GZMB靶向细胞的高效检测 我们首先试图验证GZMB可切割报告基因作为T细胞表位鉴定的有用工具。以小鼠卵巢癌细胞系id8为apc，对tcr，OT-i进行了研究。 35 ..将编码鸡卵清蛋白(OVAL 241-280)40个氨基酸片段的微小基因结构导入ID8细胞，OVAL 241-280含有完整的OT-I最小表位(SIINFEKL)，或在该区域的中心处有该表位的置乱版本(LKNFISEI)。CD8 + 转基因小鼠脾细胞经抗CD3/28刺激扩增T细胞的实验研究 36 ，分别与各靶细胞共培养。流式细胞仪对共培养物的分析表明，SIINFEKL + 细胞经历了显著的( p < 0.0001 by unpaired, one-tailed Student’s t (测试)和实质(科恩的 d >40)与加扰阴性对照相比，其编码的报告蛋白被切割。这些数据提供了证据，证明本文描述的FRET移位分析能够有效地检测携带正确抗原的靶细胞(图1)。 2A，b ).
图2 FRET-移位分析测试。 a , b ID8细胞表达原始表位的Ova微基因片段(OVAL 241-280)或含有扰频表位的ova微基因(OVAL 257-264 SIINFEKL→LKNFISEI)。 + T细胞按1：1比例培养4h。 a 有代表性的FRET信号(ex405/em525)与CFP信号(ex405/em450)和( b )细胞在所有复制体中转移到目标门的比例( n 3，显示了贴面条形图和误差条表示平均±SD)。意义是用一个不成对的，单尾学生的 t 测试一下。效应大小计算为标准化均值(Cohen的效应大小)的差异。 c –e 以1：1的比例组合表达卵微基因的靶细胞或置乱对照细胞，形成二元混合目标群体。在FACS分析前，将混合靶标与OT-ⅠCTL共孵育4h，1：1效应器：靶比为1：1，每种条件一式三份(底面条形图和误差条表示均值±SD)。用自定义TaqMan法对回收的细胞进行裂解，纯化基因组DNA，作为qPCR的模板。意义是用一个不成对的，单尾学生的 t 测试一下。源数据作为源数据文件提供
GZMB对目标细胞的传递具有高度的特异性。 一旦GZMB敏感的FRET-移位法在同质靶细胞群体中被证明是表位特异性的，我们就在混合群体中测试该方法的特异性。由于GZMB是CTL在识别同源表位时释放的一种可溶性效应分子，我们认为穿孔素和GZMB可能从CTL与APC之间形成的免疫突触中逸出，有可能扩散到不相关的旁观者细胞中，产生假阳性信号。为此，将Ova微基因表达细胞与杂乱对照微基因表达细胞按1：1比例混合，与OT-ⅠCTL共培养。共培养完成后，根据图中所示的门控方案对细胞进行分类. 二维空间 ..介导ID8细胞在T细胞压力下进入“移位”门和CTL“未接触”门中的细胞 − 对照组为未受T细胞压力影响的基础微基因表达群体，用基因组qPCR方法进行恢复和分析，以确定这两个群体中Ova微基因和杂合微基因的相对比例。用qPCR(补充图)校正各转导的ID8细胞的平均整合率/细胞数。 2 我们发现，在靶门捕获的细胞中，95%以上的细胞表达了Ova微基因(如图所示)。 2E , p < 0.0001 by unpaired, one-tailed Student’s t 测试)，虽然在未接触的大门中捕捉到的细胞仍保持在大约1：1的Ova微型基因快速表达者与混乱的控制高速公路的比例(如图所示)。 2C , p >0.2，无配对单尾学生差异无显着性 t 测试)。
GZMB峰信号先于靶细胞凋亡 与此相反，GZMB的FRET移位实验依赖于从活化的CTL中获得颗粒酶B并诱导凋亡的抗原编码靶细胞的分离。因此，我们寻求研究在体外共培养系统中与凋亡进展动力学有关的FRET-移位信号的动力学，并建立一个安全分选的时间框架。再次采用OT-ⅠCTL/OVA微基因模型系统。建立四种不同的效应物：在10个不同的时间点建立靶标比率，监测%fret-移位和%碘化丙酸丙酯(PI)阳性。CTL/靶细胞共培养后1 h就可检测到FRET-移位信号，6~8h后逐渐上升至峰值(附图6~8)。 3A )。PI染色显示细胞膜完整性丧失和细胞死亡的信号在峰值频移信号出现后2~4h出现峰值(补充图)。 3B )由于细胞凋亡而急剧下降。因此，有一个安全的分类窗口，在此期间，已收到颗粒酶击中的APC可以被恢复和DNA提取，以进行表位鉴定。
抗原微基因检测灵敏度高。 接下来，我们测量了该方法的灵敏度，定义为当抗原存在于背景微基因群体中时，当该抗原在减少丰度时检测标准试验抗原的极限。为了探索这一点，我们构建并测试了一个多样化的随机微基因文库。合成含有48个随机碱基的简并寡核苷酸，经PCR扩增，连接到含FRET报告的慢病毒转移质粒的微基因位点(补充图)。1 )。将质粒连接产物转化为电敏感菌，在固体琼脂上扩增，得到≈1.8×10。 6 随机微基因克隆，从中分离质粒DNA并用于产生慢病毒。扁豆病毒被滴度，并被转移到id8细胞中，在moi中偏爱每个细胞一个插入事件，从而产生一个随机的小基因表达的目标细胞群体(补充表)。 1 ).
将Ova微基因表达的ID8细胞与随机微基因表达的ID8细胞相结合，在1：10~1：100，000的范围内筛选出5个不同的细胞群体。随机微基因表达细胞与典型的微基因表达细胞在细胞水平上进行掺杂，而不是在DNA水平上结合不同比例的不同质粒结构。这样做的理由是，由于需要经过长时间的纯度分类，才能在病毒转导后分离出一个高多样性的随机微基因表达群体，因此，一次准备库并从基础图书馆群体中生成尖峰种群将是更有效的方法，而不是反复对dna水平增强的库进行密集的fcs准备工作。我们进行了一项钉入法的比较研究，并证实微基因加钉法在下游分析中并没有显着地改变加钉序列的检测(补充图)。4 ).
每个细胞水平最高的细胞群体与OT-ⅠCTL共培养，并按FRET状态进行分类，以获得所有尖峰水平的移位和未移位的门(图一)。 3A )。门是通过在ctl上建立静止fret签名的边界来定义的。 − 控制人口。从每个收集的细胞群体中提取基因组DNA，利用Illumina适配器尾引物在Illumina MiSeq平台上直接测序，作为PCR扩增整合微基因的模板。通过分析每个尖峰库屏幕的移位门和解移门中检测到的Δ相对丰度，我们确定在1：10，1：100和1：1000的穗数水平上，Ova-microgene是移位门中检测到的最普遍的序列，相对于未移位的群体而言，Ova-microgene基因是最常见的序列(图1)。 3A )。在1：10，已不再观察到Ova-min基因是最主要的富集序列，但它仍然位于前5位高富集微型基因中，并在背景以上的10种标准差(σ)中检测到(图1)。 3B )。这些数据表明，即使在群体频率为1：10，也很容易检测到呈现相关表位的细胞，这通常被认为是常规检测的信号检测截止点。 37
图3 不是-我在图书馆里加了检查。在FACS分析前，将Ova微基因表达细胞与Ova微基因表达细胞以1：1的效应：靶比与CTL共同孵育4 h，获得随机的微基因文库。用PCR引物对回收的细胞进行裂解，从基因组DNA中扩增出整合的微基因，并对微基因位点两侧保守的转基因区域进行PCR扩增。采用带有指数化的Illumina适配器尾的引物，对2×250对末端化学的IlluminaMiSeq平台上的扩增产物进行直接测序。 a 在每个编码SIINFEKL表位的门中检测到的读取百分比。填充的白条代表未移动的门，黑色的圆圈代表移动的门。每个点代表一个单独的度量。源数据作为源数据文件提供。b 在1：10，000尖峰抽样中发现的所有唯一序列的读取计数频率表示为移位门和未移位门的相对频率之间的差异。虚线表示比平均Δ相对丰度值高出10σ。
用第二只小鼠TCR/pMHC对和另一株宿主靶细胞检测FRET-Shift信号。我们使用来自pmel-1 tcr转基因小鼠的细胞毒性T细胞。 38 ，已知通过识别hgp 100(25-33)肽KVPRNQDWL在小鼠H-2Kd环境中受到刺激。为此，构建了编码最小表位的hgp 100微基因序列和内源侧翼序列的16个氨基酸，并以类似上述方式插入到微基因-fret慢病毒盒中。病毒产生后，将hgp 100微基因和Ova微基因导入C57BL/6株小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞中。分别用OT-ⅠCTL和PMEL-1 TCR CTL对Ova微基因和hgp 100微基因表达的EL4细胞进行共培养。从这些实验中，我们观察到与ID8细胞相比，在Ova微基因表达的EL4细胞中，靶细胞有更高比例的FRET-移位，由此产生的FRET-移位幅度更大(补充图)。 5 )，这可能是MHC-I表达差异的潜在反映(补充图)。 6 ).
然后，我们确定在pmel-1 tcr/hgp 100系统中，通过将hgp 100微基因表达的el4细胞插入随机微基因表达的el4，可在pmel-1 tcr/hgp 100系统中重新获得在OT-i/ova系统中所显示的敏感性。 2 )细胞丰度为1：10，与PMEL-1 TCR CTL共培养。移转和未移位的群体都是通过FACS分离出来的，并用于制备小基因扩增文库，用于Illumina的测序。对原始读取进行了处理和分析，就像以前使用Ova尖峰库所做的那样，以揭示hgp 100实际上也可以被检测到超过10σ以上的背景(如图所示)。 4A ).
图4 PMEL-1 TCR筛选1：10，000 hgp 100微基因随机文库. a 用hgp 100微基因与pMEL-1TCR CTL以1：10，000的丰度加入hgp 100微基因的随机微基因表达的EL4细胞文库中，在FRET-移位FACS分析前，以1：1效应物：靶标比与pMEL-1 TCR CTL共孵育4h。在恢复和测序未移位和移位门捕获的微基因后，绘制了所有不同的微基因序列相对丰度的差异图。虚线表示比平均Δ相对丰度值高出10σ。 b 以ssDNA寡核苷酸池的形式合成了富集于pMEL-1TCR CTL初筛和1：1万hgp 100随机微基因文库中的480个微基因，并将其插入pMND-沉默-FRET慢病毒转移质粒中。制备了PMEL-1TCR第二轮病毒文库，并将其导入EL4细胞.转染纯化的泛素微基因表达的EL4细胞(1：1 E：t，4h)与新鲜激活和扩增的pMEL-1 TCR CTL共培养，按FRET移位进行分类。经PCR和扩增序列分析，初步确定了摇瓶文库各成员的相对丰度。 x -轴线)和第二轴( y -轴)屏幕绘制。编码hgp 100微型基因的16聚体被高亮显示并标记在合成的摇摄库中。虚线表示高于平均Δ相对丰度值10Δ。
改进假定命中的策略 在进行无偏表位发现时，人们对T细胞表位没有先验知识.在这里，我们注意到，一些随机编码的迷你基因满足了10σ截止，除了尖峰的标准迷你基因(图五)。 3B , 4A )。因此，我们用netmhpan分析了这些序列中的一个子集是否能包含真正的表位。 39 确定它们是否含有预测的mhc结合肽，并将它们与blastp的genbank非冗余cds翻译数据库进行比对。 40 确定它们是否与已知蛋白质有显著的序列相似性(补充表) 3 )。在这一分析中，我们选择了比已知的抗原微基因更丰富的微基因序列：在每种情况下，这是OT-I/OVA条件下的前三位，而PMEL-1TCR/hgp 100条件下的前15位。
在OT-I/OVA筛选中，除了典型的Ova微基因外，没有发现任何微基因含有预测的MHC结合子，也没有与GenBank中的任何蛋白质序列相一致，表明它们是背景噪声。与预期形成鲜明对比的是，NetMHCPAN对回收的Ova微型基因进行了评估，确定SIINFEKL是一种强大的MHC粘合剂(IC 50=44 NM)，BLASTP与GenBank数据库的一致性产生了Oval(G)。 (鸡耳) 得分最高(E-得分=1.4×10) –18 )。在pmel-1 tcr/hgp 100筛选中，此分析产生了标准hgp 100表位中的预期尖峰，即kvprnqdwl，作为预测的mhc结合剂(IC 50=123 nm)，并将检测到的hgp 100基因中的尖峰与参考人类gp 100序列(E-Score=3.0×10)对齐。 –19 )。此外，我们还找到了第二个编码一肽(KVYMPPIL)的微型基因序列，该序列预测将与409.9 NM的IC 50结合H-2kb编码的mhc，这可能代表了以前未报道的这个tcr的表位。
为了验证KVYMPPIL预测的肽，或在pMEL-1TCR/hgp 100筛选到的其他微基因序列是否是PMEL-1TCR的真正抗原，我们从图中重新筛选了480个富集序列。 4A ..这些序列中的大多数(313/480)低于这里使用的10σ工作极限，然而，这些微基因仍被包括在内，因为初级文库中的稀有微基因仍有可能引起T细胞反应性，但由于在文库中的代表性较低，不能被检测到高度富集。设计合成的寡核苷酸序列，并通过阵列法合成.在我们的摇瓶文库设计中考虑的一个因素是，在第一轮筛选中使用的40个氨基酸格式hgp 100微型基因可能与构成随机微基因库的16个氨基酸格式的微型基因相比，在MHC上具有更高的加工和呈现倾向。为了研究这一点，我们指定了三个不同的hgp 100微型基因，每一个长度为16个氨基酸，被包含在合成池中，而不是40个氨基酸版本。每个短版本hgp 100微型基因被构建，使最小的KVPRNQDWL最小表位被放置在微型基因的不同位置，同时也包含了位置特异性效应可以抑制特定微基因免疫原性的可能性。
将所合成的泛素文库插入含FRET报告的慢病毒转移质粒中，生成在EL4代靶细胞中表达的病毒，并对其进行PMEL-1TCR CTL筛选。对FACS中的微基因进行了扩增测序，结果表明，包含KVPRNQDWL表位的微基因是480个微基因中唯一在第二轮达到10σ阈值的微基因。 4B ).
此外，根据这些结果，我们得出的结论是，将最初的文库筛选实验中使用的40个氨基酸hgp 100微基因转换成一种反映随机微基因群体的格式，并不会抑制APC处理和呈现的最小表位的能力。为了进一步证实这种情况，我们构建了ova微基因的短格式版本，并确定当长格式的微基因与OT-i ctl而不是短格式的ctl共同培养时，在观察到的%fret-移位信号方面没有优势偏差(补充图)。 7 ).
多克隆T细胞群可作为输入效应物。 利用OT-Ⅰ和PMEL-1转基因小鼠品系进行的验证实验表明，将大量的单克隆T细胞群体作为微基因文库筛选实验的输入是可行的。然而，一个重要的实际考虑是，需要进行大量的初步努力来分离有兴趣的克隆T细胞群体。因此，当反应性T细胞存在于混合T细胞群体中时，我们考虑了在特定抗原刺激下T细胞反应性检测的极限，从而测试了我们的方法。
作为第一次试验，抗CD3/28刺激激活和扩增OT-I脾细胞、PMEL-1脾细胞和野生型C57BL/6脾细胞，并以不同比例的模型T细胞(OT-I或PMEL-1 TCR CTL)与野生型C57BL/6 CTL混合。这些混合的OT-I和pmel-1 TCR CTL细胞分别与表达Ova microgene-fret或hgp 100 microgene-fret盒的EL4细胞群共培养，并评估其是否有能力产生频移信号。在OT-ⅠCTL和PMEL-1 TCR CTL的情况下，观察到，随着微基因反应模型CTL丰度的降低，发生FRET移位的细胞比例也随之降低。然而，在这两种情况下，我们发现即使在1：3000丰度时，模型TCR CTL也能产生相对于野生型C57BL/6脾细胞单来源CTL的显著的频移信号(补充图)。 8 ).
接下来，我们使用针对CTL混合群体的目标细胞混合群体进行了表位检测。分别制备了三种不同的“混合+混合”共培养条件，对每一种模型的tcr/抗原对进行了筛选，并进行了微基因扩增测序。我们对原始读取数据进行了处理和分析，发现对于两种模型的TCR/抗原对，当T细胞稀释到1：30时，典型的微型基因从1：10 000的混合物中富集出10σ以上的背景(图1：30)。 5 ).
图5 筛选混合CTL群体+混合靶细胞群体的共培养。加入Ova微基因表达细胞或hgp 100微基因表达细胞的随机微基因文库分别与野生型C57BL/6 CTL与OT-I或PMEL-1 TCR CTL共同孵育。用于测试的特定混合物在面板报头中描述。以1：1的比例组合目标群体和CTL群体，共培养4h，然后按频移状态进行分类。将每种筛选条件下的移位门和未移位门回收的细胞进行裂解，并利用针对微基因位点两侧保守的转基因区的PCR引物，从基因组DNA中扩增整合的微基因。在第二轮PCR中加入Illumina适配器和指标，在IlluminaMiSeq平台上进行2×250对末端化学测序。 a Ot-I/OVA微基因混合物的移位门和解移门中检测到的所有不同的微基因序列相对丰度的差异。 b pmel-1 tcr/hgp 100微基因混合物的移位门和解移门中检测到的所有不同的微基因序列相对丰度的差异
在扩展这些研究的范围后，我们测试了当筛选和测序来自生物学背景的多克隆T细胞群体，而不是准备好的转基因T细胞和野生型T细胞群体时，我们从文库中检测抗原的能力。为此，我们将野生型C57BL/6小鼠移植到稳定表达全长Ova蛋白(B16F10-OVA)的B16F10肿瘤细胞或无OVA的亲本B16F10细胞中。肿瘤生长16天后，携带b16f10-ova肿瘤的小鼠要么接种ova蛋白。 41 以模拟积极的抗肿瘤反应的条件(补充图。 9 )或者没有接种疫苗。随后，我们在第21天从所有小鼠中分离出肿瘤组织，进行流式细胞术(FACS)分离CD8。 + 肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，经抗CD3/28刺激激活/扩增。无论是亲本b16f10肿瘤小鼠还是b16f10-ova小鼠，如果没有疫苗的增强，我们都无法扩增出足够数量的活的CD8。 + 用于筛选的细胞，表明这些小鼠没有对肿瘤抗原产生可检测的T细胞反应。
然而，我们能够从接种了OVA疫苗的B16F10-Ova小鼠中分离和扩增TIL。经四聚体染色，获得的TIL为1.77%~5.30%，H2kb/SIINFEKL四聚体阳性(3只小鼠平均为3.68%)(附图)。 10A )。在IL-2存在下，经抗CD3/28刺激和扩增后，将得到的T细胞与1 0 0 0份Ova刺激的随机微基因表达的EL4细胞共培养。共培养的靶细胞按FRET-移位状态进行分类(附图)。 10b，c )进行微基因扩增测序。结果表明，在3只复制小鼠的TIL标本中，Ova微基因在10σ的截止点以上再次被检测到，而在NO-CTL对照中未检测到OVA微基因的富集(如图1所示)。 6 ).
图6 以肿瘤浸润T细胞为输入效应的FRET移位/扩增序列分析。将b16f10-ova肿瘤块植入野生型c57bl/6小鼠体内，接种ova后，分离出浸润性CD8。 + 流式细胞术检测T细胞，平板结合抗CD3/28刺激进一步扩增T细胞，随机微基因文库细胞与Ova微基因表达细胞共培养1：10，000。制备了3只复制小鼠，并对每只小鼠的TIL样本进行了独立筛选。TIL种群的体内外生长有限，需要在缩短的E：t比下进行共培养，重复时间从0.5：1到0.7：1(4h长)。在TIL标本的同时，通过对未与任何T细胞共培养的尖峰库靶细胞进行FRET移位FACS/扩增测序，制备了相应的阴性对照样品。所有检测到的微基因的Δ相对丰度显示在三个复制TIL屏幕以及非T细胞控制。虚线表示比平均Δ相对丰度值高出10σ。
