流产率.同时，外源性IL-35诱导细胞凋亡。R35预防免疫性流产。因此，我们的研究结果表明，滋养层细胞通过在怀孕期间分泌IL-35，在维持母胎耐受性方面具有重要作用。

在免疫学上，胎儿被认为是存在于免疫能力强的母亲体内的移植物，母亲的免疫系统必须容忍这种异种胎儿才能保持妊娠的成功。1..母胎界面细胞与细胞因子协同作用可诱导母胎耐受。2,3..然而，这种独特的免疫行为的机制仍然缺乏了解。滋养层细胞作为胎盘的重要组成部分，除了具有增殖性和侵袭性外，还能表达和分泌多种趋化因子和细胞因子，从而成为维持母胎耐受的效应细胞。4..例如，滋养细胞通过分泌一系列严格控制的趋化因子(CXCL 12、CXCL 16和CCL 3)，选择性地向蜕膜吸收外周免疫细胞，如自然杀伤细胞和T细胞，然后调节它们的功能。5,6..滋养细胞还通过分泌细胞因子(如IL-10和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLPs)，使Th1/Th2比值向Th2方向移动，并通过分泌细胞因子(如IL-10和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLPs)抑制Th17免疫。4,7..我们先前的研究表明，免疫抑制细胞因子IL-35在人早孕滋养细胞中是构成性表达的。8.

作为IL-12细胞因子家族的最新成员，IL-35可能通过上下文依赖的方式抑制Th1和Th17细胞的增殖和激活，同时促进调节性T细胞(Tregs)在许多自身免疫性疾病中的抑制作用。IL-35在调节m1/m2巨噬细胞比例和诱导树突状细胞耐受性表型方面也起着关键作用。9..白细胞介素-35的另一个重要功能是转化幼稚的传统T细胞(T细胞)。康夫(将其转化为产生IL-35的调节性T细胞，称为R3510,11..鉴于IL-35的免疫抑制作用及其在滋养细胞中的连续表达，我们推测滋养层细胞分泌的IL-35可能通过调节T参与母胎耐受。康夫细胞增殖和分化。

在本研究中，我们发现来自滋养层细胞的IL-35抑制了T细胞的增殖。康夫细胞，并进一步将它们转化为它。R35.我们还描述了这一调节群体的表型，并讨论了滋养层细胞衍生的关键转录因子-IL-35介导转化。此外，在体内进一步评估IL-35对母胎耐受性的生理贡献。

IL-35在人血清和滋养层细胞中的表达

我们首先用ELISA法测定了早孕妇女和年龄匹配的非妊娠妇女外周血IL-35水平。妊娠前三个月血清IL-35水平与非妊娠健康对照组比较有显着性升高(图一)。1A)。随后，我们研究了IL-35在原代滋养细胞(PT)和滋养细胞株-HTR 8中的表达。实时RT-PCR结果显示EBI 3和P35PT和HTR 8细胞mRNA水平的变化(见图)。1B)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量测定IL-35的含量为3857 pg/ml。−1在HTR 8细胞的培养上清液中。1C)。通过免疫细胞化学染色，我们证明PT和HTR 8细胞构成地表达了IL-35、EBI 3和p35两个亚基。1D)。进一步的免疫荧光评价表明，这两个亚单位共同位于滋养层细胞的细胞质中(如图所示)。1E)。因此，孕早期滋养细胞能够表达和分泌免疫抑制因子IL-35.

IL-35存在于人血清和滋养层细胞中.a早期孕妇的血清(左，n17岁与非孕妇年龄匹配(右，n采用ELISA法测定IL-35水平。IL-35的检测范围为62.5~4000 pg ml。−1. bIL-35两个亚基的mRNA水平ebi3和P35原代滋养细胞(PT)和HTR 8细胞进行实时定量RT-PCR检测.将结果归一化为内源对照(GAPDH) (n=2)。chTR 8细胞上清液中IL-35含量的ELISA检测n=3)。dPT和HTR 8细胞EBI 3和p35的免疫细胞化学染色标尺：50μm。eEBI 3(红色)和p35(绿色)在HTR 8细胞中的免疫荧光染色标度栏：20μm，1a的数据以中间四分位数范围表示。意义是由曼-惠特尼决定的。U-测试。1b和1c的数据为平均±SD。意义是由学生的t测试分析。***P < 0.001

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滋养层细胞来源的IL-35抑制T康夫增殖

目的探讨滋养层细胞来源的白细胞介素-35(IL-35)在维持妊娠中的作用。康夫用人r-sc-IL-35、滋养细胞上清液和中和抗IL-35单克隆抗体，分别加入抗CD3/抗CD 28微球和IL-2。CCK 8检测结果表明，PT或HTR 8细胞培养上清液对T细胞增殖有明显的抑制作用。康夫类似于r-Sc-IL-35诱导的细胞。然而，中和抗IL-35mAb可部分阻断滋养细胞上清液的抑制能力(图)。2A)。这些结果表明，虽然没有直接的细胞接触，滋养层细胞抑制T细胞的增殖。康夫细胞通过分泌IL-35。

滋养层细胞抑制T细胞增殖康夫并通过分泌IL-35来介导其转化。T型康夫细胞单独在培养基(对照组)中培养，或与人r-sc-IL-35(IL-35)(50 Ng Ml)培养。−1或100纳克毫升−1)，或用抗CD3/抗CD 28微球和IL-2存在的滋养细胞上清液(不论是否中和抗IL-35 mAb)培养5天。a然后，T的增殖康夫用CCK 8法对细胞进行评价。n=4)。bT治疗前后EBI 3和p35蛋白水平的变化康夫Westernblot法检测细胞数。n=3)。cmRNA水平ebi3 (n=4)和P35 (n=3)单位：T康夫用实时定量RT-PCR法检测细胞。将结果归一化为内源对照(GAPDH). dT治疗前后EBI 3的流式细胞术分析康夫细胞。取细胞，经活化鸡尾酒活化后，用抗EBI 3或等型对照抗体(等型)染色。n=3)。数据以平均±SD表示。意义是由学生的t测试分析。*P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001

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滋养层细胞来源的IL-35转化T细胞康夫投入其中R35

接下来，我们研究了滋养层细胞来源的白细胞介素-35(IL-35)是否能诱导T细胞转化。康夫细胞进入它R35.如图所示。2B，c与对照组相比，PT或HTR 8细胞培养上清液明显上调T细胞IL-35的表达。康夫细胞在mRNA和蛋白质水平上。我们还观察到P35亚基在不同的组中是不一致的，这可能是由转录后和翻译调节，例如选择性剪接和mrna衰变来解释的。12..细胞内细胞因子染色进一步显示，人r-sc-IL-35或滋养层细胞上清液均诱导T细胞IL-35表达显著增加。康夫细胞(图1.二维空间)。这些数据表明，滋养层细胞来源的IL-35可以转化T细胞。康夫细胞进入它R35.

T的微阵列分析康夫滋养层细胞诱导

鉴于上述结果，滋养层细胞来源的IL-35抑制了T细胞的增殖。康夫细胞并将其转化为抑制性细胞R我们接下来要研究35个细胞的表型。用r-sc-IL-35或滋养层细胞上清液处理5天后，T康夫收集细胞，用荧光结合单克隆抗体染色进行流式细胞术分析。结果表明，在T细胞中存在明显的抑制性分子，包括延迟-3和CD 73。康夫r-Sc-IL-35处理的细胞和PT或HTR 8细胞的上清液。然而，ctla-4的表达仅在T中略有增加。康夫HTR 8细胞上清液刺激的细胞。3).

滋养层细胞诱导的抑制表型分析R35个细胞。T型康夫细胞单独在培养液中培养，或与IL-35或滋养层细胞上清液培养5d。然后取细胞进行流式细胞术分析，检测表面分子CTLA-4、CD 73和延迟-3。显示ctla-4百分比的密度图+、CD 73+和滞后性-3+T细胞康夫单元格(左)和相应的统计分析(右)(n=3)。数据以平均±SD表示。成对学生的显着性t测试分析。*P < 0.05

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另一方面，转化T的细胞因子分泌谱康夫用Bio-Plex蛋白阵列系统对细胞进行评价。我们观察到T细胞中IL-10和IL-12 p70水平显著升高，IL-17A和INF-γ水平明显降低。康夫rsc-IL-35或滋养层细胞上清液处理的细胞与对照组比较。此外，功能性抗IL-35单克隆抗体的加入明显阻断了滋养细胞上清液的这些作用。值得注意的是，IL-1β和TNF-α等细胞因子水平在滋养细胞上清液组中也以一种不依赖IL-35的方式显著升高。4A).

T细胞因子分泌谱评价康夫滋养层细胞来源的IL-35及其相关转录因子诱导的细胞转化。a T康夫细胞单独在培养基(对照组)中培养，或与人r-sc-IL-35(IL-35)(50 Ng Ml)培养。−1)，或用滋养细胞上清液(不论是否中和抗IL-35mAb)作用5d。然后是活化T的上清液康夫利用Bio-Plex蛋白阵列系统采集细胞进行细胞因子分泌谱评价。在T康夫将细胞与PT或HTR 8细胞的上清液共同培养，将细胞因子浓度的最终结果与PT或HTR 8细胞的初始上清液分别归一化，作为内对照。n=2)。b T康夫细胞在培养基(对照组)中培养，或与人r-sc-IL-35(IL-35)(50 Ng Ml)培养。−1或100纳克毫升−1)，或用滋养层细胞(PT和HTR 8)上清液培养1h。康夫收集细胞，Westernblot法检测磷酸化(P)和总STAT 1、STAT 3、STAT 4蛋白水平。n=3)。数据以平均±SD表示。意义是由学生的t-测试。*P < 0.05 and **P < 0.01

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关键转录因子在其诱导中的作用R35

AS-35属于IL-12细胞因子家族，它通过STAT家族转录因子传递信号。13，我们进一步研究了与之相关的STAT蛋白。R滋养层细胞来源的IL-35诱导35。Westernblot分析表明T的治疗康夫r-Sc-IL-35或滋养层细胞上清液作用1h后，STAT 1和STAT 3的磷酸化明显增强，而pSTAT 4未被检测到。4B)。这些发现表明，滋养层细胞来源的IL-35对T具有生物学作用。康夫细胞通过激活转录因子STAT 1和STAT 3。

IL-35及资讯科技的贡献R35细胞体内妊娠

为探讨滋养细胞分泌白细胞介素-35(IL-35)在维持母胎免疫耐受中的作用，建立了一种描述良好的免疫性自然流产小鼠模型。在该模型中，CBA/J×DBA/2J组(AP)孕妇免疫反应异常导致胎儿排斥反应和自然流产，而CBA/J×BALB/C组(NP)则无异常。5A，e，f)。首先，比较胎盘组织中IL-35在AP和NP女性中的表达情况.我们观察到在AP女性和NP女性中IL-35 mRNA和蛋白水平明显下调(如图所示)。5G，h)。接下来，T康夫从蜕膜中分离细胞进行表型分析和IL-35表达鉴定。根据单细胞分析结果，np女性在蜕膜T细胞中有较高的IL-35表达。康夫细胞比AP雌性。6A)。同样，在蜕膜T细胞中也观察到较高水平的IL-35 mRNA和蛋白。康夫NP雌性细胞高于AP雌性(图1)。6E，f).

NP小鼠和AP小鼠胎儿的表型及胎盘IL-35的表达。孕CBA/J雌性小鼠于妊娠第13.5天进行安乐死。a–d有代表性的图片显示不同处理的AP和NP小鼠的胚胎和每子宫活胎。红色箭头：流产的胚胎。e测量胚胎大小。从左到右：n=四个不同母亲(AP小鼠)的35个胚胎，n=来自四个单独母亲(NP小鼠)的39个胚胎，n=来自四个单独母亲的38个胚胎(AP小鼠+载体)，n=四个不同母亲的31个胚胎(AP小鼠+IL-35)，n=来自三个单独母亲的25个胚胎(AP小鼠+载体)，n=27枚分别来自三个母亲的胚胎(AP小鼠+IL-35 mAb)，n=三个单独的母亲(NP小鼠+载体)和n3只母鼠(NP小鼠+IL-35mAb)胚胎25枚。f每个子宫活胚的比例按以下公式计算：每子宫活胚比例=(每个子宫活胚数)/(每个子宫总胚胎数)。g–h孕CBA/J雌性小鼠于妊娠第13.5天进行安乐死，分离和剥除胎盘。然后从组织中提取蛋白质和mRNA。采用westernblot法检测胎盘组织中EBI 3和p35蛋白水平。n=4)(g)。采用实时定量RT-PCR分析方法，比较其表达情况。ebi3和P35在NP和AP女性的胎盘中(n=4)(h)。数据以平均±SD表示。意义是由学生的t-测试。*P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001

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IL-35在T细胞中的表达模式康夫不同处理NP或AP小鼠的细胞。孕CBA/J雌性小鼠于妊娠第13.5天进行安乐死，取蜕膜分离并撕脱。a–d T康夫分离蜕膜细胞，用抗EBI 3或等型对照抗体染色进行流式细胞术分析。eT细胞EBI 3和p35蛋白水平的研究康夫Westernblot检测细胞。f–imRNA水平ebi3和P35蜕膜T康夫采用实时定量RT-PCR分析细胞。将结果归一化为内源对照(GAPDH). f n=4为AP小鼠组，nNP小鼠组=4。g n=4为AP小鼠+车辆组，nAP小鼠+IL-35组=4。h n=3为AP小鼠+车辆组，nAP小鼠+IL-35mAb组=3。i nNP小鼠+车辆组=3，nNP小鼠+IL-35mAb组=3。数据以平均±SD表示。意义是由学生的t-测试。*P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001

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证明了IL-35和它R35细胞在NP中增强，而在AP女性中没有增强，我们接下来评估IL-35对AP女性免疫流产的治疗效果。首先，将AP小鼠随机分为两组：对照组给予磷酸缓冲液生理盐水(Vehicle)，实验组给予小鼠R-sc-IL-35注射。如图所示。5B，e，f小鼠γ-sc-IL-35可明显降低AP组的胎儿吸收率.然后我们确认蜕膜T康夫r-sc-IL-35处理的AP女性细胞IL-35 mRNA和蛋白表达均高于对照组(见图).6E，g，与流式细胞仪的结果一致(图1)。6B)。此外，还对NP和AP女性腹腔注射中和IL-35抗体，以进一步评价IL-35的作用。结果表明，抗IL-35mAb治疗可提高两种配子的流产率(图二)。5C-f)。流式细胞仪分析显示抗IL-35单克隆抗体可降低T细胞的IL-35表达。康夫NP和AP雌性细胞。6C，d)。在mRNA和蛋白质水平上也检测到了类似的结果(如图所示)。6E，h，i)。综上所述，这些发现表明滋养层细胞来源的IL-35促进小鼠蜕膜it的扩张。R妊娠期细胞35例。免疫自然流产小鼠白细胞介素-35水平较低。R35细胞和外源性IL-35治疗有助于预防流产.

在怀孕期间，维持母胎耐受性需要滋养细胞、蜕膜基质细胞和免疫细胞之间复杂的通讯网络。14..特别是，滋养层细胞与免疫细胞之间的双向通讯被赋予了重要的角色。15..在此相声中，滋养层细胞分泌一系列细胞因子参与T细胞等免疫细胞的募集，并进一步调节其增殖和极化。16,17..值得注意的是，正如我们先前所描述的，在生理条件下，人胎盘绒毛构成性表达抑制性细胞因子IL-35和IL-35分泌。8..本研究首次证实IL-35在人早孕原代滋养细胞和滋养细胞株中表达，早期孕妇血清IL-35水平明显升高。提示IL-35可能在维持母胎耐受性中起重要作用。

IL-35最初被描述为天然Treg特异性产生的一种免疫抑制细胞因子，在体外和体内都是最大Treg功能所必需的。18..此外，Treg的IL-35介导T细胞的增殖抑制。康夫细胞及其诱导R3519..在本研究中，我们还评估了滋养层细胞来源的IL-35对T细胞的作用。康夫细胞。滋养层细胞分泌的IL-35(PT和HTR 8)对T细胞的增殖有明显的抑制作用。康夫细胞。尽管先前的研究已经证明，人滋养层绒毛膜癌细胞上清液对T细胞增殖有抑制作用。20,21在这些研究中，滋养层细胞上清液中的抑制因子还没有被发现，其潜在的机制目前还不清楚。我们的结果首次证明了滋养层细胞分泌的IL-35抑制了T细胞的增殖，并诱导了T细胞的转化。康夫细胞进入它R35.

随后，我们分析了IL-35治疗T细胞的表型和细胞因子分泌谱。康夫细胞。分析了表面分子，包括LAG 3、CD 73和ctla-4，这些分子被认为是nTreg细胞抑制的中介分子。22,23,24..我们的数据表明，滋养层细胞来源的IL-35诱导T细胞表面抑制受体LAG 3和CD 73的表达上调。康夫细胞和这些分子是重要的，以最大限度地抑制Tregs的活性。在表型分析的同时，T细胞抑制因子IL-10的产生显著增加。康夫IL-35从滋养层细胞诱导的细胞。这一结果与以往报道的结果一致，即IL-35诱导Treg细胞数量的增加，而IL-10的产生也随之增加。19..根据先前的研究，IL-35直接抑制Th1和Th17细胞，并导致INF-γ和IL-17的产生减少。25,26..在这里，我们的观察也证实了抑制T康夫细胞增殖伴随着IFN-γ和IL-17A分泌的急剧下降。此外，滋养层细胞上清液中除IL-35外的其他因素也可能参与T细胞的转化。康夫IL-1β、TNF-α等细胞因子的改变未被IL-35阻断所抑制.

传染性耐受性在Treg介导的免疫耐受的传播中起着重要的作用。27..研究表明，nTreg细胞具有抑制T细胞表型的作用，β参与了感染性耐受性的形成。康夫转化生长因子-β依赖途径的细胞28..在自身免疫性疾病中，IL-10在介导Treg细胞感染耐受中的关键作用也被观察到。29..此外，nTreg细胞分泌IL-35和IL-10并转化T。康夫细胞进入它R35细胞呈IL-35依赖性和IL-10依赖性19,30..事实上，我们的数据显示滋养层细胞诱导了它。R35也分泌了同源的IL-35和IL-10，这说明了IL-35和it的可能性。R母胎界面上的35个细胞可能是额外的，重要的传染性耐受性的中介。

在上述结果的基础上，我们进一步探讨滋养层细胞来源的IL-35发挥其作用的机制和信号通路。链共享在IL-12家族的细胞因子中很常见，它延伸到它们的受体和转录因子。31..IL-12家族中的细胞因子一般通过信号转导和转录激活因子家族的磷酸化和激活来传递信号。32..然而，IL-35激活的统计因子在不同的细胞类型和不同的物种中存在多样性。小鼠实验证实IL-35介导T细胞的调节功能康夫通过STAT 1、STAT 3和STAT 4磷酸化的细胞33,34IL-35信号转导诱导小鼠B细胞STAT 1和STAT 3磷酸化，与T细胞不同34..在这里，我们证实滋养层细胞来源的IL-35信号是通过激活人T细胞中的STAT 1和STAT 3来表达的。康夫细胞，但在上述背景下，STAT 4没有磷酸化，这与先前的一项研究相一致，该研究描述了IL-35在人大肠癌中的作用。35..在这方面，提出了几种可能性。首先，IL-35可能利用不同种类和细胞类型的不同受体和信号元件。34..此外，即使IL-35采用相同的受体，由受体链(gp 130和IL-12Rβ2)形成的不同的高阶多倍体仍可能导致不同转录因子的激活。33..总的来说，这些数据表明IL-35的调控作用有一个额外的复杂性层，这一点还有待进一步阐明。

鉴于体外实验结果，我们进一步评估了IL-35和it的作用。R35在母胎耐受性维持的自然流产小鼠模型。滋养层细胞来源的IL-35和蜕膜RAP女性35例明显低于NP女性。外源性白细胞介素-35对AP女性的促蜕膜效应R35转化率，中和抗IL-35单抗则抑制其转化。R35细胞转化和提高流产率。这进一步证实了IL-35在正常妊娠中是一个重要的因素.据报道，Th17细胞多余，Treg减少，Th1/Th2细胞因子失衡是自然流产的主要原因。36,37,38,39,40..在这里，我们提供了证据，证明滋养层细胞产生的白细胞介素-35减少了蜕膜细胞的数量。R35也是导致自然流产的重要原因。这些观察为异常妊娠的发病机制提供了重要线索，并可为进一步的临床研究提供参考。

综上所述，我们的研究表明，滋养层细胞通过分泌IL-35来促进母胎耐受，从而抑制蜕膜T细胞的增殖和诱导蜕膜T的转化。康夫细胞进入它R母胎界面35例。虽然还需要更多的实验来充分了解其潜在机制，但目前的研究结果支持滋养细胞来源的IL-35在维持妊娠成功方面发挥着关键作用，IL-35可能是治疗反复自然流产的有效免疫治疗策略。

样本采集

由于非医学原因，从妊娠早期(5-8周)的选择性终止中采集人绒毛组织和血液样本。对照组的血液样本来自年龄匹配的健康女性志愿者。在采集样本之前，获得山东大学第二医院人体调查委员会的批准，并获得各研究对象的书面知情同意。所有与人类参与者一起工作的相关道德规范都得到了遵守。

细胞因子和单克隆抗体

人重组单链IL-35(r-sc-IL-35)和人重组IL-2(rIL-2)分别购自PeproTech.从研发系统购买中和抗人IL-35单克隆抗体.小鼠重组单链IL-35(R-sc-IL-35)来源于Chimerigen.中和抗小鼠IL-35单克隆抗体是从默克公司购买的。在免疫细胞化学染色中，从Novus生物制品和R&D系统中获得了抗人EBI 3和p35的原代抗体。在免疫荧光染色中，从Santa Cruz和R&D系统中获得了抗人EBI 3和p35的原代抗体。在westernblot实验中，从细胞信号技术中获得了抗人p-STAT 1、p-STAT 3、p-STAT 4和β-actin的初级抗体。人EBI 3的第一抗体来自圣克鲁斯，p35来自研发系统。抗小鼠EBI 3和p35的主要抗体来源于ABCAM。在流式细胞术中，FITC标记的抗人CD4单抗、PE标记的抗人延迟-3、CD 73、CTLA-4、EBI 3单抗及相关的同型对照抗体均为eBioscience的产物.PE标记的抗小鼠EBI 3单抗及相关的同工型控制抗体是R&D系统的产物。

细胞株与细胞培养

人滋养层细胞系-HTR 8/SVneo是查尔斯·格雷厄姆博士(皇后区大学，金斯敦，加拿大)的一份礼物。用含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(LifeTechnologies/吉布co)的RPMI 1640(LifeTechnologies/Invitrogen)在37°C加5%CO的加湿孵化器中保存细胞。2.

人原代滋养层细胞的分离与培养

新鲜滋养细胞活组织切片切成小片段，在37℃恒温摇瓶中与胰蛋白酶(Invitrogen)和DNaseІ(SigmaAldrich)孵育20 min，共3个周期。悬浮液经100μm和40μm孔过滤.收集到的胎盘细胞经密度梯度离心后，经Percoll(生物夏普，药理学)在1200×分时进一步分离。g30分钟。细胞悬液浓度标记为1.049~1.062 g ml−1收集后在RPMI 1640培养基中加入FBS，再悬浮40 min，使污染的巨噬细胞粘附在培养皿上。非贴壁滋养层细胞在5%CO的1640培养基上被镀在基质涂层的培养表面上。2在37°C8.

人外周血T细胞的分离与培养康夫细胞

采用Ficoll-Paque Plus(Sigma Aldrich)密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)。常规T细胞(CD4)+CD 25−CD45RA+CD45RO−)是用人纯CD4分离出来的。+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)。经流式细胞仪鉴定，纯度>97%。纯化T康夫在RPMI 1640培养液中加入rhIL-2和CD3/CD 28 T细胞激活剂(Stemcell Technologies)。

IL-35水平的ELISA检测

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(CUSABIO)检测血清或HTR-8细胞上清液中IL-35水平。每个样本一式三份，并测量平均值。IL-35的检测范围为62.5~4000 pg ml。−1.

RNA的提取与实时定量RT-PCR

用TRIzol试剂(Invitrogen)从纯化细胞中提取总RNA。对于人类T康夫用逆转录-Tra Ace试剂盒(TOYOBO)反转录成cDNA，用SYBR Green实时PCR主混合(TOYOBO)进行实时RT-PCR。采用以下序列特异性引物：(1)内部控制GAPDH基因：前进，5‘-GGGGTCTCCTCTCTGACTTCAACTG-3’，反向，5‘-GTTGTAGCAAATTCGTTGT-3’；(Ii)ebi3基因：正向，5‘-GCAGACGACGT-3’，反向，5‘-CCATGAGAACAGCTGGACAT-3’；(3)P35基因：前进，5‘-CCTTCACACTCCCAAAAC-3’，反向，5‘-TGCTGCCTTCTGGAGCAT-3’41.

小鼠T康夫根据制造商的指示，用ReverTra Ace Kit(TOYOBO)反向转录RNA。使用SYBR绿色实时PCR主混合(TOYOBO)进行实时RT-PCR，引物如下：ebi3前进：5‘-CGGTGCCCATGCTAAAT-3’；ebi3反向：5‘-GCGGGTCGTACTTGAGAG-3’；P35前进：5‘-CATCGATGAGCTGATG CAGT-3’，P35反向：5‘-CAGATAGCCCATCACTGT-3’。GAPDH前进：5‘-AGGTCGGTGTGAGGATTG-3’；GAPDH反向：5‘-TGTAGACCATGTA GTTGAGGTCA-3’。GAPDH作为数据规范化的标准。

westernblot分析

用RIPA缓冲液(Beyotime)提取细胞中的蛋白，用BCA蛋白分析试剂盒(Beyotime)进行评价。用SDS-PAGE法分离等量的蛋白质，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。然后用5%脱脂奶粉阻断膜，4°C与原抗体共同孵育，然后用二次抗体(ICLLab)检测条带，用化学发光法(LifeTechnology)观察。所有未裁剪的污迹都包含在源数据文件中。

CCK 8法

T康夫细胞在1×10的96孔板上一式三份播种。5用人r-sc-IL-35或原代滋养细胞(PT)和htr 8细胞培养的上清液，在中和抗IL-35单抗(10μg ml)存在的情况下，在总培养体积的30%的条件下，每孔培养细胞。−1)或不包括5天。每2天加入新鲜条件培养基。处理后，在每口井中加入20μ1的CCK 8溶液(Dojindo)，用微板阅读器(Bio-Rad，USA)在450 nm波长处测定吸光度值。结果代表了三个单独的实验。

免疫细胞化学和免疫荧光染色

我们用生物素-过氧化物酶复合物法检测il-35的表达，就像我们之前描述的那样。8..用丙酮/甲醇(1：1)固定6孔板70%汇合的细胞，0.5%TritonX-100渗透。在37℃下用5%牛血清白蛋白封闭1h后，用抗EBI 3或抗p35抗体在4°C孵育一夜。通过添加生物素标记的二级抗体，结合生物素-生物素复合物进行标记，并用民建联染色。以小鼠同型匹配无关IgG作为阴性对照。免疫荧光染色：先用甲醛固定液处理细胞，室温孵育20 min。非特异性染色阻断后，用抗EBI 3或抗p35抗体检测细胞。EBI 3用Alexa 594(红色)显示，p35用Alexa 488(绿色)显示。使用荧光显微镜进行可视化(奥林巴斯，日本)。

细胞因子测定

T上清康夫细胞经刺激(r-Sc-IL-35，PT或HTR 8细胞)在指定的时间点采集，保存在−80°C处，待评估。细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12 p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ按生产厂家的指示同时测定，每样一式两份。

流式细胞术

取细胞进行细胞表面标记染色，以单克隆抗体检测LA-3、CD 73、CTLA-4和CD4或其特异性同工型对照。IL-35细胞内染色，先与细胞活化鸡尾酒(R&D系统)孵育，然后按制造商的指示，用细胞内固定和渗透缓冲器(EBioscience)固定和渗透。用小鼠或人EBI 3单克隆抗体孵育细胞，用BD生物科学FACS杯流式细胞仪进行分析。数据分析采用FCS快递V3或Flow JoV 10。门控策略出现在补充图中。1.

动物实验装置

8周龄CBA/J女性以及BALB/c和DBA/2J男性购自中国医学科学院实验动物科学研究所(CAMS)。CBA/J×DBA/2J代表流产倾向组(AP)，CBA/J×BALB/c代表正常妊娠对照组(NP)。42,43..阴道塞出现后，即妊娠第0.5天，雄性小鼠与雌性小鼠分离。5只雌性小鼠与1只雄性小鼠交配，3-4只雌性小鼠被证实怀孕。孕CBA/J雌性小鼠于妊娠第13.5天进行安乐死。在体内研究白细胞介素-35(IL-35)的治疗作用，给小鼠腹腔注射r-Sc-IL-35.(0.75μg/d，溶于3 0 0μl的PBS)妊娠第2~12天给AP小鼠。对照组只注射3 0 0μ1的PBS。为研究中和抗IL-35mAb的体内实验研究，采用小鼠抗IL-35mAb腹腔注射。(70μg/d，溶于300μl的PBS)孕3~12天对NP小鼠和AP小鼠。

对受孕小鼠进行安乐死后，根据胚胎大小和坏死出血相与正常胚胎进行比较。蜕膜被分离出来，用柱塞撕开。收集的细胞经100μm孔尼龙细胞过滤器过滤.用密度梯度离心法和T法分离淋巴型。康夫细胞(CD4)+)用磁微球(Miltenyi Biotec)纯化。然后在完全培养基中进行细胞培养，并进行进一步分析。动物研究经山东大学第二医院动物调查委员会批准，符合动物检测和研究的相关伦理规定。

统计分析

用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。数据以平均±标准差(SD)表示。两组间的差异用学生的评估t-测试。用mann-Whitney法比较妊娠组和非妊娠组血清IL-35水平。U-测试。一个p值<0.05者为显着性。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

在这项研究中生成或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中(以及它的补充信息文件)。图的源数据显示在源数据文件中。