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抗体纯化中常见问题详解

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发表时间:2019-11-19 12:30作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

抗体纯化中常见问题详解

1、优质的抗体包含的条件:

1).抗体的纯度大于95%(这里的纯度是指有效抗体的含量而不是单纯的电泳纯度);

2).抗体的活性(效价高);

3).抗体的稳定性(4℃保存10天无沉淀,-20℃保存3年以上效价无明显变化,反复冻融10次无沉淀)。

2、ProteinA/G纯化的不利因素:

Protein A是一种金黄色葡萄球菌(Protein G是一种链球菌株)细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合(有时结合少许IgM),故此可以分离出IgG抗体。但是Protein A/G却无法区分特异性IgG的Fc段还是非特异性IgG的Fc段,故此Protein A/G纯化出的是总的IgG蛋白。

腹水中含有白蛋白、γ球蛋白、巨球蛋白、转铁蛋白、细胞及其残片、脂肪、小鼠的各种杂蛋白(如游离的鼠IgG、IgM),而我们真正需要的抗体只占很少一部分(大约占15%左右);而抗血清中的有效抗体也只占总IgG的30%左右,其余都是无关的IgG或无用的抗体;所以Protein A/G纯化的抗体看似“很纯”(电泳图),其实真正有效的“目的抗体”单抗只占比75%左右,(兔)多抗只占比30%左右。

3、利用抗原亲和纯化抗体的优缺点。

亲和纯化是抗体抗原的结合,理论上应该是纯度最高特异性最好的纯化方法,但是通常由于抗原的提取难度非常困难,所以获得高纯度的抗原并不是一件非常简单的事情。当我们不能获得高纯度的抗原时亲和层析做出来的抗体也就不会那么纯了;另外亲和纯化时抗原抗体的结合比较牢固,要想分离抗原抗体就需要大幅降低洗脱液的pH值,抗体(蛋白)在这么低地pH下很容易变形失活,损伤是无法避免的。故此种情况下纯化出的抗体稳定性差,4℃保存1天就会出现少许沉淀,反复冻融很容易产生沉淀。

4、纯化出的抗体效价低的原因。

效价低是因为特异性抗体含量少;有沉淀是因为抗体纯度不够,杂蛋白含量高,如果是亲和纯化的抗体,那么可能是由于纯化过程中,抗体受到了损伤,抗体的结构和性能有所改变引起的。

5、为什么用Protein A/G纯化的抗体电泳很纯但做WB时却并不理想?

聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定,聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛效应,可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开,并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法,且重复性好,没有电渗作用。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量。其原理是:带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功,此法测定时间短,分辨率高,所需样品量极少(1-100ug),但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质,某些蛋白质不易与SDS结合,如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此时测定结果就不准确。

电泳只能根据分子量的大小进行分离,无法区分蛋白的性质,比如IgG的分子量都是150KD,通过电泳时无法区分哪些是自身的IgG,哪些是抗体的IgG。

而Protein A/G纯化出的是总的IgG蛋白,分子量都是150KD,故此通过电泳条带都是一样的,无法将杂IgG和目的抗体IgG分离出来。

所以有时用Protein A/G纯化的抗体,电泳很纯但做WB时却并不理想,这是纯化方法和纯化工艺的不当引起的。

6、为什么抗体需要纯化?

腹水或血清含有大量的杂蛋白和多种抗体,真正需要的抗体正常情况下只占总蛋白的15%左右。

未纯化的抗体(或纯化不好的抗体),不仅会干扰实验的正常进行,而且还可能产生与实验预期相反的结论。

抗体纯化的好处:纯化的抗体能降低非特异性本底,去除引起实验误差的污染蛋白,另一方面能精确控制实验中产生阳性信号的抗体量,可以浓缩抗体。


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