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Bcl 10是Foxp 3开发和抑制功能所必需的+调节性T细胞

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发表时间:2019-10-07 14:22作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

Bcl 10是Foxp 3开发和抑制功能所必需的+调节性T细胞

摘要

Foxp 3+调节性T(Treg)细胞在外周耐受中起重要作用。Bcl 10作为Carma1-Bcl10-Malt1复合物中的一种支架蛋白,在TCR诱导的信号转导中起着关键作用,导致NF-κB活化,是T细胞活化所必需的。Bcl 10在传统T(Tconv)细胞中的作用已经有了很好的特征,但是Bcl 10在Treg细胞的发育和抑制功能的维持以及这些细胞的特性方面还没有很好的特征。在本研究中,我们发现Bcl 10不仅是Treg细胞发育所必需的,也是Treg细胞功能所必需的。在T细胞中删除Bcl 10后,我们发现Treg细胞的发育受到明显的损害。当成熟Treg细胞中Bcl 10被特异性缺失时,Treg细胞的抑制功能受到损害,导致Bcl 10细胞自身免疫受损。fl/flFoxp 3CRE老鼠。因此,与WT Treg细胞相比,Bcl 10缺乏Treg细胞并不能保护Rag1缺陷小鼠免受T细胞转移性结肠炎的影响。此外,Bcl 10缺陷的Treg细胞下调了一系列Treg细胞效应基因和抑制基因的表达,减少了效应细胞Treg-细胞的数量。此外,Bcl 10缺陷的Treg细胞转化为产生γ的促炎症细胞,转录因子T-bet和HIF-1α的表达增加。同时,我们的研究结果提供了遗传证据,表明Bcl 10是Treg细胞发育和功能所必需的。

导言

CD4+Foxp 3+调节性T细胞(Treg细胞)是T细胞的一个子集,在维持免疫和炎症反应的自我耐受性以及维持不同组织的免疫稳态方面发挥着关键作用。1,2它们由天然Treg细胞(nTreg细胞)和诱导Treg细胞(iTreg细胞)组成。自然的Treg细胞在胸腺中发育,然后转移到周围组织,而诱导的Treg细胞则来自CD4。+细胞因子如转化生长因子β刺激外周幼稚T细胞。3Treg细胞表达较高水平的IL-2受体α链(CD 25)和谱系定义转录因子Foxp 3。4,5,6,7重要的是,Foxp 3不仅是Treg细胞的重要标志,而且参与Treg细胞的分化和功能。Foxp 3表达不足导致Treg细胞的消融,导致小鼠和人类致死性自身炎症疾病的发生。5,6

在功能上,成熟的Treg-细胞群由具有不同分化模式的亚群体、静止中枢Tregs(CTregs)和效应Tregs(ETregs)组成,其抑制功能均受T细胞抗原受体(TCR)信号的控制。8,9cTreg细胞表达归巢受体CD62L,CD 44低表达,eTreg细胞高表达CD 44,缺乏CD62L表达。与cTregs相比,eTregs表现出一种效应样表型,其维持和抑制功能所需的蛋白质水平要高得多,例如ICOS、KLRG 1、CTLA-4和CD 44。9,10,11eTreg细胞通常比cTregs具有更强的免疫抑制能力,而eTreg细胞数量减少或功能缺陷往往与自身免疫性疾病有关。9,12,13,14胸腺及周围新近发展的Treg细胞具有幼稚静止的cTreg表型,但经同源Ag识别和炎症因子刺激后可转化为eTregs,而eTregs不能恢复为cTregs。10,11

Treg和传统的T(Tconv)细胞具有相反的生理功能,尽管它们起源于胸腺中相同的祖细胞,并且有许多相似的细胞表面受体和细胞内信号通路。T细胞受体(TCR)信号是Treg-细胞发育和Foxp 3表达所必需的,这与Tconv细胞的发育和分化所需的信号传递有很大的不同。15,16,17尽管大多数激活的分子信号是相同的,但在这两种相关的细胞类型上激活相同的TCR是如何导致这种不同的生物学现象,目前还不得而知。18此外,TCR刺激还能激活与T细胞发育相关的转录因子,如NF-κB和NFAT。19NF-κB是在多种信号(包括TCR信号)作用下激活的,在胸腺发育过程中起着关键作用,从而建立了Treg细胞的识别和抑制功能。20,21,22,23,24

当TCR激活与T细胞CD 28共刺激时,酪氨酸激酶ZAP 70启动导致PKCθ激活的下游事件。活化的PKCθ在适配器蛋白ADAP和PDK 1的控制下,直接磷酸化Carma 1(又称CARD 11)的连接区。25,26,27,28,29CARMA 1的磷酸化释放其分子内的自抑制状态,导致CARMA 1的激活。30,31此外,激活的Carma 1通过卡相互作用来激活Bcl10-Malt 1异二聚体,并导致CBM(Carma1-Bcl10-Malt1)信号复合物的类朊蛋白聚合。32所组装的CBM信号复合物作为控制泛素调节因子和蛋白激酶位置的中心支架,从而导致NF-κB和MAPK在T细胞中的激活。33CBM信号复合物在TCR信号转导中起着重要的作用,在调节特定T细胞亚群的分化中起着重要的作用。有趣的是,在稳态条件下,CBM复合物对于胸腺源性和外周Treg细胞的发育是必要的。34,35然而,Bcl 10调控Treg发育和功能的确切机制尚不清楚。

在本研究中,我们建立了bcl 10条件基因敲除小鼠(Bcl 10)。fl/fl)使用CRISPR-Cas9技术,并与CD4-cre杂交(标记为bcl 10)。fl/flCD4CRE)或Foxp3-YFP-cre(表示为Bcl 10)。fl/flFoxp 3CRE)小鼠特异性删除T细胞或成熟Treg细胞中的Bcl 10。在Bcl 10fl/flCD4CRE小鼠,T细胞中Bcl 10的缺失发生在阳性选择过程中,发生在Foxp 3的表达之前,从而导致Bcl 10在所有Treg细胞中的缺失,导致Treg细胞群体发育不全或缺失。此外,我们还在成熟的Treg细胞(Bcl 10)中特异性地删除了Bcl 10。fl/flFoxp 3CRE探讨Bcl 10在成熟Treg细胞活化和分化中的作用。我们发现Bcl 10调节成熟Treg细胞的抑制功能,并控制其从cTregs向eTregs的分化。此外,成熟的Treg细胞Bcl 10缺失导致其从抑制性细胞向促炎症细胞转化,而IFN-γ的表达水平则要高得多。我们的结果表明Bcl 10对Treg细胞的发育和免疫抑制功能是必不可少的。

结果

bcl 10是CD4的发展所必需的。+Foxp 3+Treg细胞

为了研究bcl 10在一种特定细胞类型中的生物学功能,我们产生了losp侧翼bcl 10等位基因(Bcl 10)的小鼠。fl/fl)使用CRISPR/Cas9技术(如图所示)。1A,b)。然后我们越过了Bcl 10号。fl/fl小鼠CD4CRE小鼠特异性删除T细胞中的Bcl 10。如预期的那样,Bcl 10中删除了Bcl 10。fl/flCD4CREPMA/ionomycin诱导的IκBα降解被阻断于Bcl 10的PAN T细胞中。fl/flCD4CRE老鼠(图1.1C)。重要的是,我们观察到CD4的比例和绝对数量显著下降。+Foxp 3+Bcl 10胸腺中的Treg细胞fl/flCD4CRE小鼠与Bcl 10小鼠比较fl/+CD4CRE老鼠(图1.1D,e)。始终如一,CD4+Foxp 3+Bcl 10的脾脏和淋巴结等外周器官中的Treg-细胞数也显著减少。fl/flCD4CRE小鼠与Bcl 10小鼠比较fl/+CD4CRE老鼠(图1.1F,g)。这些数据表明Bcl 10在胸腺和外周器官中对Treg细胞的发育都是必不可少的。

图1
figure1

Bcl 10是Treg细胞发育所必需的。a详细描述在方法和材料中。Bcl 10的示意图fl/fl鼠标生成显示。将两个氧氟沙星元件插入到内含子1和2中。bWT(Bcl 10)基因分型+/+),fl/+(Bcl 10)fl/+)和fl/fl(Bcl 10)fl/fl)用PCR法进行小鼠实验。cWT(来自CD4)CRE/BCL 10+/+小鼠和Bcl 10-条件性KO(来自CD4)CRE/BCL 10fl/fl用PMA(20 ng/mL)和离子霉素(200 ng/mL)刺激小鼠PAN T细胞,进行免疫印迹分析。dg8~10周龄的胸腺、脾脏和周围淋巴结CRE/BCL 10+/fl和CD4CRE/BCL 10fl/fl小鼠用流式细胞仪(FACS)分析。n=每组5人)。dFACS图显示CD4+Foxp 3+CD4门控细胞+CD8胸腺中的细胞。e用统计学方法对CD4进行评估。+Foxp 3+CD4细胞百分比(左)+CD8细胞数量和胸腺中的绝对数(右)。fFACS图显示CD4+Foxp 3+CD4门控细胞+CD8脾脏或周围淋巴结中的细胞。g用统计学方法对CD4进行评估。+Foxp 3+CD4细胞百分比(左)+CD8脾脏或周围淋巴结的细胞数量和绝对数目(右)。h, iCD4+CD 25CD 44CD62L+来源于Bcl 10的脾和淋巴结混合悬液中的幼稚T细胞+/flCD4CRE或BCL 10fl/flCD4CRE单用平板结合抗CD3/28抗体(5μg/mL)或小鼠IL-2(10μg/mL)和人TGF-β(2 ng/mL)刺激3d。门控CD4中检测到Foxp 3在活细胞中的诱导作用+细胞h,以及Foxp 3的摘要+百分比显示在i..学生的t试验作为统计检验(*)p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.005). All error bars represent SDs

为了证实这个在体内的发现,我们分离出了CD4。+来自Bcl 10的幼稚T细胞fl/flCD4CRE小鼠与Bcl 10fl/+CD4CRE并进行小鼠体外T细胞分化实验.我们发现Bcl 10缺失导致Foxp 3在抗CD3/抗CD 28抗体刺激(Th0)或Treg极化条件(ITreg)下表达严重缺陷。1H,I),表明Bcl 10也是诱导Tregs(ITregs)体外分化所必需的。

Treg细胞Bcl 10缺失导致自身免疫性炎症

为了研究Bcl 10在Treg细胞中的特异性功能,我们杂交了Bcl 10。fl/fl用Foxp3-cre小鼠删除Foxp 3中的bcl 10+细胞。BCL 10fl/flFoxp 3CRE小鼠按预期的孟德尔比例出生。然而,他们在生命的14天内发展出一种驼背的姿势和类似斑纹的表型,并在60天内死亡(见图)。2A,b)。BCL 10fl/flFoxp 3CRE小鼠表现为全身炎症,胸腺相对较小,脾肿大,淋巴结肿大,结肠炎。2C,d)。组织学分析显示,在耳尾真皮和肝、肾、肺和结肠组织中有大量的免疫细胞浸润和自身炎症病理(见图)。2E)。此外,bcl 10血清中IgE和促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α、IL-6和IL-1β水平均有系统地升高。fl/flFoxp 3CRE老鼠(图1.2F).

图2
figure2

Treg细胞中Bcl 10缺乏可导致致死性自身免疫性炎症。a不同基因型的24日龄幼龄雌性小鼠图片:bcl 10+/+Foxp 3CRE、BCL 10fl/+Foxp 3CRE,或BCL 10fl/flFoxp 3CRE. bBcl 10生存+/+Foxp 3CRE、BCL 10fl/+Foxp 3CRE,以及Bcl 10fl/flFoxp 3CRE老鼠(n每组分别=9、17和8)。c不同基因型的24日龄雌性小白鼠的胸腺、脾脏、腹股沟淋巴结、腋淋巴结、浅颈淋巴结和结肠的图像:bcl 10。+/+Foxp 3CRE,或BCL 10fl/flFoxp 3CRE. d24日龄Bcl 10的结肠长度+/+Foxp 3CRE,以及Bcl 10fl/flFoxp 3CRE老鼠(n=每组7人或6人)。e不同基因型24日龄小鼠耳尾皮肤及肝、肾、肺、结肠组织的h&E染色:bcl 10+/+Foxp 3CRE,或BCL 10fl/flFoxp 3CRE. fBcl 10血清中IgE、TNFα、IL-6和IL-1β水平的酶联免疫吸附试验(ELISA)分析+/+Foxp 3CRE (n=8)或BCL 10fl/flFoxp 3CRE (n=7)老鼠在第24天。学生的t试验作为统计检验(*)p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.005). All error bars represent SDs

此外,效应细胞CD4的百分比和数量+和CD8+Bcl 10脾脏及周围淋巴结T细胞显著增加。fl/flFoxp 3CRE小鼠与Bcl 10比较+/+Foxp 3CRE老鼠,而天真的CD4+和CD8+T细胞数量大幅度减少(如图所示)。3A、b、e和f)。始终如一地,在脾脏和周围淋巴结中,产生干扰素γ的CD4。+和CD8+T细胞在比例和绝对值上也显著增加,尽管CD8的百分比也显著增加。+淋巴结中的细胞没有增加。3C、d、g和h)。这些数据表明Bcl 10在Treg细胞中的表达对维持宿主体内的平衡和免疫稳态是必不可少的。

图3
figure3

Treg细胞Bcl 10缺乏导致T细胞过度活化。24日龄Bcl 10的脾脏及周围淋巴结+/+Foxp 3CRE或BCL 10fl/flFoxp 3CRE小鼠用流式细胞仪(FACS)分析。n=每组5人或4人)。a典型CD 44和CD62L在脾脏CD4中的表达+和CD8+T细胞b朴素的百分比(左)和绝对数(右)(CD 44)罗氏CD62L)和效应器(CD 44)CD62L罗氏)脾CD4+或CD8+T细胞c干扰素γ产生CD4的代表性数据+或CD8+体外用PMA(50 ng/mL)和离体霉素(500 ng/mL)刺激脾T细胞4h。d干扰素γ产生CD4的百分比(左)和绝对数(右)+或CD8+体外用PMA(50 ng/mL)和离体霉素(500 ng/mL)刺激脾T细胞4h。e代表CD 44和CD62L在CD4中的表达+和CD8+外周淋巴结T细胞。f朴素的百分比(左)和绝对数(右)(CD 44)罗氏CD62L)和效应器(CD 44)CD62L罗氏)外周淋巴结CD4+或CD8+T细胞g干扰素γ产生CD4的代表性数据+或CD8+外周淋巴结T细胞。h干扰素γ产生CD4的百分比(左)和绝对数(右)+或CD8+外周淋巴结T细胞。学生的t采用统计学检验(N.S.)。=无意义*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.005). All error bars represent SDs

Bcl 10是Treg细胞抑制功能所必需的

其次,我们研究了Bcl 10缺陷Treg细胞在过继性T细胞转移诱导结肠炎模型中的抑制作用。我们转移了CD45.1+CD4+幼稚T细胞单独或与WT或Bcl 10缺乏的Treg细胞进入Rag1−/−接受者老鼠。与WT Treg细胞相比,Bcl 10缺乏的Treg细胞不能保护受体小鼠的体重减轻和肠道病理改变(图1)。4A,b)。此外,单纯转移的幼稚T细胞或Bcl 10缺乏的Treg细胞处理的小鼠脾肿大和肠系膜淋巴结肿大明显,而WT Treg细胞移植的幼稚T细胞处理的小鼠则无明显的脾肿大和肠系膜淋巴结肿大。与这一发现相一致的是,单纯转移的幼稚T细胞或Bcl 10缺陷的Treg细胞诱导了更多的CD 45.1细胞。+受体小鼠肠道固有层和脾脏中的IFNγ-和IL17A产生细胞均较WT-Treg细胞转移的幼稚T细胞为高(见图)。4C,d).

图4
figure4

Bcl 10是Treg细胞抑制功能所必需的。CD45.1+CD4+CD 25-CD 44-CD62L+从CD 45.1的脾脏和淋巴结中分离出幼稚T细胞。+小鼠和CD 45.2+CD4+YFP+从Bcl 10中分离出Treg细胞+/+Foxp 3CRE(WT)或BCL 10fl/flFoxp 3CRE(Ko)老鼠。将朴素T细胞(朴素T+PBS)或WT Treg(朴素T+WT Treg)或KO Treg(朴素T+KO Treg)细胞静脉注入Rag1。−/−接受者老鼠。a体重变化−/−受体小鼠在T细胞转移诱导结肠炎模型中接受不同组合的T细胞。bRag1小肠的H&E染色−/−受体小鼠在接受不同T细胞组合后18周。c干扰素γ-和IL17A产生CD45.1的绝对数量+PMA(50 ng/mL)和离体霉素(500 ng/mL)体外刺激大肠固有层T细胞4h。d干扰素γ-和IL17A产生CD45.1的绝对数量+体外用PMA(50 ng/mL)和离体霉素(500 ng/mL)刺激脾T细胞4h。ef体外Treg细胞抑制试验:cfse标记的幼稚CD4+T细胞(来自CD 45.1)+单独培养或与WT共培养(来自Bcl 10)+/+Foxp 3CRE小鼠)或KO(来自Bcl 10)fl/flFoxp 3CRE小鼠)1:1的Treg细胞e或2:1f照射脾细胞与抗CD3抗体的比值。学生的t试验作为统计检验(*)p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.005). All error bars represent SDs

此外,我们还用cfse标记的CD45.1进行了体外Treg细胞抑制实验。+CD4+单纯T细胞或WT(来自Bcl 10)+/+Foxp 3CRE小鼠)或Bcl10KO(来自Bcl 10)fl/flFxop 3CRE结果表明,Bcl 10缺陷的Treg细胞具有抑制功能缺陷(图1)。4E,f)。这些数据表明Bcl 10是维持Treg细胞抑制功能所必需的。

Bcl 10维护Treg细胞的身份和规定

一般来说,Treg细胞负责维持免疫稳态,并在bcl 10中观察到表型。fl/flFoxp 3CRE小鼠表现为Treg介导的稳态的严重丢失。的确,BCL 10fl/flFoxp 3CRE与Bcl 10相比,24日龄小鼠脾脏中Treg细胞的百分率和绝对值均有所下降。+/+Foxp 3CRE老鼠(图1.5A)。在周围淋巴结中,Treg频率降低,但绝对数目减少(图1)。5A)。值得注意的是,Bcl 10的淋巴结fl/flFoxp 3CRE小鼠明显增大(见图)。2C)。这些结果提示Bcl 10在维持Treg细胞的数量中起着一定的作用。此外,在Bcl 10中,效应细胞Treg(ETreg)细胞数量显著减少,中心Treg(CTreg)细胞数量显著增加。fl/flFoxp 3CRE小鼠与小白蚁Bcl 10的比较+/+Foxp 3CRE老鼠(图1.5B)。虽然效应器tconv细胞数量增加,但在bcl 10中,朴素tconv细胞数量却减少了。fl/flFoxp 3CRE这些结果与图中报道的数据一致。3A(无花果)5B)。这些结果表明Bcl 10参与了cTregs向eTregs的转化过程。

图5
figure5

Bcl 10对于维持Treg细胞的身份和数量是必不可少的。24日龄Bcl 10的脾脏及周围淋巴结+/+Foxp 3CRE或BCL 10fl/flFoxp 3CRE小鼠用流式细胞仪(FACS)分析。n=每组5、4或3)。aFACS图代表CD4+CD 25+Foxp 3+(Treg)CD4上的门控细胞+CD8脾脏或周围淋巴结中的细胞(以上)。用统计学方法对CD4进行评估。+CD 25+Foxp 3+CD4细胞百分比+CD8细胞数量和脾脏或周围淋巴结的绝对数目(见下文)。bFACS图表示效应者(CD 44)CD62L罗氏)和天真或中央(CD 44)罗氏CD62L)CD4上的门控细胞+YFP(Foxp 3))(以上)或CD4+YFP+(Foxp 3)+)脾脏和淋巴结中的细胞(上图)。用统计学分析来评估效应因子(CD 44)。CD62L罗氏)和天真或中央(CD 44)罗氏CD62L)CD4中的细胞百分比+YFP-(Foxp 3)-)(以上)和CD4+YFP+(Foxp 3)+)(以下是脾脏和淋巴结中的细胞群。cWT(来自BCL 10)+/+Foxp 3CRE小鼠)和Bcl10KO(来自Bcl 10)fl/flFOXPCRE用PMA(20 ng/mL)和离子霉素(200 ng/mL)刺激小鼠Treg细胞,进行免疫印迹分析。dFACS地块代表KLRG+CD4门控细胞+YFP+脾脏和淋巴结中的细胞。eKLRG的百分比+CD4门控细胞+YFP+脾脏和淋巴结中的细胞(WT:Bcl 10)+/+Foxp 3CRE老鼠(n=4),KO:Bcl 10fl/flFoxp3cre小鼠(n(3)如图所示。fgKlrg 1,Icos的mRNA水平f、Tgfb 1、Il-10、rel、IRF 4、Nrp 1、Foxp 3和Bcl 10g用qrt-PCR法测定wt(来自bcl 10)。+/+Foxp 3CRE小鼠)和KO(来自Bcl 10)fl/flFoxp3cre小鼠)Treg细胞(CD4)+YFP+(平均±扫描电镜,n=3)。学生的t采用统计学检验(N.S.)。=无意义*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.005). All error bars represent SDs

其次,我们发现在Bcl 10缺乏的Treg细胞中,IκBα降解被阻断。5C),显示出与Tconv细胞相似的趋势(见图)。1C)。提示NF-κB激活在Bcl 10缺乏的Treg细胞中具有抑制作用,在Treg细胞的发育过程中起着关键的作用,并决定着eTreg细胞的大小。21,24此外,在Bcl 10细胞中,效应基因KLRG 1在Treg细胞中的表达也显著降低。fl/flFoxp 3CRE小鼠与Bcl 10小鼠比较+/+Foxp 3CRE老鼠(图1.5D,e)。一直以来,Klrg 1以及另一个关键效应基因,ICOS,Bcl 10 KO Treg细胞与WT Treg细胞相比也有明显下调(图1)。5F)。我们还发现了其他一些与Treg相关的抑制基因,例如Tgfb 1, 伊-10, 瑞尔IRF 4,在Bcl 10中表达减少。fl/flFoxp 3CRETreg细胞(图1.5G)。此外,我们观察到Foxp 3BCL 10Bcl 10 mRNA的表达fl/flFoxp 3CRE第24天的Treg细胞。5G).

鉴于eTreg群体是控制自身反应性T细胞的关键,我们对CD 45.1进行了体外抑制试验。+CD4+从Bcl 10中分离eTregs和cTregs的幼稚T细胞+/+Foxp 3CRE(WT)或BCL 10fl/flFoxp 3CRE(Ko)小鼠按一定比例。虽然eTreg细胞表现出比cTregs更好的抑制功能,但我们发现在eTregs和cTregs中,抑制功能都需要Bcl 10(图1)。6A)。此外,我们还从Bcl 10中分离出了eTregs和cTregs。+/+Foxp 3CRE(WT)或BCL 10fl/flFxop 3CRE(Ko)小鼠用抗CD3/CD 28抗体和IL-2刺激48 h,一致观察到bcl 10缺陷的eTreg和cTreg细胞表达缺陷。BCL 10, Foxp 3, Tgfb 1, Klrg 1,ICOS但表达增加IFNG(无花果)6B)。总之,这些数据表明Bcl 10对于eTregs和cTregs的开发和功能都是必不可少的。

图6
figure6

Bcl 10在eTreg细胞和cTreg细胞中都有功能。acfse标记cd4对eTreg和cTreg细胞的体外抑制试验+幼稚T细胞(来自CD 45.1)+小鼠)单独培养或与WT-eTreg、WT-cTreg共同培养(来自Bcl 10)。+/+Foxp 3CRE,KO-eTreg或KO-cTreg(来自Bcl 10)fl/flFoxp 3CRE在照射脾细胞和抗CD3抗体存在的情况下,小鼠(小鼠)细胞在指示的比例下。b用qRT-PCR方法检测tgfb 1、klrg 1、icos、ifng、Foxp 3和bcl 10 mRNA在WT(Bcl 10)中的表达。+/+Foxp 3CRE小鼠)和KO(来自Bcl 10)fl/fl(FOXp3cre小鼠)eTreg或cTreg细胞(平均±SEM,n=3)。学生的t试验作为统计检验(*)p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.005). All error bars represent SDs

有趣的是,效应分子CD4的频率增加了。+T细胞倾向于干扰素γ分泌T辅助1(Th1)细胞在脾脏和LNS(图)。3C,g)和Bcl 10缺失的Treg细胞,这些细胞来源于Bcl 10的脾脏或外周淋巴结。fl/flFoxp 3CRE小鼠,分泌比bcl 10中的Treg细胞分泌更多的干扰素γ。+/+Foxp 3CRE老鼠(图1.6B、图1.7a,b)。考虑到NF-κB在Treg细胞中的消融导致炎性细胞因子IFN-γ的表达增加21而Treg细胞中Bcl 10的缺失导致NF-κB的失活(图1)。5C)Bcl 10缺失的Treg细胞中IFNγ的表达增强可能部分是由于NF-κB信号受损所致。此外,Bcl 10在Treg细胞中的丢失导致Nrp 1(Neuropilin-1)表达下降(图1)。5G),阻断Nrp 1在Treg细胞上的表达,可提高IFNγ的表达频率。+Treg细胞36提示Bcl 10在Treg细胞中也可能部分调节IFNγ的表达,并以一种神经肽-1依赖的方式表达。另一方面,Foxp 3可以直接抑制干扰素γ的表达,芯片分析检测到Foxp 3与Spp1基因座,编码1型细胞因子骨桥蛋白。37,38在Bcl 10缺乏的Treg细胞中,As Foxp 3的表达受到抑制。5A,gFOXP 3的丢失增强了IFNγ的表达。总之,Bcl 10对干扰素γ表达的影响是上下文依赖性的。

图7
figure7

Bcl 10缺陷的Treg细胞转化为促炎细胞。24日龄Bcl 10的脾脏及周围淋巴结+/+Foxp 3CRE或BCL 10fl/flFoxp 3CRE小鼠用流式细胞仪(FACS)分析。n=每组5、4或3)。a干扰素γ产生CD4的代表性数据+Foxp 3+干扰素γ+CD4门控Treg细胞+Foxp 3+PMA(50 ng/mL)和离体霉素(500 ng/mL)体外刺激脾脏或周围淋巴结Treg细胞4h。b干扰素γ产生CD4的百分比+Foxp 3+CD4的Treg细胞+Foxp 3+PMA(50 ng/mL)和离体霉素(500 ng/mL)体外刺激4 h后,脾脏(以上)或周围淋巴结(以下)可见Treg细胞。cdT-bet和HIF-1α在Treg细胞(CD4)中的表达+Foxp 3+)在Bcl 10的脾脏和外周淋巴结中。+/+Foxp 3CRE或BCL 10fl/flFoxp 3CRE老鼠。流式细胞仪检测细胞平均荧光强度(MFI)。c,计算了这些值,并给出了c显示在d. eFACS图表示门控CD4中IFNγ和T-bet(以上)或HIF-1α(以下)的表达水平+Foxp 3+脾脏和淋巴结的Treg细胞。fCD4中干扰素γ和T-bet表达水平及HIF-1α阳性细胞百分率的统计分析+Foxp 3+脾脏和淋巴结的Treg细胞。学生的t试验作为统计检验(*)p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.005). All error bars represent SDs

与Th1细胞相似,Bcl 10缺陷的Treg细胞转录因子T-bet的表达也明显增加(图1)。7C,D)。因此,T-bet通过直接诱导干扰素γ等相关基因的转录来协调Th1细胞的发育和功能。39,40此外,T-bet在Treg细胞中表达,并驱动IFN-γ的表达,这是Treg细胞功能所必需的。41,42此外,据报道,hif-1α通过与巨噬细胞中的干扰素γ启动子直接结合而诱导干扰素γ的产生。43HIF-1α还直接与VHL-缺乏的Treg细胞中的IFN-γ启动子结合,增加了IFN-γ的生成,抑制功能受损。44此外,VHL缺陷的Treg细胞也显示T-bet和T-bet驱动的IFNγ表达增加.44我们还发现,在Bcl 10缺乏的Treg细胞中,HIF-1α的表达水平高于WT Treg细胞(图1所示)。7C和6d)。此外,bcl 10缺乏导致干扰素γ大量增加。+T-打赌+和干扰素γ+HIF-1α+Treg-细胞脉冲(图1.7E,f)。此外,我们还用HIF-1α抑制剂PX-478联合抗CD3/抗CD 28抗体刺激WT和KO Treg细胞,结果表明,PX-478处理后,HIF-1α表达略有下调,γ产量部分降低(补充图)。1A和1B)。因此,bcl 10缺陷的Treg细胞从抑制性免疫调节细胞型转化为bcl 10中分泌γ的致病细胞型。fl/flFoxp 3CRE可能与转录因子T-bet和HIF-1α的表达有关.

讨论

常规细胞和Treg细胞在调节适应性免疫反应方面发挥着完全相反的作用,尽管它们是从相同的祖细胞发展而来,并且有许多相似的受体和信号传导途径。Bcl 10通过介导NF-κB的激活来调节Tconv细胞的发育和功能,其机制是通过激活TcR信号后形成CBM信号小体来调节TCOV细胞的发育和功能。在这项研究中,我们专门删除了CD4中的bcl 10。+T细胞或Treg细胞,发现Bcl 10是Treg细胞发育和抑制功能所必需的。BCL 10fl/flFoxp 3CREBcl 10在Treg细胞中特异性缺陷的小鼠,表现出严重的致死性自身免疫性疾病。在缺乏功能性Treg细胞的情况下,Tconv细胞是不受监管和过度激活的。相反,与Bcl 10不同fl/flFoxp 3CRE小鼠,Bcl 10fl/flCD4CREBcl 10在所有T细胞中缺失的小鼠,没有表现出自身免疫性疾病。在Treg细胞中有条件地删除Bcl 10可导致由于Treg细胞功能受损而导致的严重的自身免疫性疾病,而在所有T细胞中系统地删除Bcl 10并不会引起自身免疫反应。这是因为Bcl 10在Tconv和Treg细胞中扮演TCR信号下游的角色,控制它们的发育和激活。

Bcl 10缺陷的Treg细胞在体内T细胞转移诱导结肠炎模型和体外Treg抑制实验中表现出高度的免疫抑制功能。Bcl 10中的Treg细胞fl/flFoxp 3CRE小鼠表现出较少的效应基因和抑制基因的表达,包括ICOS, Klrg 1,Tgfb 1,Il-10,和IRF 4,具有高抑制功能的eTregs的数量减少,从抑制性细胞型向促炎症细胞型转变,并高表达炎症因子IFN-γ。此外,Bcl 10缺陷的Treg细胞在NF-κB活化和Foxp 3、Nrp 1的表达中均受到抑制,这都是Bcl 10缺失Treg细胞功能紊乱的原因之一。

在我们目前的研究中,有几项研究45,46,47报道了Treg细胞中CBM复合物特异性缺陷的表型。他们发现在Carma 1缺乏的Treg细胞中,IFNγ的表达增加。fl/flFoxp 3CRE小鼠,只部分依赖转录因子T-bet。46一致地,我们还发现干扰素γ和T-bet在Bcl 10缺乏的Treg细胞中的表达增加.此外,我们还观察到在Bcl 10缺乏的Treg细胞中HIF-1α的表达增加.当VHL缺陷的Treg细胞转化为Th1样效应T细胞时,转录因子低氧诱导因子1α(HIF-1α)直接调控高表达IFN-α的T细胞,44Carma 1缺陷的Treg细胞转化为产生γ的细胞可能也部分依赖于HIF-1α的激活。尽管T-bet对IFN-γ在Treg细胞中的表达的影响已经被证明是Treg细胞功能所必需的。41,42许多研究也表明,Treg细胞产生干扰素γ会引起Th1反应和组织损伤。44,46,48,49,50

通过对人原发性免疫缺陷的鉴定,证实了Bcl 10缺陷小鼠的表型,表明Bcl 10的功能在小鼠和人之间高度保守。51在Bcl 10异常表达引起的炎症或恶性肿瘤中,抑制Bcl 10相关信号可以减轻银屑病、结肠炎等疾病的炎症反应。我们的发现,特别是干扰Bcl 10信号在Treg细胞导致抑制Treg功能可能是一种治疗方法的癌症免疫治疗。例如,Treg细胞抑制抗肿瘤免疫,据报道肿瘤环境显示,与未注入CAR-T细胞相比,EGFRvIII CAR-T细胞输注处理的肿瘤标本中Treg-细胞数量增加。然而,还不清楚这些Treg细胞是从哪里来的。52然而,直接消除Treg细胞并不能增强免疫治疗效果,因为凋亡Treg细胞介导了更好的免疫抑制。53因此,删除Treg细胞中的Bcl 10可能是增强CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中的作用的有效途径。

材料和方法

小鼠

所有小鼠都被安置在清华大学屏障设施中的隔离通风笼子中(每笼最多6只老鼠)。小鼠在22~26°C下维持12/12小时的光/暗循环,无菌颗粒食物和水供应Libitum。该实验动物设施通过了国际实验动物保护评估与认证协会(AAALAC)的认证,清华大学动物保护与使用机构委员会(IACUC)批准了本研究中使用的所有动物规程。CD4CRE、Foxp 3CRE-YFP,和Rag1−/−小鼠是由清华大学陈东教授提供的。CD45.1+小鼠是由清华大学李伍教授提供的。

Bcl 10代fl/fl小鼠

BCL 10fl/fl以C57BL/6为背景,采用CRISPR/Cas9技术制作小鼠模型。单导RNA(SgRNA)靶向序列(补充表)I)是通过使用在线工具(http://crispr.mit.edu/)合成了化脓性链球菌引导RNA效率的目标检测试剂盒(查看固体生物技术)。然后,用MEGA短脚本T7转录试剂盒和mMESSAGE mMACHINE T7超转录试剂盒(LifeTechnologies),体外转录sgRNA和Cas9mRNA。用MEGAclearKit(LifeTechnologies)纯化sgRNA和Cas9mRNA,并将其溶于无RNase的水中。供体DNA是在上海Sangon生物技术公司合成的,由含有氧氟沙普序列的单链寡核苷酸组成。最后,将含sgRNA(20 ng/ml)、Cas9mRNA(40 ng/ml)和供体寡核苷酸(60 ng/ml)的混合物注入受精卵。微注射是在清华大学实验动物研究中心完成的。用手工设计的特异性引物(补充表)对小鼠进行基因分型。I),并经TA克隆(Transgen Biotech)和测序证实。

流式细胞术和细胞分类

相关的协议和抗体信息已经被描述过了。47

体外Treg细胞分化

CD4+T细胞经脾单个细胞悬液和Bcl 10淋巴结中的Miltenyi CD4(L3T4)微球富集。+/+CD4CRE或BCL 10fl/flCD4CRE老鼠,然后是CD4+CD 25CD 44CD62L+采用流式细胞术(BD FACSAriaII)对朴素T细胞进行分类。在完整的Roswell Park纪念研究所(LifeTechnologies)1640培养基中培养幼稚T细胞,单独用5μg/mL平板包被抗CD3/CD 28抗体(Th0条件)或在小鼠IL-2(10μg/mL)和人TGF-β(2ng/mL)(Treg条件)存在下刺激。48小时后,如有需要,加入0.5 mL新鲜培养基。72h后,收集细胞,进行荧光活化细胞分选(FACS)分析。

体外Treg抑制试验

cfse标记CD 45.1+CD4+幼稚T细胞(4×10)5细胞/mL,50μL)单独或与不同比例的Treg细胞(50μL)在2×10存在下共培养6细胞/mL(50μL)照射30只灰脾细胞,在96孔U底板中加入4μg/ml抗CD3抗体(50μL)。3天后检测CFSE稀释度,显示其抑制Treg细胞的能力。

免疫印迹分析

T细胞在含50 mM HEPES(pH7.4)、150 mM NaCl、1%nonidet P-40、1mm edta、1mM Na的NP-40裂解缓冲液中溶解。3Vo4、1 mm NaF、1 mm PMSF和一种蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断学,4693116001)。细胞裂解液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和westernblot分析。用10%SDS-PAGE凝胶对样品进行煮沸和分离,并将其转移到硝化纤维素膜上.免疫印迹用特异性原抗体孵育,然后与HRP结合的次级抗体孵育。然后,根据制造商的配方(默克·米利波,WBKLS 0500),采用增强化学发光法制备。

酶联免疫吸附试验

用ELISA试剂盒(EBioscience)测定小鼠血清中抗自身抗原的免疫球蛋白。

组织学

来自Bcl 10的耳朵或尾巴的皮肤和肺、肝、肾和结肠的组织样本。+/+Foxp 3CRE或BCL 10fl/flFoxp 3CRE用4%多聚甲醛固定液(Solarbio,P 1110-500)固定小鼠24 h,并在武汉Google生物技术有限公司进行H&E染色。

T细胞转移诱导结肠炎模型

CD45.1+CD4+CD 25CD 44CD62L+根据CD 45.1中Treg细胞体外分化的程序,对原始T细胞进行分类。+老鼠。CD45.2+CD4+CD 25+YFP+Treg细胞是从Bcl 10中分离出来的。+/+Foxp 3CRE或BCL 10fl/flFoxp 3CRE老鼠。总计5×105单纯或1×10的幼稚T细胞5将WT或Bcl 10 KO Treg细胞静脉注入受体Rag1。−/−老鼠。每周监测体重变化,取小肠和脾脏进行H&E染色和FACS分析。

实时定量PCR

冷冻小鼠组织标本或细胞直接溶解在TRIzol中(Invitrogen,15596018).提取总RNA,用Revertaid First Strand cDNA合成试剂盒(Thermo Science)进行逆转录。采用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统)和PowerSYBR绿色PCR主混合系统(Genestar)进行定量PCR。将结果归一化为GAPDH,用2-ΔΔCT法进行定量。PCR采用以下引物:

IRF 4,5‘-TCCTCTGGATGCTCCAGATG-3’(前进)和5‘-CACAAAGCAGAGTCACCT-3’(反向);

IL-10,5‘-ATACTGCACCCACTTCCCAGTC-3’(前进)和5‘-CCCAAGTACTACTAAGTCCTGC-3’(反向);

Tgfb 1,5‘-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3’(前进)和5‘-CTGCGATATTTTGAC-3’(反向);

IFNG,5‘-GCCAGCAGCAGTCATTTGA-3’(前向)和5‘-TGCTGATGCCTGATTTCTT-3’(反向);

Klrg 1,5‘-GGACGAATGGTAGCCAC-3’(前进)和5‘-GTAAGGATGGTAGCCAC-3’(反向);

REL,5‘-CAACTGGAAGGAAGGAAGATTCA-3’(正向)和5‘-TGGAACTCCTGAAGACCTG-3’(反向);

Nrp 1,5‘-ACCTCATCTCCCGGTTACC-3’(前进)和5‘-AAGGGCAATCTCCCACAGA-3’(反向);

ICOS,5‘-ATGAAGCCTACTTCTGCCG-3’(前进)和5‘-CGTTTTTACTCTGCTGGACAG-3’(反向);

BCL 10,5‘-TCCCTCACGGAGGAGGATTG-3’(正向)和5‘-ACTCCCACCCGTTCTAC-3’(反向);

Foxp 3,5‘-CACCTATCACTTATCCG-3’(前进)和5‘-CATGGATAAACCAATGGTAGA-3’(反向);以及

GAPDH,5‘-AACAACTCCCACTCTTC-3’(向前)和5‘-CCTTTGCTGTAGCCGTAT-3’(反向)。

统计分析

年龄和性别匹配的小鼠被随机分配进行实验。所有实验所用的动物数量在相应的图中都有概述。没有动物被排除在统计分析之外,研究人员在研究中也没有被蒙蔽。未采用统计学方法预先确定样本量。所有研究至少独立进行三次。结果为平均±S.E.M。用两尾不成对的学生对不同的群体进行比较。t检验或单因素方差分析。差异被认为具有统计学意义P < 0.05.



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