阴道炎在妇女中非常常见，尤其是育龄妇女，并与早产和盆腔炎的风险显著增加有关。阴道菌群失调是阴道炎的主要原因，促进阴道感染的发生和发展。然而，人们对负责任的机制仍然知之甚少。小鼠阴道炎模型大肠杆菌感染的发生与阴道感染的进展密切相关，microRNA 1976的表达降低，CD 105和整合素αvβ6的表达增加。重要的是，我们首次证明了microRNA 1976/CD 105/整合素αvβ6轴调控。大肠杆菌-小鼠阴道感染，这一发现证明了这一点大肠杆菌-诱导的阴道感染可被microRNA 1976过表达所逆转，而CD 105过表达则使感染加剧。CD 105和整合素αvβ6在腺病毒载体治疗的小鼠阴道炎模型中被进一步证实。综上所述，我们的数据表明microRNA1976负调控。大肠杆菌-至少部分通过抑制CD 105和整合素αvβ6的表达而诱导小鼠阴道感染。这些发现可以提供新的洞察机制。大肠杆菌-诱导性阴道炎，确定一个新的诊断生物标志物和潜在的治疗目标菌群不平衡相关阴道炎。

一种健康的阴道微生物被认为是维持阴道黏膜稳态和阴道健康以及预防感染的重要因素。1..细菌不平衡是指机体某些部位由于宿主和外界环境的影响，在正常菌群中的数量和质量发生变化。阴道微生物群的破坏或失调可能导致许多泌尿生殖系统疾病，包括好氧阴道炎和细菌性阴道病。1..阴道炎或阴道感染在妇女中普遍存在，是妇女寻求医疗的一个共同原因。乳酸菌是正常阴道菌群的主要细菌。细菌不平衡会导致机会性病原体的繁殖，包括细菌、真菌和原生动物，这些都会导致阴道疾病。阴道炎与早产、死产和盆腔炎的风险显著增加有关。2,3据报道，可能与子宫感染、宫颈发育不良、产后感染风险增加以及人类免疫缺陷病毒(Hv)和单纯疱疹病毒2的感染和传播有关。2,4,5,6..尽管阴道炎，包括有氧性阴道炎和细菌性阴道炎，已经研究了超过15年。7，其基本机制仍未得到充分的了解。

粘膜稳态的维持，包括阴道粘膜、口腔粘膜和肠道粘膜的内稳态，需要通过各种调节网络来阻止微生物和细菌等威胁。8..最近，越来越多的证据表明，microRNAs(MiRNAs)是控制这些调控网络的关键，有助于维持黏膜屏障的完整性，平衡感染和炎症反应。9,10,11..大量研究表明，miRNAs在口腔、肠道、食道和鼻黏膜等粘膜疾病的粘膜感染和黏膜炎症中起着重要的调节作用。12,13,14,15,16,17..然而，miRNAs在由菌群失调和维持粘膜稳态引起的阴道感染中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探讨miRNAs在阴道炎中的作用。大肠杆菌(大肠杆菌)感染。

MiR 1976(MIMAT0009451)，20个核苷酸，位于染色体1p36.11上。18..文献表明mir 1976可作为肿瘤抑制因子，并可作为非小细胞肺癌的预后指标。18,19..MiR 1976被认为是子宫内膜癌患者整体生存的有效预测因子，也被报道与某些牛传染病有关。20,21..然而，miR 1976对炎症调节和阴道感染的影响仍未确定。我们先前的研究发现，miR-1976在阴道炎妇女粘膜组织中的表达明显低于健康妇女。因此，本研究旨在探讨mir 1976在慢性阴道炎中的作用。大肠杆菌进一步探讨感染的潜在机制。

生物信息学分析表明，转化生长因子受体CD 105(Endoglin)是miR 1976的靶基因。CD 105是转化生长因子受体家族成员之一，与阴道感染密切相关。22..转化生长因子-β通路参与调节感染和炎症反应的信号网络，包括阴道念珠菌病、慢性结肠炎和脊髓神经炎症。23,24,25..几种miRNAs，如miR-499，miR-148 b，miR-24和miR-122，都能与转化生长因子-β信号通路的某些元件结合，包括转化生长因子-β受体1，smad 2和smad 4。26,27,28..此外，有证据表明CD 105在血管生成、血管疾病、炎症、感染等方面发挥着重要作用。29,30,31..例如，Unger等人.32发现CD 105与疟疾感染引起的不良妊娠结局有关。小宝等人.33通过调节CD 105，揭示miR-149-5p在子痫前期发病中的重要作用。此外，一些miRNAs，如mir-1287和mir-342-5p，已被报道可调节CD 105，并在血管生成、细胞增殖和成骨潜能方面发挥重要作用。34,35..然而，CD 105在阴道感染中的作用大肠杆菌还不清楚。

黏膜表面的定植是大多数粘膜细菌感染的重要起始步骤。据报道，整合素可促进有效的黏膜定植，是预防或治疗细菌感染的潜在靶点。22..通过与整合素、细菌或病毒相互作用，促进宿主细胞与基底膜的粘附，进而导致或加重粘膜感染。36,37..粘膜上皮细胞的快速更新和脱落是保护黏膜免受细菌感染的机制之一。金姆等人.37发现整合素连接激酶缺陷时，细菌定植和粘附受到抑制.另一项研究发现B组链球菌侵袭上皮细胞与整合素αv有关。38..阴道感染可促进人阴道上皮细胞中CD 105的表达和整合素活性，而与野生型CD 105转导的人阴道上皮细胞中整合素β1活性增强。22..罗西等人.39发现CD 105与整合素α5β1的相互作用在炎症过程中起调节作用。在这里，我们的目的是验证mir 1976这个潜在的治疗阴道炎的靶点是否在大肠杆菌-通过调节CD 105/整合素轴诱发阴道炎。

目的探讨miR 1976/CD 105/整合素αvβ6轴在阴道感染中的作用。大肠杆菌..我们发现在感染的阴道组织中miR 1976的表达明显下降。大肠杆菌..相反，大肠杆菌感染可显著提高CD 105和整合素αvβ6的表达。腺病毒过度表达实验表明，miR 1976的过表达可抑制CD 105和整合素αvβ6的表达并逆转。大肠杆菌-小鼠阴道感染。总的来说，这些结果表明miR 1976负调控。大肠杆菌-至少部分通过抑制CD 105和整合素αvβ6在小鼠体内引起阴道感染。这些发现为进一步了解阴道炎的发病机制提供了新的思路。大肠杆菌感染并可能开辟治疗和预防阴道炎的新途径。

阴道灌注大肠杆菌小鼠阴道感染

建立小鼠模型大肠杆菌阴道感染，雌性NIH小鼠阴道感染1×10。10CFU大肠杆菌为期4、7、14和21天。在阴道炎诱导后，感染小鼠的行为以及排泄量和尿量都没有改变。虽然对照组和实验组的体重没有差别，但实验组小鼠的皮毛比较稀疏、蓬松和钝(附图)。沙一)。然而，人类阴道炎的特征，如阴道发红和肿胀，在大肠杆菌-感染小鼠(附图)。S1b)。小鼠阴道直接灌洗液的革兰染色结果显示革兰阴性球菌(大肠杆菌)(附图。S2)。在4、7和14天后大肠杆菌感染后，阴道冲洗液中的阴道微生物总数逐渐增加，减少了21天(图1)。1A)。此外，组织学分析表明，大肠杆菌感染可引起上皮损伤，上皮分层增加，上皮粘膜大量脱落，脓细胞和肩胛旁上皮细胞增多，尤其是感染后14天。1B)。此外，我们观察了14天后固有层和粘膜下层的中性粒细胞。大肠杆菌感染。这些结果表明阴道输注大肠杆菌诱导小鼠阴道感染。阴道炎的集体症状在14天后最为明显。大肠杆菌感染。因此，在以上结果的基础上，我们确定了后续实验的观测时间点为14天后。大肠杆菌感染。

阴道灌注大肠杆菌小鼠阴道感染。(a)在第4、7、14和21天对阴道灌洗液中的细菌负担进行纵向评估；(b)小鼠生殖道组织病理学观察大肠杆菌感染。

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大肠杆菌感染对小鼠阴道组织miR 1976、CD 105和整合素αvβ6表达的调节

在本研究中，我们调查了大肠杆菌感染引起小鼠阴道组织miR 1976的异常表达。大肠杆菌感染降低了小鼠阴道组织miR 1976的表达水平。2A)。转化生长因子受体CD 105与阴道感染密切相关。据报道，阴道感染可促进CD 105的表达和整合素的活性。决定是否大肠杆菌-小鼠阴道感染与CD 105和整合素αvβ6激活有关，检测CD 105和整合素αvβ6的表达水平。在正常情况下，αvβ6的表达水平很低，但在激活后迅速增加，如在创伤或炎症条件下观察到的那样。40. 大肠杆菌感染可提高CD 105和整合素αvβ6的表达。2B，d)。此外，Westernblot分析和免疫组织化学染色显示CD 105蛋白水平也有类似的变化。2C，e).

大肠杆菌感染可导致miR 1976、CD 105和整合素β6的异常表达。a) 大肠杆菌感染降低miR 1976的表达水平；(b) 大肠杆菌感染可使小鼠阴道组织整合素αvβ6 mRNA水平升高(cCD 105蛋白在小鼠阴道组织中的表达增强。大肠杆菌感染，如westernblot分析所示；(d)小鼠阴道组织CD 105 mRNA水平升高。大肠杆菌感染；(e) 大肠杆菌免疫荧光染色显示，感染可增加CD 105蛋白的表达。*P < 0.05, **P < 0.01, compared with the control group.

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miR 1976的过表达逆转大肠杆菌CD 105/整合素αvβ6轴诱导小鼠阴道感染

如上述结果所示，大肠杆菌小鼠阴道感染与miR 1976抑制有关，我们进一步探讨了miR 1976在小鼠阴道感染中的作用。大肠杆菌-小鼠阴道感染。高表达miR 1976的腺病毒载体被多次注射到小鼠阴道肌层，并被感染。大肠杆菌..绿色荧光蛋白(GFP)荧光显像显示miR 1976腺病毒载体成功转染小鼠阴道组织。S3)。此外，miR 1976在小鼠阴道组织中的表达降低。大肠杆菌感染，通过miR 1976腺病毒载体的传递而恢复。1976年的miR水平大肠杆菌+adv-miR 1976(+)组为191%。大肠杆菌+ADV-miR 1976(−)组，第14天(图1)。3A)。使用miR 1976腺病毒载体后，阴道红度降低(补充图1)。S4)，阴道冲洗液中的阴道微生物总数明显减少(图一)。3B)。此外，H&E染色显示miR 1976的过度表达可减轻阴道感染。大肠杆菌小鼠感染(图1。3C)。这些结果表明mir 1976可能在大肠杆菌-小鼠阴道感染。

米尔-1976过度表达逆转大肠杆菌-小鼠阴道感染。(a)使用miR-1976过表达载体，使miR 1976的表达恢复受抑制的miR 1976的表达。大肠杆菌用qRT-PCR法测定小鼠阴道组织中的感染情况。b用miR 1976腺病毒载体后阴道微生物总数明显减少。(c)组织学分析表明：大肠杆菌可以被miR 1976过度表达所逆转。*P < 0.05, **P < 0.01, compared with the control group; **P < 0.01, compared with the 大肠杆菌感染组。

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我们的生物信息学分析和先前的工作确定CD 105为miR 1976的目标。与以前的研究一致，miR 1976的异位表达降低了大肠杆菌-诱导CD 105和整合素αvβ6 mRNA水平升高(图6)。4A，b)。westernblot分析显示miR 1976过表达改善了大肠杆菌-诱导CD 105蛋白表达改变。4C)。此外，免疫组织化学染色显示miR 1976过表达降低了CD 105在小鼠阴道中的表达。4D)。这些结果提示miR 1976可能在大肠杆菌-通过影响CD 105和整合素αvβ6的表达，诱导阴道感染。

MiR 1976过表达可减轻CD 105和整合素αvβ6表达的改变。(a)转染miR 1976过表达载体改善了大肠杆菌感染诱导CD 105 mRNA表达增加；b)MiR 1976过表达使大肠杆菌感染诱导整合素αvβ6 mRNA水平升高；c)MiR 1976过度表达改善了大肠杆菌诱导CD 105表达改变。(d)MiR 1976过表达使大肠杆菌感染诱导CD 105蛋白表达增加，免疫组织化学分析显示。*P < 0.05, **P < 0.01, compared with the control group; * P < 0.05, **P < 0.01, compared with the 大肠杆菌感染组。

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CD 105/整合素αvβ6轴在大肠杆菌-阴道感染

为了进一步确定miR 1976是否通过CD 105直接调节阴道感染，小鼠接受了通过阴道肌层注射过高表达CD 105的腺病毒载体，并同时感染了大肠杆菌..GFP荧光显像显示CD 105腺病毒载体成功转染小鼠阴道组织。S5)。正如预期的那样，CD 105腺病毒载体的应用显着地提高了mRNA和蛋白质的表达(如图所示)。5A，b)CD 105在小鼠阴道组织中的表达水平。此外，免疫组化染色显示CD 105过表达增加了CD 105在小鼠阴道中的表达。5C)。此外，应用CD 105腺病毒载体可增强整合素αvβ6在小鼠阴道组织中的表达。5D)。CD 105的过表达加剧了小鼠阴道感染，表现为小鼠阴道水肿明显增加(附图)。S6阴道微生物数量显著增加(图一)。5E)。此外，H&E染色显示CD 105的过度表达加剧了CD 105的表达。大肠杆菌-小鼠阴道感染。5F)。1976年的miR水平大肠杆菌+CD 105(−)组为272%。大肠杆菌+CD 105(+)组在第14天(补充图)。S7).

CD 105的过表达加剧了小鼠阴道感染。(aCD 105高表达腺病毒载体可提高小鼠阴道组织CD 105 mRNA表达水平；bCD 105过表达增加了CD 105蛋白的表达；c免疫组织化学染色显示CD 105过表达腺病毒载体后CD 105蛋白表达的变化；dCD 105腺病毒载体可提高整合素αvβ6的表达；(e阴道微生物总数也有所增加；(f血氧素-伊红染色显示CD 105的过表达加剧了小鼠阴道感染。*P < 0.05, **P < 0.01, compared with the control group; *P < 0.05, **P < 0.01, compared with the 大肠杆菌感染组。

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进一步验证CD 105/整合素αvβ6轴在大肠杆菌小鼠阴道感染，同时给予高表达miR 1976和CD 105的腺病毒载体，并感染大肠杆菌..检测CD 105和αvβ6在小鼠阴道组织中的表达。6A-c)。类中的αvβ6级别。大肠杆菌+adv-miR 1976(+)组和CD 105(+)组为160%。大肠杆菌+ADV-miR 1976(−)和CD 105(−)组，第14天(图1)。6BCD 105和miR 1976联合用药组阴道微生物数量较CD 105病毒组明显减少(图1)。6d)。H&E染色结果显示大肠杆菌CD 105和miR 1976联合用药组阴道感染明显优于CD 105腺病毒载体组(图1)。6E).

同时过表达miR 1976和CD 105可减轻CD 105过表达所致阴道感染的恶化。(amiR 1976和CD 105过表达对CD 105 mRNA表达的影响；b)小鼠阴道组织整合素αvβ6 mRNA水平的变化；c用miR 1976和CD 105过表达腺病毒载体后CD 105蛋白表达的变化；dCD 105和miR 1976联合用药组阴道微生物数量明显低于CD 105腺病毒载体组；e与CD 105腺病毒载体组比较，CD 105和miR 1976联合治疗组阴道感染减轻。

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综上所述，上述结果表明miR 1976对大肠杆菌-诱导的阴道感染可能是由直接调节CD 105和整合素αvβ6信号通路引起的。因此，我们的研究表明miR 1976/CD 105/整合素αvβ6轴在大肠杆菌-阴道感染。

在本研究中，我们报告了miR 1976在感染小鼠阴道组织中的表达下降。大肠杆菌..MiR 1976下调与菌群失调引起的阴道感染密切相关。我们证明miR 1976过表达逆转了大肠杆菌-阴道感染，包括阴道发红、阴道微生物数量和病理进展。MiR 1976通过抑制其靶基因CD 105及其下游整合素αvβ6的表达，对小鼠阴道感染产生抗感染作用。miR 1976/CD 105/整合素αvβ6信号轴的鉴定为miRNA在阴道感染中的重要作用提供了新的证据，为阴道感染的诊断、预后和治疗提供了新的靶点。

微生物群是一个复杂的生态系统，包含不同的微生物群落，在不同的组织(如阴道、尿道、口腔、鼻腔、胃肠道)和器官之间差异很大。41,42..近年来，我们对阴道微生物群的了解有了很大的提高。41,43..乳酸菌是健康的阴道菌群中的主要细菌，在正常情况下，各种细菌之间保持着平衡。菌群失调可能导致阴道感染，如细菌性阴道炎、有氧性阴道炎、萎缩性阴道炎、念珠菌性阴道炎和滴虫性阴道炎。41,44. 大肠杆菌引起尿路感染和不良妊娠结局，是人体肠道中的一种共生生物。45..有报告显示，24-31%的孕妇和9-28%的非孕妇被殖民。大肠杆菌46. 大肠杆菌是最常见的革兰氏阴性病原体，在有症状的女性需氧阴道炎中感染率为23%。7..儿童的临床危险因素及其发病机制大肠杆菌对女性阴道感染的理解不完全。因此，本研究探讨了其作用机理。大肠杆菌阴道感染。我们建立了前一项研究中描述的阴道感染的小鼠模型。47..与以前的报告一致，本研究表明暴露于大肠杆菌诱导小鼠阴道感染，表现为明显的阴道变化，包括阴道红肿、分泌物异常和阴道微生物数量增加。组织病理学分析所见的异常改变提供了补充证据，包括上皮分层增多，上皮粘膜大量脱落，脓细胞和肩胛旁上皮细胞增多。阴道感染的这些症状是由一位专业的临床病理学家确认的。加在一起，我们的数据显示阴道输注大肠杆菌诱导小鼠阴道感染。

研究发现，阴道感染会导致宫颈发育不良的进展，增加早产、产后感染、盆腔炎和病毒感染的风险。2,3,5,6..虽然阴道感染已经研究了很多年，但其潜在的机制仍不为人们所了解。然而，据报道，miRNAs在维持黏膜屏障完整性、平衡粘膜感染和炎症反应方面发挥着重要作用。9,10,11..研究表明miRNAs与阴道疾病和阴道分泌物异常密切相关。48,49,50..在本研究中，我们发现了第一个证据大肠杆菌-阴道感染与抑制miR 1976有关。体内..我们进一步证明miR 1976的过度表达逆转了大肠杆菌-诱导小鼠阴道感染，表现为阴道症状的明显变化，包括红肿、水肿、分泌物异常、阴道微生物增多，以及组织病理学分析所见的异常改变。很少有研究涉及miR 1976，并将其作为肿瘤的预后指标或癌症患者整体生存的预测指标。18,21..研究miRNAs在阴道炎或阴道感染中的作用是罕见的。的确，这项研究的结果首次表明miR 1976负调控。大肠杆菌-阴道感染体内..这些数据为miRNAs参与阴道感染的调控提供了科学依据，为阴道感染的治疗提供了新的途径。

有证据表明miRNAs通过调节靶基因的表达来发挥其生物学功能。51,52,53..转化生长因子-β信号通路在感染和炎症反应的信号网络中起着至关重要的作用。一些miRNAs已被确认为tf-β信号通路的靶元件。26,27..转化生长因子受体CD 105是转化生长因子β受体家族的成员，与血管生成、血管疾病、炎症和感染密切相关。22,29,30,31..此外，有证据表明miRNAs如mir-1287、miR-149-5p和miR-342-5p通过调节CD 105在血管生成、子痫前期、细胞增殖和成骨潜能中发挥重要作用。34,35..然而，CD 105的功能大肠杆菌-阴道感染仍不清楚。我们通过生物信息学分析和双重荧光素酶报告分析(未公布的数据)，确定CD 105为miR 1976的靶标。在这项研究中，我们发现大肠杆菌-诱导的阴道感染与CD 105在小鼠模型中的激活有关。此外，我们还发现在阴道感染小鼠模型中，miR 1976的过度表达导致CD 105表达降低。进一步确定miR 1976/CD 105轴在大肠杆菌小鼠经阴道感染后，接种高表达CD 105的腺病毒载体。大肠杆菌..CD 105过表达加剧了小鼠阴道感染，表现为小鼠阴道红度明显增加，阴道微生物数量显著增加。此外，H&E染色显示CD 105的过表达加剧了小鼠阴道感染。这些发现表明，mR 1976对CD 105的靶向作用在小鼠阴道感染中起着重要作用。本研究的成果可为今后的研究提供新的思路。大肠杆菌其他组织中的感染，如肠和膀胱组织。

黏膜表面定植是大多数黏膜细菌感染的重要起始步骤。粘膜上皮细胞的快速更新和脱落是保护粘膜免受细菌感染和消除微生物感染的一种机制。据报道，整合素可促进有效的黏膜定植和阴道感染，是预防或治疗细菌感染的潜在靶点。22,54,55..CD 105影响整合素家族多个成员的合成，调节整合素介导的细胞粘附。30..罗西等人.39发现CD 105与整合素α5β1的相互作用在炎症过程中起调节作用。阴道感染促进正常人阴道上皮细胞CD 105的表达和整合素活性，上调CD 105的表达增强整合素β1的活性。22..因此，CD 105和整合素可能在阴道感染中起重要作用。然而，CD 105/整合素αvβ6在阴道感染中的作用尚未见报道。结果表明：大肠杆菌-诱导的阴道感染促进CD 105的表达和整合素αvβ6的活性。例如，在小鼠阴道感染模型中，miR 1976的过表达降低了整合素αvβ6的表达。CD 105的过表达提高了小鼠阴道组织整合素αvβ6的表达水平。此外，我们的结果表明，同时过表达的miR 1976和CD 105可以减少CD 105过表达引起的阴道感染恶化。这些结果表明miR 1976/CD 105/整合素αvβ6轴在大肠杆菌-阴道感染。

总之，本研究首次提供了miR 1976负调控的重要证据。大肠杆菌-小鼠阴道感染体内背景。重要的是，我们证明miR 1976/CD 105/整合素αvβ6轴在大肠杆菌-诱导小鼠阴道感染，这一途径可能影响小鼠的定植和粘附。大肠杆菌..这些新发现表明miR 1976/CD 105/整合素αvβ6轴在大肠杆菌与阴道感染相关，可为阴道炎的诊断和预后提供新的生物标志物，为阴道炎的治疗提供潜在的靶点。

有关方法的详细信息，请参阅补充材料。

小鼠和小鼠阴道感染模型的建立

动物研究被南京医科大学伦理委员会批准。雌性NIH小鼠从南京医科大学动物研究中心购买。根据南京医科大学动物保护与福利委员会的指导方针对小鼠进行处理。

以前曾描述过阴道感染的小鼠模型。47,56,57,58..阴道感染后，用磷酸盐缓冲液冲洗阴道，在无菌管内收集阴道冲洗液。37°C培养24h后，在100μl阴道灌洗液中计数集落形成单位(CFU)。

体内腺病毒载体的传递

在另一组动物研究中，根据制造商的协议，将腺病毒载体(ADVS)注射到小鼠阴道肌层。小鼠随机分为两组(每组12只)：对照组，大肠杆菌小组，大肠杆菌+ADV-miR 1976组和大肠杆菌+ADV-miR 1976+ADV-CD 105组。实验结束后，处死小鼠，取其阴道组织进行分析。

组织学分析

阴道组织切片用苏木精和伊红(H&E)染色，观察其病理变化。

定量逆转录聚合酶链反应

采用定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测小鼠阴道组织中CD 105、整合素αv-β6和β-actin mRNA的表达。The primers used were as follows：β-actin-orward，5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3′and reverse，5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′；CD105-forward，5′-AGGTCTCCGAGGGCTGTGTA-3′and reverse，5′-GTCTCCGTGCCATTTTGCT-3′；integrinαv-β-forward，5′-GGTGGAACTGGAAGTGTTAGGG-3′and reverse，5′-GGAGCATTTCTTTTGGTGTGG-3′；MiR1976-forward，5′-GCGGCCCTCCTGCCCTCC-3′

反向，5‘-CAGCCAAAAGAGCAAT-3’。

westernblot分析

从小鼠阴道组织中提取蛋白质。Westernblot分析检测蛋白表达水平。

免疫组织化学染色

采用免疫组织化学方法检测CD 105在小鼠阴道组织中的表达。

统计分析

用SPSS16.0软件进行统计学分析。所有数据均以均值±标准差表示。单因素方差分析比较多组间的显着性差异。对于两组之间的比较，at测试是用的。价值p < 0.05 was considered significant.

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章(及其补充信息文件)中，如果有合理的要求，可以从相应的作者那里获得。