HIF1α抑制可促进来氟米特-AHR-CRP信号传导，减轻CRP异常类风湿性关节炎的骨侵蚀 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

类风湿关节炎(RA)是一种以进行性骨侵蚀为特征的慢性炎症性疾病。来氟米特最初是通过其代谢物A771726来抑制炎症，以减轻骨侵蚀。然而，在RA个体中观察到对来氟米特有明显的反应性。在此，我们发现来氟米特对RA患者有免疫抑制作用，但疗效有限，其区别在于血清C反应蛋白(CRP)升高。更高、CRPH，而其他对来氟米特有满意反应的则显示出较低的CRP(CRP)。较低、CRPL)。CRP抑制可减轻关节炎大鼠骨侵蚀。除通过A77 1726进行免疫调节外，来氟米特本身还能诱导AHR-Arnt相互作用，抑制CRP的产生，减轻CRP的骨侵蚀。L关节炎大鼠。尽管如此，CRP中的CRP较高H大鼠HIF1α表达上调，与AHR竞争，干扰来氟米特-AHR-CRP信号传导。肝细胞特异性HIF1α缺失或HIF1α抑制剂Acriveine重新激活来氟米特-AHR-CRP信号，以抑制骨侵蚀。本研究提出了一种基于精确医学的RA治疗策略。

导言

类风湿关节炎(RA)是一种以炎症性滑膜增生、僵硬、进行性骨侵蚀和全身特征为特征的自身免疫性疾病。进行性骨侵蚀是RA关节功能损害的重要决定因素1..目前，有多种治疗方案，包括常规和生物抗风湿药物。2,3..然而，没有一个是普遍有效的。4,5..了解这些药物无反应的机制，将为开发基于精确药物的RA治疗策略提供新的见解。5.

在RA的发展过程中，多种免疫细胞和细胞因子被组织在一个分级调节网络中，有利于破骨细胞介导的骨侵蚀。6..来氟米特已被广泛应用于RA的治疗，其机制是通过其代谢物a771726进行免疫调节。7..在口服后，来氟米特在肠壁和肝脏中被转化为A771726。A77 1726抑制免疫细胞增殖所需的线粒体二氢-口酸脱氢酶(Dhodh)，从而减轻炎症引起的骨侵蚀。8..然而，根据美国风湿病学会的反应标准，只有40-50%接受来氟米特治疗的RA患者的疾病活动减少了20%。9.

在本研究中，我们根据是否存在进行性骨侵蚀(PBE-阳性，PBE+)(PBE阴性，PBE−)，将使用来氟米特治疗的RA患者进行分类。有趣的是，来氟米特对PBE−和PBE+患者的炎症均有明显的抑制作用，提示来氟米特在减轻PBE+患者骨侵蚀方面的作用有限，与其免疫调节作用无关。PBE阳性患者血清C-反应蛋白(CRP)升高更高、CRPH，而PBE患者血清CRP相对较低。较低、CRPL)。研究表明肝源性CRP参与破骨的发生。10,11..我们发现CRP中的高CRPH患者骨吸收增加与骨吸收呈正相关。胶原诱导关节炎(CIA)动物模型的数据与RA患者的上述结果一致.

抗CRP抗体或肝靶向siRNA系统对CRP的抑制作用12导致CRP骨侵蚀减轻H中情局的老鼠。C反应蛋白的表达受芳香烃受体(AHR)基因组信号的负调控13，它需要与AHR核转运子(Arnt)结合，才能在激动剂的刺激下激活。14..越来越多的证据表明来氟米特可能是一种AHR激动剂。15..结果表明，来氟米特(而非A771726)能明显诱导ARNT与AHR结合，抑制正常肝细胞CRP的表达，而对体外高表达CRP的肝细胞无明显抑制作用。除了已知的通过a 77 1726的免疫调节作用外，来氟米特本身还能激活aHR-CRP信号，从而减轻CRP中的骨侵蚀。LCIA大鼠但不包括CRPH中情局的老鼠。

低氧诱导因子1α(hif 1α)已被报道与缺氧诱导因子1α竞争。16..我们发现CRP上调了HIF1α的表达，并与aHR竞争，干扰了hp中的来氟米特-AHR-CRP信号传导。H中情局的老鼠。HIF1α重新激活的来氟米特-AHR-CRP信号通路在体外高表达肝细胞中的作用。肝细胞特异性缺失HIF1α改善来氟米特-AHR-CRP信号抑制CRP骨侵蚀H中情局的老鼠。美国食品及药物管理局(Fda)批准的一种药物-吖啶素，已被报道为一种针对HIF1α的选择性抑制剂。17..我们发现，ACF降低了Arnt与HIF1α的结合，促进了来氟米特激活AHR，抑制了CRP的产生，减轻了CRP的骨侵蚀。H中情局的大鼠没有明显的毒性。

综上所述，本研究揭示hp-hif 1α信号轴对来氟米特对rp的影响有限。H拉。在此基础上，我们提出了一种基于精确医学的CRP治疗策略。HRa，即来氟米特与ACF的结合。

结果

来氟米特治疗CRP疗效有限HRA患者

我们回顾了250例RA患者使用来氟米特治疗的X线资料(补充表)。1)。来氟米特能明显减轻130例RA患者的进行性骨侵蚀，但对其余120例RA患者疗效有限(图1)。1A，b)。然而，PBE−和PBE+患者对DHODH活性的抑制和免疫细胞(T、B淋巴细胞和巨噬细胞)的增殖具有可比性。免疫细胞和滑膜成纤维细胞产生的细胞因子包括白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-6(IL-6)和核因子受体激活因子κ-Β配体(RANKL)。18两组间也无明显差异(图二)。1C和补充图。1A)。我们测定了PBE阳性患者血清中类风湿因子(IGM、IGG和IGA)、CRP、抗环瓜氨酸肽(抗CCP)抗体和血沉(ESR)与血清基线血指标的相关性。19..血清CRP对PBE+RA患者具有较高的特异性和敏感性，诊断准确率在92%以上。1D，补充图。1B和补充表2)。PBE阳性患者血清CRP水平较高。H)和骨吸收标记物(抗酒石酸酸性磷酸酶5b，TRAP5b)20，而PBE−患者的CRP相对较低。L)和TRAP5b(图1)。1E)。在来氟米特治疗过程中，CRP和TRAP5b水平均受到显著抑制。L但在CRP中没有H病人(如图所示)1F)。血清CRP，而不是其他指标，与CRP中的TRAP5b呈正相关。HRA患者(图1.1g和补充图。1C)。CRP在破骨发生中的作用是构象性和RANKL依赖性.循环的天然CRP由五个完全相同的亚基组成，进入局部病变后分解为单体构象。21..单体CRP在无RANKL的情况下促进破骨细胞分化，但通过中和RANKL抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。11..我们量化了RA患者滑膜液中CRP和RANKL的基线水平。单体CRP的摩尔浓度是RANKL的10，000倍以上。L和CRPHRA患者(附图)1D)，提示两组RA患者的CRP单体足以中和RANKL，多余的游离单体CRP将主导RA的破骨细胞活动。

来氟米特治疗CRP疗效有限HCIA大鼠

我们建立了CIA大鼠模型，并给CIA大鼠注射来氟米特28天(补充图)。2A)。根据微CT分析，将CIA大鼠分为PBE+组和PBE−亚组。2A)。经来氟米特治疗后，我们观察到PBE+大鼠(而非−大鼠)的骨微结构逐渐恶化，骨量减少。2A和补充图。2B)。抑制DHODH活性和免疫细胞(T、B淋巴细胞和巨噬细胞)增殖以及细胞因子(IL-17、IL-6和RANKL)的降低与PBE−和PBE+大鼠相似(图1)。2B和补充图。2C)。来氟米特对PBE、−和PBE+大鼠滑膜增生均有抑制作用(附图)。二维空间)。PBE+大鼠血清CRP水平升高H，91.24±10.12毫克升−1)和TRAP5b，而PBE−患者的CRP相对较低。L，52.45±7.54mg L−1)和TRAP5b(图1)。2C)。来氟米特降低CRP和TRAP5b水平，抑制CRP骨吸收和破骨活性L大鼠而不是CRPH老鼠(图1.2D，e，补充图。二维空间)。我们研究了两组RA个体之间不同CRP水平的机制。IL-6轴是肝细胞CRP表达的主要诱导剂。22..我们发现血清IL-6与CRP相当。L和CRPH老鼠(附图)2C肝脏IL-6受体(IL-6R)在两组间差异表达(补充图)。2E).

CRP抑制对CIA大鼠骨侵蚀的抑制作用

CRPHCIA大鼠关节内注射PBS(Vehicle)、IgG对照或抗CRP抗体(补充图).3A)。抗CRP抗体可减轻CRP骨侵蚀和骨吸收，防止CRP骨丢失。H大鼠与IgG或PBS(补充图)比较。3B-d)。我们还使用一种基于rna干扰的策略来抑制crp的肝crp表达。H中情局的老鼠。脂质纳米粒(Lnps)已被证实为体内siRNAs的肝靶向传递系统。23,24..CRPHCIA大鼠静脉注射pbs(Vehicle)、LNPs、LNPs包封阴性对照siRNA(LNPs-NC siRNA)或LNPs包裹阴性siRNA(LNPs-NC siRNA)。CRPsiRNA(LNPS-CRP siRNA)(补充图)。3E)。约90%的lnps-siRNA在肝脏中发现(补充表)。3)。LNPs-CRPsiRNA降低肝细胞CRP表达，减轻骨侵蚀和骨吸收，防止CRP骨丢失H大鼠与PBS、LNPs或LNPs-NC siRNA比较(附图)。3F-I)。我们研究了lnp-siRNA基因敲除rp是否能消除rp之间对来氟米特的差异反应。H和CRPL中情局的老鼠。结果表明，来氟米特与lnps-siRNA联合应用能有效地减轻CRP的骨侵蚀。H中情局的老鼠。联合治疗CRP的疗效观察HCIA大鼠CRP水平与来氟米特相当。LCIA大鼠(附图)4A-d)。我们还检测了抗CRP抗体在CRP中的作用。L中情局的老鼠。抗CRP抗体部分模拟来氟米特减轻骨侵蚀的疗效(补充图)。4e-h).

来氟米特与AHR的直接相互作用

摘要AHR基因信号在控制肝CRP的产生中起着重要的作用。13..经激动剂刺激后，AHR与ARNT结合，抑制CRP的表达13,14,25..越来越多的证据表明来氟米特，而不是它的代谢物A77 1726，可能是一种AHR激动剂。26..为证实来氟米特与AHR的直接相互作用，我们分别与DMSO(Vehicle)、来氟米特(Leflunomide)和A771726共同孵育标号标记的AHR(FLAG-AHR)。在拉下实验后，我们检测到AHR与来氟米特而不是A771726发生了相互作用。3A)。为了确定来氟米特-AHR相互作用中的关键残基，我们对AHR、PAS-A和PAS-B结构域进行了同源建模，这是与arnt二聚和与激动剂相互作用所必需的。14..选择了与来氟米特进行分子对接的最佳结构。5A)。预测了6种结合模式(附图)。5B)。选择了H 291、K 303和V 381两种最佳结合模式的关键残基进行突变(补充表)。4)。H 291或K 303突变可降低来氟米特与AHR的结合，而V 381突变不影响来氟米特与AHR的相互作用。H 291和K 303基因突变导致来氟米特-AHR相互作用显著减少(图1)。3B)。我们进一步进行了药物亲和力反应靶标稳定性(DATS)测定，以确定AHR与来氟米特之间的结合。DARTS试验依赖于与小分子药物相互作用所产生的靶蛋白对蛋白质的保护作用。27..分别与来氟米特(Leflunomide)和DMSO(Vehicle)孵育，再用蛋白酶(Subtilisin)消化(补充图)。6A)。H 291或K 303而非V 381的突变显著降低了与来氟米特相互作用所引起的AHR的稳定性，说明H 291和K 303参与了来氟米特与AHR的相互作用。H 291和K 303的突变导致了与来氟米特相互作用所赋予的AHR稳定性的协同降低(附图)。6B).

来氟米特-AHR-CRP在肝细胞中的信号转导

人正常肝细胞株(THLE-2)分别与DMSO、来氟米特和A771726共同孵育。免疫沉淀分析表明，来氟米特(而不是A771726)以剂量依赖性的方式诱导AHR与Arnt结合。3C)。来氟米特可显著降低CRP的表达和释放，而A771726则无明显影响。三维空间)。AHR基因敲除后，来氟米特不能降低CRP的表达和释放(附图)。6C，d)。来氟米特主要由细胞色素P4501A2酶(CYP1A2)代谢至A771726。28..呋喃菲林是CYP1A2的特异性抑制剂，可抑制来氟米特的代谢。28..我们用来氟米特孵育人正常原代肝细胞。来氟米特诱导AHR与Arnt结合，降低CRP的表达和释放。呋喃菲碱通过抑制来氟米特的代谢而稳定来进一步增强AHR-Arnt的相互作用和CRP的抑制(补充图)。6E，f)。以上结果表明，来氟米特本身而非A771726诱导AHR基因信号抑制正常肝细胞CRP的表达。除了基因组信号外，AHR还通过非基因组途径发挥作用，这与AHR-Arnt相互作用无关。29..一些配体已经被报道触发AHR非基因组途径来调节某些蛋白质的活性，例如Src，Jund和cyclinA。29,30..来氟米特对THLE-2细胞表达Jund、CyclinA和Src激活(Src磷酸化)无影响(补充图)。6g)，提示来氟米特可诱导正常肝细胞AHR基因信号转导。为探讨来氟米特是否诱导aHR基因信号抑制肝细胞CRP过表达，用IL-6预处理THLE-2细胞，诱导CRP过表达。22..来氟米特对THLE-2细胞超表达CRP诱导AHR-Arnt相互作用能力弱.CRP的敲除恢复了来氟米特诱导AHR-Arnt相互作用的能力。3E)。来氟米特不能抑制过表达CRP的THLE-2细胞CRP的表达和释放。3F).

来氟米特对CRP和骨侵蚀的抑制作用

两种CRPL和CRPH中情局大鼠口服车辆，来氟米特和A771726，分别(补充图)。7A)。血清CRP和TRAP5b水平较低。L来氟米特治疗的大鼠比用A771726的大鼠(补充图)。7b)。来氟米特对骨吸收和骨丢失的抑制作用在CRP中更为显著。L大鼠与A771726(补充图)比较。7C，d)。相比之下，来氟米特不能显著降低CRP中CRP、骨吸收和骨丢失。H大鼠与A771726(补充图)比较。7e-g)。这些结果，加上上述数据，使我们推测来氟米特除了通过a771726具有众所周知的免疫调节作用外，还能激活aHR基因信号，抑制CRP的产生，进而减轻CRP的骨侵蚀。LRA，而来氟米特-AHR-CRP信号通路在CRP中功能失调。HRa(图1.第三代).

HIF1α诱导的来氟米特-AHR-CRP信号传导障碍

据报道，HIF1α与AHR竞争ARNT协会。31..我们检测了非免疫组肝细胞中HIF1α的水平。L和CRPH中情局的老鼠。CRPL与未免疫大鼠相比，大鼠HIF1α表达略高于未免疫大鼠，而hf 1α表达水平略高于未免疫大鼠。H大鼠数量明显增加(图1)。4A)。CRP与HIF1α在两种CRP中的表达L和CRPH老鼠(附图)8A)。此外，LNPs抑制CRP-CRPsiRNA降低肝细胞HIF1α表达H老鼠(附图)8B)。我们用siRNA或过表达载体在THLE-2细胞中对CRP进行了体外调控.C反应蛋白的敲除可降低HIF1α的表达，降低ARNT与HIF1α的结合(如图1所示)。4B，c，补充图。8C)。超表达CRP的THLE-2细胞HIF1α表达增加，ARNT与HIF1α结合增强(如图1所示)。4D，e，补充图。8D)。我们在转染CRP、siRNA或过表达载体的THLE-2细胞中检测了来氟米特刺激的AHR基因组信号。CRP的下调增强了AHR-Arnt的相互作用，而CRP的过表达降低了THLE-2细胞在来氟米特刺激下的ARNT与AHR的相互作用(图1)。4F，g)。AHR与ARNT的结合及来氟米特对肝细胞CRP表达的抑制作用LCIA大鼠在CRP肝细胞中的作用HCIA大鼠(附图)8E，f)。结论：rp的高表达可引起HIF1α的上调，并与aHR竞争，从而导致hp中来氟米特-aHR-CRP信号传导功能障碍。HRa(图1.4H)。我们研究了HIF1α的敲除是否能改善THLE-2细胞在体外过表达CRP的来氟米特-AHR-CRP信号。HIF1α的敲除降低了ARNT与HIF1α的结合(图1)。4I). HIF1α单用siRNA对AHR-Arnt相互作用和CRP水平无影响(图5).4J，k)。然而，HIF1αsiRNA联合来氟米特能有效地增强AHR的基因组信号和CRP的抑制作用。4J，k)，提示抑制HIF1α可促进来氟米特激活AHR，抑制CRP在肝细胞中的表达。H拉。

来氟米特治疗CRP疗效有限HCIA小鼠

DBA/1CIA小鼠给予来氟米特28天(补充图)。9A)。在微CT分析的基础上，将小鼠分为PBE+组和PBE−亚组。来氟米特治疗后，观察到PBE+CIA小鼠的骨微结构恶化，而不是在PBE−CIA小鼠中(补充图)。9B)。对DHODH活性和免疫细胞(T、B淋巴细胞和巨噬细胞)增殖的抑制以及细胞因子(IL-17、IL-6和RANKL)的降低在PBE−和PBE+小鼠中具有可比性(附图)。9C)。PBE+小鼠血清CRP水平升高H，34.67±5.41mg L−1)和TRAP5b，而PBE-小鼠的CRP相对较低。L，17.70±3.25mg L−1)和TRAP5b(附图)。9d)。来氟米特降低血清CRP和TRAP5b水平并抑制CRP骨吸收L小鼠而非CRPH小鼠(附图)9E，f).

来氟米特在肝脏中的再激活作用HIF1α删除

HIF1α氧氟沙星/氧氟沙星小鼠阿尔布-克雷小鼠产生肝细胞特异性HIF1α击倒HIF1α-HKO)小鼠(附图)10a，b)。血清CRP水平与HIF1α-香港天文台及管制(HIF1α氧氟沙星/氧氟沙星)小鼠(附图。10C提示HIF1α不影响肝细胞CRP的表达。中情局是在HIF1α-HKO及对照小鼠。根据上述确定的CRP参考范围，将他们分为分组。L(17.70±3.25)mg L−1)和CRPHCIA小鼠(34.67±5.41mg L)−1)。来氟米特治疗后，观察CRP的骨侵蚀减轻情况。L但在CRP中没有H控制老鼠。然而，这两种CRPL和CRPHHIF1α-HKO小鼠对来氟米特抑制骨侵蚀反应满意(附图)。10d，e)。来氟米特对CRP炎性滑膜增生的抑制作用L和CRPH子组在控制和HIF1α-香港中央情报局老鼠(附图)10F)。来氟米特降低CRP和TRAP5b，抑制CRP破骨细胞活性和骨吸收L但在CRP中没有H对照组小鼠CRP、TRAP5b降低，来氟米特对破骨细胞活性和骨吸收的抑制作用显著。L和CRPH HIF1α-香港中央情报局老鼠(附图)10g-i)。以上结果提示肝细胞中HIF1α是重新激活来氟米特抑制rp和骨侵蚀的分子靶点。H拉。

ACF对来氟米特-AHR-CRP信号的再激活作用

dmso(Vehicle)或HIF1α抑制剂acf对THLE-2细胞高表达CRP的影响32..ACF降低了Arnt与HIF1α的结合，下调了HIF1α-Arnt信号转导最经典的靶基因，即血管内皮生长因子(VEGF)。血管内皮生长因子)33(无花果)5A)。将高表达CRP的THLE-2细胞分别与DMSO(Vehicle)、来氟米特(Leflunomide)、ACF和来氟米特(Leflunomide)与ACF联合孵育。与来氟米特或单用ACF相比，来氟米特和ACF联合应用增强了ARNT与AHR的结合，降低了CRP的表达和释放(图1)。c.)。我们收集上述处理组的条件培养液，并在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)存在下与条件培养液共同孵育单核细胞。5D)。用来氟米特和ACF联合处理的单核细胞对破骨细胞的分化有抑制作用，而以来氟米特或ACF单独处理的条件培养液处理的细胞则不受抑制。5E-g)。这些结果表明，ACF促进来氟米特激活AHR，抑制CRP的表达，减少破骨细胞的体外分化。

来氟米特联合ACF减少骨侵蚀

ACF是否促进来氟米特降低CRP生成和减轻CRP骨侵蚀HCIA大鼠H大鼠分别给予车辆、来氟米特、ACF和来氟米特与ACF联合用药(图1)。6A)。CRPH来氟米特联合ACF大鼠血清CRP降低，骨侵蚀减轻，骨吸收减轻，骨丢失减少，CRP无明显降低，骨侵蚀无明显变化。H大鼠单用来氟米特或ACF(图1)。6B-E和补充图。11)。来氟米特或来氟米特与ACF联合治疗CRP炎性滑膜增生HCIA大鼠(附图)11)。CRP中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肾功能参数尿素氮(BUN)和血液学参数(包括总蛋白(TP)、血红蛋白、白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血小板(PLT)无明显变化。H来氟米特联合ACF治疗CIA大鼠与来氟米特或单用ACF比较(补充表)5).

讨论

在我们的研究中，我们发现来氟米特对缓解RA患者(PBE+)的骨侵蚀有显著的免疫抑制作用，但效果有限。H)。而其他对来氟米特有满意反应的−则表现出相对较低的C反应蛋白(CRP)。L).

CRP在RA中的确切作用一直是一个悬而未决的争论。到目前为止，还没有人的研究直接调查CRP在RA中的作用，而且迄今为止所做的动物研究显示出了好坏参半的结果。有报道称CRP可引起关节炎兔的长时间炎症，并直接促进破骨细胞的发生。10,34，表明CRP对RA有不利的作用。然而，人和兔CRP的转基因表达已被证明抑制了CIA的发育。35,36，而CRP的敲除则加重了CIA和骨骼的损伤。11,35提示CRP在RA中起保护作用。在本研究中，我们用抗CRP抗体或肝靶向LNPs抑制CRP对CIA大鼠的损害作用。CRPsiRNA我们比较了上述研究，这些研究似乎得出了与CRP在RA中的作用不一致的结论。关于CRP在RA中保护作用的研究11,35,36在遗传模型(CRP转基因和基因敲除小鼠)中，CRP的表达在关节炎诱导之前被操纵。为我们的工作和其他研究证明CRP在RA中的不利作用。34然而，在CIA模型中，关节炎诱导后CRP水平会受到影响。上述研究实际上揭示了CRP在RA发展的不同阶段(早期诱导期与晚期活动期)的不同作用。他们认为CRP在RA中可能具有双重功能.CRP可能在RA的早期诱导期产生益处，但在活动期RA中起着不利的作用，这与上述研究中的假设是一致的。35.

以前，Kim等人。有报道称，在缺乏RANKL的情况下，CRP通过FCγRs信号通路促进破骨细胞活动。10，而Cho等人。表明CRP在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞活性。37..最近，贾等人。提示CRP通过构象和RANKL依赖方式调节破骨细胞分化。11..循环的天然CRP由五个相同的亚基组成，但在进入局部病变时分解成单体构象。21..贾等人结果表明，在体外无RANKL存在的情况下，单体CRP能诱导破骨细胞分化。11，这与Kim的报告一致10..然而，贾等人。此外，单聚CRP通过中和RANKL而抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。11，这是一致的，并解释了赵的调查结果。37..贾等人进一步解释了天然CRP在体外破骨细胞活性方面效率低下，但细胞培养时间延长(3-21天)有利于将天然CRP转化为单体CRP。11这表明，在Kim和Cho的研究中，CRP实际上通过单体构象来调节破骨细胞活动，它们分别与CRP共孵育3-21天和3-5天。10,37..基于这些研究，我们认为CRP在体内是否促进或抑制破骨细胞活动可能取决于单体CRP与RANKL的比值。我们发现，在这两种CRP中，单体CRP的摩尔浓度都是RANKL的10，000倍以上。L和CRPHRA患者，提示单体CRP足以中和RANKL，多余的游离单体CRP将主导RA的破骨细胞活动。

以前，有关出版物经常重申，小鼠CRP是一种微量蛋白，小鼠血清CRP水平明显低于人和兔，<3mg mL。−1即使在炎症刺激之后36,38..然而，最近的研究认为，这种说法并不令人信服，因为它们要么是指缺乏实验数据的评论文章，要么是早期的出版物，即在急性时相诱导之前，用羊抗人crp抗体与小鼠crp交叉反应，无法检测到任何小鼠crp。39,40..到目前为止，可用于小鼠的可靠试剂已经出现，研究表明血清CRP水平可能被大大低估了。40,41..血清CRP水平在5 mg mL范围内−1至50毫克毫升−1已在不同的小鼠模型中确定。40,42,43,44,45,46，这与我们的结果是一致的。

在我们的工作中，斯普拉格-道利 (SD)大鼠和DBA/1小鼠是研究RA的致病机制和抗关节炎药物治疗作用的常见动物模型。47. SD老鼠是一种近交系，DBA/1老鼠是近交系。48,49..我们发现血清CRP水平在两种情况下都有很大的差异。SD大鼠和DBA/1小鼠，这是CIA模型被分类为CRP的基础。L和CRPH分组。几十年来，近交系的老鼠比异种的老鼠更受青睐，因为它们的同质性更强，所以它们表现出的变异程度较低。50..然而，很少有足够样本的研究能够比较近交系和近交系之间的表型变异。51..令人惊讶的是，最近的报告表明近交系和近交系动物表现出相似的表型变异。50,51,52..一方面，他们得出结论认为，近交系动物等研究课题可以广泛采用近交系动物。另一方面，不可忽视的是，两者的变异系数都在很大的范围内变化。50..我们回顾了其他的研究，这些研究也显示出血清CRP有很大的变化。42,43,44..在我们之前的工作中，我们还展示了信号通路中其他蛋白质的巨大差异。53..尽管已建立的动物模型中蛋白质的巨大差异似乎与常识不同，其潜在原因尚不清楚，但这些差异可以用来解释人类疾病治疗学的无反应。53.

方法

来氟米特治疗RA患者的特点

对250例RA患者(女性150例，男性100例)给予来氟米特治疗。患者治疗前的特征见补充表。1..其他疾病或药物的患者，包括钙补充剂和绝经后激素替代疗法，可能影响骨重塑，被排除在研究之外。绝经后少于5年的女性患者也被排除在研究之外。所有患者均获得知情同意。这项研究得到了中国医学科学院临床医学基础研究所伦理委员会的批准。所有RA患者均口服来氟米特治疗12个月。治疗前后收集所有RA患者的血清。治疗前后均行手前后平片检查。

用改进的Sharp法进行放射评价

双手前后平片由两位不同的合格医生进行阅读和评估。X线片的读者对RA患者的X线片顺序和临床细节视而不见。按改良的Sharp评分法进行手关节的侵蚀评分。简单地说，根据6分评分(0-5级)对32只手关节的腐蚀情况进行了评估：如果没有腐蚀，则腐蚀评分为0。侵蚀是1，如果他们是离散的，但清楚地存在，如果他们是较大的2或3，取决于所涉及的关节的表面积。如果侵蚀很大，并延伸到假想的骨中部，则评分为3分。如果关节完全塌陷，或关节的整个表面受到影响，则得分为5分。54.

细胞培养

人正常肝细胞株THLE-2(ATCC，CRL-2706)在37℃下，在含5%CO的加湿环境中培养。220%O2在支气管上皮细胞基础培养基和添加剂中(来自美国Lonza/Clonetics公司的BEGM，BEGM子弹试剂盒)。300×酶解离心后，每两天换一次培养基。g持续5分钟。细胞株未检出支原体污染。本研究中未见常见的错误识别细胞株。THLE-2细胞(2×10)5(每孔细胞)在一夜之间孵育。用X-tremeGENE™siRNA转染试剂(RochLifeScience)转染C反应蛋白或AHR。siRNAsAHR和HIF1αNC siRNA来自热Fisher科学。siRNACRPNC siRNA来自圣克鲁斯生物技术公司。对载体诱导的CRP过表达，人CRP用5‘-TGAATTCAGGCCCTTGTATC-3’(正义)和5‘-TCCCATATTATAGAGA-3’(反义)引物进行PCR扩增。全核苷酸序列CRP克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)，经DNA测序证实。pcDNA3.1高表达载体转染THLE-2细胞CRP或使用X-tremeGENE的空载体™Hp DNA转染试剂(罗氏生命科学)。转染后，细胞继续培养36h，在细胞内加入一定浓度的小分子24 h，用重组人重组白细胞介素-6(50.0 ng mL)预处理rp的高表达。−1(研发系统)8小时，低氧处理时，细胞暴露于5%的CO中。21%O2来氟米特、A771726、Furafylline和ACF均来自Sigma-Aldrich。

标记蛋白的表达及纯化

AHR(H291A、K303A、V381A和H291A/K303A)的位点突变是由QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent Technologies)进行的。将AHR或突变体克隆到标记的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Addgene)中.利用X-tremeGENE转染THLE-2细胞，经直接dna测序证实载体的表达。™Hp DNA转染试剂(罗氏生命科学)。转染后，细胞继续培养36h，用旗标M纯化试剂盒(Sigma-Aldrich)对突变体进行纯化。

免疫沉淀与西方印迹

在HEPES裂解缓冲液(20 mm HEPES pH 7.2，50 mm NaCl，0.5%Triton X-100，1mm NaF，1mm二硫苏糖醇)中加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche Life Science)和磷酸酶抑制剂(10 mm NaF和1mm Na3VO4)制备细胞裂解液。蛋白A/G-琼脂糖(圣克鲁斯生物技术)在4°C进行免疫沉淀，蛋白质样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到PVDF膜(Bio-Rad)上。阻断后，用原抗体检测膜，然后与特异性辣根过氧化物酶结合次级抗体(Bio-Rad)孵育。免疫检测采用增强化学发光法(ThermoFisher Science)。采用β-肌动蛋白作为内矫正术的负荷对照.The primary antibodies included an anti-AHR antibody(ab2769，1：500)，an anti-ARNT antibody(ab5624，1：500)，an anti-HIF1α(ab1，1：200)antibody，an anti-CRP antibody(ab50861，1：2000)，an anti-VEGFA antibody(ab46154，1：1000)，an anti-JunD antibody(ab28837，1：500)，an anti-cyclin A antibody(ab181591，1：2000)，an anti-Src antibody(ab47405，1：500)，an anti-Src(phospho Y418)antibody(ab4816，1：1000)和抗β-actin(ab8226，1：10000)抗体。抗体已被验证为特定的物种，并在试点研究中的应用。源数据文件中提供了所有相关的未裁剪污迹。

淋巴细胞和巨噬细胞的分离

滑膜液取自RA患者、CIA大鼠和小鼠。用EasySep™T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)分离T淋巴细胞。用EasySep™B细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)分离B淋巴细胞。流式细胞仪检测T、B淋巴细胞纯度约为90~95%。用抗CD 14抗体(17000~1-AP，1：100，Proteintech集团公司)流式细胞术分离巨噬细胞.

DHODH活性测定

该方法包括DHODH与DHO底物的酶促反应，然后用4-三氟甲基-苯并酰胺肟(4-TFMBAO)荧光试剂对口蹄酸进行特异性荧光检测。55..3×105淋巴细胞在4°C下超声溶解10 min，裂解液用含500μM DHO，200 mm K的1.0ml水溶液孵育。2协和3-HCl(pH8.0)、0.2%TritonX-100和100μM辅酶Q10在37℃下作用1h。2O，250μL为4.0mm 4-TFMBAO，250μL为8.0mm K3[Fe(CN)]6]和250μL的40毫米K2协和3(PH 11)，在80℃下加热4.0 min。在冰水浴中冷却，反应停止，用荧光光谱仪测量反应强度。激发波长和发射波长分别为340 nm和460 nm。在计算产量时，从孵育结束时观察到的总酸量中减去非孵育时间前已存在的葡萄酸水平。欧拉酸、辅酶Q10、4-TFMBAO和DHO均购自Sigma-Aldrich.

人单核细胞的分离与破骨发生

采用Ficoll-Hypaca(Sigma-Aldrich)密度梯度离心法，从健康志愿者肝素化全血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。用无菌PBS冲洗3次，再悬浮于RPMI 1640(生命技术)中，加入10%FBS、2mm L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素(完全培养基)。PBMC在37℃完全培养基中孵育45 min。去除不贴壁细胞，用无菌PBS清洗贴壁细胞，用橡胶警察采集。流式细胞仪测定Ficoll-Hyp猕猴分离的单核细胞纯度约为85-90%。细胞在25 ng mL的THLE-2细胞条件培养液中培养3周。−1重组人M-CSF(R&D系统)。媒介每隔一天改变一次。第21天，用白细胞酸性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich)鉴定TRAP阳性细胞。10.

肝细胞分离

采用两步灌注法分离大鼠和小鼠原代肝细胞。56..简单地说，肝细胞是通过非循环胶原酶通过门静脉灌注从麻醉成年大鼠中分离出来的。分离的细胞然后通过一个100μm孔径的网状尼龙过滤器过滤。细胞悬液中的细胞数用血细胞计数。用台盼蓝染色法测定细胞活力。用流式细胞仪对分离的肝细胞进行纯化和鉴定。

坑形成试验

人单核细胞接种于骨分析板(Lonza)上，密度为1×10。4每井都有细胞。细胞在25 ng mL的THLE-2细胞条件培养液中培养3周。−1重组人M-CSF(R&D系统)。媒介每隔一天改变一次。第21天，骨片经1mnh超声处理。4去除贴壁细胞，用0.1%甲苯胺蓝染色。电镜下获取骨切片图像。每片骨片随机抽取3个字段进行进一步分析。利用ImagePro Plus 6.2软件(MediaControneticsInc.)对坑区进行了量化。57.

分子对接

针对PDB数据库进行位置特异性迭代BLAST(PSI-BLAST)，以识别AHR、PAS-A和PaSB结构域的同源模板.利用建模软件对AHR、PAS-A和PAS-B结构域进行同源建模。选择能量最低的结构作为进一步细化结构的起点。为了找到最优构象，将循环改进应用于AHR PAS-A和PAS-B结构域的预测。58..利用Ramachandran图对蛋白质结构中氨基酸残基的ψ和φ进行检测，评价模型结构的质量。利用AutovokVina对AHR、PAS-A和PAS-B结构域与来氟米特进行了分子对接.AHR的大分子结构被加载后，电荷和氢原子被加入，非极性氢原子被合并。用ChemDRAW 10.0绘制来氟米特分子，用量子化学方法AM1优化结构。利用AutoDock工具将蛋白质和配体结构转换为PDBQT格式。

ELISA法

用热费舍尔科学公司的ELISA试剂盒测定人和大鼠CRP。用定量ELISA试剂盒(R&D系统)测定小鼠CRP。用Cusabio生物技术公司的ELISA试剂盒检测人类风湿因子IGA、IGM和IGG。PeliKine法测定人IL-6和RANKLTM细胞科学人ELISA试剂盒和Boster生物技术ELISA试剂盒。采用ABCAM ELISA试剂盒检测人、大鼠和小鼠白细胞介素-17(IL-17)。人TRAP5b用TECOMedicalAG的ELISA试剂盒检测。用免疫诊断系统ELISA试剂盒检测小鼠和大鼠TRAP5b。用ABCAM ELISA试剂盒检测小鼠和大鼠IL-6。用ABCAM和Biobyt的ELISA试剂盒检测小鼠和大鼠RANKL。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测单抗CRP。59.

血清生化及血液学检测

采用Vitros 250分析仪对大鼠肝功能参数(ALT、AST)和肾功能参数(BUN)进行分析，并与常规临床诊断学、强生公司(Johnson&Johnson Co.，Rochester，NY)进行比较。血液学参数包括TP、血红蛋白、WBC、RBC和PLT用ABXINTERRA60C+分析仪(法国蒙彼利埃HoribaABX)进行分析。

LNPs-siRNA的制备

LNPs传递系统由类脂类98N组成12-5(1)，胆固醇，PEG-脂质和siRNA12,24..简单介绍98N的库存解决方案12-5(1)，mPEG 2000-脂质和胆固醇(Sigma-Aldrich)在乙醇中混合生成摩尔比为42：48：10。混合脂质加入125 mm醋酸钠缓冲液(pH5.2)，得到含有35%乙醇的溶液，从而自发生成类脂纳米粒。用LIPEX挤出机(北脂，不列颠哥伦比亚省，加拿大)，通过0.08μm膜(斯特力泰克，肯特，WA)挤出纳米粒子，形成长度为50-60nm的纳米颗粒。CRP在50 mm醋酸钠(pH5.2)和35%乙醇中加入siRNA或NC siRNA，总脂比为7.5：1(wt：WT)，37°C孵育30 min。通过对磷酸盐缓冲液进行透析，实现了含siRNA纳米粒子的乙醇去除和缓冲液交换.最后，用0.2μm无菌滤池对该制剂进行过滤。为了确定siRNA的组织分布，用Cy5标记siRNA，用微板阅读器系统(BioSCAN，Washington，DC)测量不同器官样品中的荧光强度。

CIA大鼠模型

男SD大鼠(体重170~190克)来自香港中文大学，在标准温度(22°C)和12小时的光/暗循环下，可自由获取食物和水。CIA大鼠模型60..在不完全弗氏佐剂(IFA，Chondrex)中乳化牛Ⅱ型胶原(Chondrex)。用2 0 0μL乳剂(2 0 0μg牛CII)在尾底皮下免疫。第7天给予增强免疫，第1次注射100μL相同的乳剂。关节炎的严重程度通过临床关节炎评分来评估，该评分由两名独立的、失明的观察者进行。评分采用0~4评分，0=无肿胀或红斑，1=轻度肿胀和/或红斑，2=轻度至中度水肿，3=明显水肿，关节使用受限，4=关节僵硬水肿过多。对每只大鼠后肢进行分级，最大可能评分为8分。分数在1或以上的老鼠被认为是关节炎。所有实验程序均获香港浸会大学动物伦理及实验安全委员会批准。我们遵守了所有有关动物试验和研究的道德规范。

肝细胞特异性的产生HIF1α敲除小鼠

HIF1α氧氟沙星/氧氟沙星小鼠(B6.129-)HIF1atm3Rsjo/来自香港中文大学实验动物服务中心。阿尔布-CRE小鼠(B6.Cg-)Speer 6-PS1热重(Alb)−(CRE)21 Mgn/J)来自杰克逊实验室。这两只老鼠C57BL/6背景，被认为对关节炎的诱导具有相对的抵抗力。61..即使C57BL/6用鸡源性Ⅱ型胶原免疫小鼠后可发生关节炎，最大关节炎发生率较低(50%-70%)，关节炎易感性变化较大。61..因此，这两只老鼠被回溯了八代，以改变遗传背景。C57BL/6到DBA/1，表明其对关节炎的易感性最大。61,62,63..然后，HIF1α氧氟沙星/氧氟沙星小鼠阿尔布-克雷小鼠产生肝细胞特异性HIF1α击倒HIF1α-香港天文台(HKO)小鼠64.

CIA小鼠模型

男DBA/18至10周龄的老鼠来自香港中文大学，在标准温度(22°C)和12小时的光/暗循环下，可以自由获取食物和水。CIA小鼠模型63..简单地说，牛CII(Chondrex)被乳化在同等体积的完全弗氏佐剂(CFA)中。小鼠尾底单次皮下注射100μL乳剂(100μg牛CⅡ)，终浓度为2mg mL。−1的结核分枝杆菌..关节炎的严重程度通过临床关节炎评分来评估，该评分由两名独立的、失明的观察者进行。评分采用0~4分值，0=正常；1=一个关节的红度和/或肿胀；2=多个关节的红肿和/或肿胀；3=整个爪子的红肿和/或肿胀；4=畸形和/或强直。对每只小鼠后肢进行分级，最大可能评分为8分。分数在1或以上的老鼠被认为是关节炎。所有实验程序均获香港浸会大学动物伦理及实验安全委员会批准。我们遵守了所有有关动物试验和研究的道德规范。

药物管理

用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)悬浮于来氟米特和A771726中，给予CIA大鼠或小鼠口服。将ACF溶解于PBS中，腹腔注射给CIA大鼠。向CIA大鼠注射兔IgG对照(ab171870，每只大鼠20g)或抗CRP抗体(b 227507，每只大鼠20g)。

组织学分析

处死后取小鼠和大鼠膝关节，用10%中性福尔马林保存，20%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙4周后脱水，石蜡包埋。组织病理学检查前行苏木精伊红(HE)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。65.

微CT分析

在体内微CT分析中，对大鼠或小鼠进行麻醉，扫描前俯卧于扫描阶段。用VVACT 40(Sanco Medical)扫描20 mm长的右爪和踝骨，电压为70 keV，电流为114μA，进行活体微CT测量，解剖双侧后爪进行显微CT测量。自动重建后，生成21μm各向同性分辨率的二维切片，选择感兴趣区域(ROI)进行三维重建。对跟骨全骨组织进行定量评价，阈值(σ=1.2，支持度=2，阈值=200)。用内置软件计算骨体积分数(bv/tv)和骨密度(BMD)。66.

骨组织形态计量学分析

双侧后爪用70%乙醇固定。双侧后爪骨组织在不同浓度乙醇中脱水，无脱钙作用于改性甲基丙烯酸甲酯中。用Exakt切割/研磨系统(ExaktTechnologyInc.)获得了10μm厚后爪骨的前部部分。德国)。然后在荧光显微镜(Leica图像分析系统，Q5 0 0 MC)下，应用专业图像分析软件(BioQuant Osteo Analysis)对骨切片进行组织形态计量学分析。骨吸收参数，I...根据骨组织形态计量学的标准化命名计算和表达了OC.N/BS和OC.S/BS。67.

飞镖试验

在10 0μL pBS中，用标记的AHR、AHR突变株和阴性对照牛血清白蛋白(BSA)，分别在4°C下与载体(DMSO)和来氟米特(μM)在指示浓度(5.0和10.0μM)下孵育18h。在室温下用枯草杆菌素(Sigma-Aldrich)消化20 min。加入SDS负载缓冲液，煮沸5 min，可使反应停止。将样品加载到12%丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上，然后用考马斯亮蓝染色，观察条带的形态。27.

拉拔法与LC-MS/MS

为确定AHR与来氟米特的直接相互作用，分别与来氟米特(10.0μM)、A771726(10.0μM)和车辆(DMSO)在4°C下孵育了100μL pBS中的30.0 g标记AHR和AHR突变体。标记蛋白由标志M纯化试剂盒(Sigma-Aldrich)收集。采用90%甲醇(Sigma-Aldrich)萃取法提取法中的小分子，用Agilent 6400型超高效液相色谱仪(UHP-QQQMS/MS)(Agilent Technologies)进行分析。28,68.

实时PCR

用RNeaseMini试剂盒提取总RNA。用QuantiTect逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。最终的实时PCR溶液的10μL体积含有1μL稀释的cDNA产物，5μL2×PowerSYBR绿色PCR主混合物(应用生物系统)，0.5μL的正向和反向引物，3μL核酸酶无水。正反向引物如下：CRP5‘-ATGGAAGCTACTCTGGTGC-3’(Sense)和5‘-ACACAGTAAAGGTTTCAGTG-3’(反义)；TRAP5b：5‘-GCAACATCCCCTGTATGTG-3’(Sense)和5‘-GCAAACGTAGTAGTAGTAGCTG-3’(反义)；HIF1α5‘-TCCATATGAGCTGCTGACCAC-3’(正义)和5‘-CCACCTCAAAGCACCATA-3’(反义)；GAPDH5‘-AGGTCGTGTGAGGAGGATTG-3’(Sense)和5‘-TGTACATTAGTAGTAGGGGGGTCA-3’(反义)。发出的荧光信号由ABI PRISM 7900HT序列检测系统采集，信号经SDS 2.1软件(应用生物系统)转换成数值。66,69.

统计分析

应用二元Logistic回归方法，确定PBE+RA患者血液生物医学指标的指征准确性。用Pearson相关法确定变量间的相关性。用Shapiro-WilkW检验所有连续变量的正态性.当比较两个独立组的测量结果时，双面t-测试用于分析连续变量。在对时间序列组重复测量结果进行比较时，采用方差分析(ANOVA)对数据进行分析。对于多个独立群体之间的差异，单向方差分析临时进行了测试。将样本随机分为不同组。调查人员在数据收集和分析过程中对分组分配视而不见。双面P-小于0.05的数值被认为具有统计学意义。所有统计分析均用SPSS软件22.0版进行。为了获得准确可靠的统计数据，进行了生物复制和技术复制两种类型的复制。样本大小由公式计算：n=2[(Uα + Uß) Sδ−1]2. S在公式中提到标准差(S.D.)。δ在公式中表示均值的组间差。在30毫克厘米以上有差异。−3治疗组与对照组在骨密度方面，I.., δ=30毫克厘米−3..S.D.以往研究的骨密度为15毫克厘米。−3，即S=15毫克厘米−3..我们选择了5%的显著水平(α=0.05)在双尾测试和研究的力量在90%(1-ß=0.9)。根据公式：n=2[(Uα + Uß) Sδ−1]2, U0.05=1.960，ß=0.10，U0.1=1.282，我们选择了n=9，足以检测治疗组间的真正差异。身体条件差的动物，如肿瘤或衰老期间的其他疾病，被排除在外。在随机分组作业、实验干预和数据分析之前进行排除。