鉴定和表征SEC24D作为乙型肝炎病毒感染的易感基因
单核苷酸多态性(SNPs)和基因与乙型肝炎病毒(HBV)感染的易感性,发现了全基因组关联研究解释,只有很少一部分已知的遗传,表明越来越多的变异有待发现。 在这项研究中,我们采用了一个新的研究策略来识别更多的易感基因和变异的乙肝病毒感染。 我们首先进行遗传协会300 sib-pairs和3087份病例对照样本,分析显示,36个snp基因位于31显示名义对乙型肝炎病毒感染在两个样本。 这些基因,我们选择SEC24D为进一步的分子分析根据以下两个主要的证据。 首先,时间进程的表达谱分析HBV-infected主要人类肝细胞(收购PHH)证明SEC24D表达显著增加随着时间的推移在乙型肝炎病毒感染(P= 4.0×10−4)。 第二,SNP rs76459466SEC24D不利与乙型肝炎病毒相关风险(或元= 0.82;P元= 0.002),这表明SEC24D代表了一个新颖的乙型肝炎病毒感染的易感基因。 此外,SEC24D似乎是预防乙肝病毒感染在体外。 一致,我们发现SEC24D在未受感染的肝组织中表达显著增强(P= 0.002)。 我们得出这样的结论:SEC24D是一种新型的候选基因与乙肝病毒感染的易感性有关。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一种严重的全球卫生问题,显示了显著的地理多样性。 因此,在美国和北欧国家,慢性乙型肝炎病毒感染的患病率(CHBVI)估计为< 0.5%,但这个数字高达10 - 12%在中国和韩国1,2。 尽管有力的可用性乙肝病毒疫苗和有效的抗病毒药物的二十年里,乙肝保持在高患病率在世界范围内,有超过2.4亿人感染3.。 慢性乙型肝炎会引起肝硬化和肝细胞癌,负责每年0.5多-100万人死亡4。
慢性乙型肝炎病毒感染(CHBVI)和病毒清除是由多个基因和环境因素的影响,包括病毒和宿主因素5,6,7。 双胞胎和种族隔离的研究表明,宿主遗传因素强烈影响乙型肝炎病毒感染的结果8。 最近,全基因组关联研究(GWAS)已经被用来识别基因变异为众多复杂的人类疾病,如乙型肝炎病毒感染和间隙。 几个位点,位于人类白细胞antigen-C (HLA-C)9,HLA-DP10,hla dq11,HLA-DOA,补充因子B (循环流化床),新的高度12,常染色质的组蛋白赖氨酸甲基转移酶2 (EHMT2)、转录因子19日(TCF19)13两个non-HLA位点,CD4012和泛素接合酶E2 L3 (UBE2L3)9,已报告明显与与乙型肝炎病毒有关的疾病相关。 然而,当观察到许多人类的疾病,这些单核苷酸多态性(snp)只占一小部分的明显的遗传方差,这意味着许多与乙型肝炎病毒有关的疾病的易感性位点仍有待确定14。
为了进一步阐明disease-predisposing乙型肝炎病毒感染的基因,我们采用一个综合功能基因组学策略,可以简要总结如下。 我们在300年首次进行了变异发现sib-pairs,紧随其后的是复制的候选snp在3087年病例对照样品。 的SEC24D基因被选择进行分析的基础上,表达分析和关联研究。 通过一系列的在体外实验中,我们发现SEC24D乙型肝炎病毒感染抗病毒基因。
三百年sib-pairs用于发现阶段招募了2010年至2012年在浙江大学医学院第一附属医院和其他邻居医疗医院或中心。 在这些兄弟姐妹,300 CHBVI受试者被定义为血清反应阳性的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或病毒dna,和相应的sib-controls既为阴性。 更详细的描述这些主题的人口和表型特征如表所示1和补充图。1。
复制样本招募从相同的医疗设施,包括1648 CHBVI参与和1439控制(表无关1和补充图。1 b)。 详细描述这个独立的复制提供了样品从我们组在以前的出版物15,16。
中国汉民族所有的参与者。 知情同意书是来自每一个参与者,收集的人口和临床数据结构化的问卷调查。 这个项目是经伦理委员会批准的浙江大学医学院第一附属医院。
从3毫升的外周血基因组DNA提取从每个主题使用DNA纯化试剂盒工具包。 图书馆准备根据制造商提供的操作手册,和丰富的编码外显子捕获使用TruSeq外显子组浓缩设备(美国圣地亚哥Illumina公司)和测序的Illumina公司HiSeq2000系统。 Paired-end测序进行100年基地从每个月底约200 - bp插入片段库使用标准Illumina公司协议,和测序读对齐hg19从UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/)使用burrows - wheeler对准器(BWA)使用默认参数17。 皮卡德工具(去除PCR副本后http://broadinstitute.github.io/picard/),所有样品测序深度的中位数是56×(见补充图。2)。 有针对性的外显子区域,覆盖90.73%的人平均≥10×基因型的质量分数≥30。 单核苷酸变异(SNVs)确定的基因组分析工具包(GATK)18,19。 每个变量的统计数据,包括等位基因平衡,深度报道,链平衡,和多个质量量度,带注释的注释器使用GATK变体18,19。 然后使用这些统计数字自适应误差模型的概率估计每个SNV是真正的一个使用GATK变体质量分Realibrator (VQSR)18,19。 使用ANNOVAR变体进行功能注释20.,而注释数据库下载的UCSC基因组浏览器。
进行了严格的质量控制措施,确保可靠的关联分析。 单核苷酸多态性被排除在进一步分析,如果他们有一个小的等位基因频率(加)< 0.01的P< 1×10的价值≤6哈迪温伯格平衡(HWE)。 这之后适当的质量控制,共有98357个snp进行进一步分析。
所有的4000个snp在发现阶段选择使用Illumina公司iSelect自定义数组pcr基因分型根据Illumina公司英高清测定超手册。 其中,121个snp未能被设计在自定义数组中。 此外,291年祖先信息标记(目标)从不同的染色体包含在iSelect数组和评估人口掺合料用于复制样品。 SNP是排除如果有:(1)电话率< 0.95; (2)的乘加< 0.05; 和(3)P< 1×10的价值≤6与复制HWE测试样品。 这些snp位于性染色体也被排除在外。 任何样本删除如果它有一个叫< 0.95。 这些质量控制步骤之后,2925个snp对3064个样本的常染色体染色体仍进一步分析。
三个独立的基因表达谱数据集从基因表达综合(GEO)下载。 数据集1(加入GSE72068)被用来执行时间进程分析,确定20 mRNA表达谱主要由人类肝细胞(收购PHH)获得乙型肝炎病毒感染后在不同的时间使用Illumina公司HumanHT-12 beadchip V4.0表达式。 数据集2(加入GSE36250)被用来测量感兴趣的候选基因的微分表达式,由检查由罗氏123 mRNA表达谱的肝脏样本定制HX3微阵列基因表达。 数据集3.(加入GSE22058)用于通路富集分析,包括表达数据的研究从96年与乙型肝炎病毒有关的肝癌患者肝脏标本使用罗塞塔/默克人类办公室定制Affymetrix 1.0微阵列。 标本被分成两组的基础上的意思SEC24D表达式。 上四分位数被定义为SEC24D高表达组和下四分位数低表达组。 基因的错误发现率Q值< 0.001和| |褶皱变化> 1.5被认为是高度差异表达。 通路富集分析进行了大卫的工具(v . 6.8)21。
人类肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15从中国购买类型文化中心集合(CCTCC)。 所有在杜尔贝科修改鹰培养基培养细胞(HyClone,洛根,但美国)含10%胎牛血清(马GIBCO沃尔瑟姆,美国),和青霉素G 100 U /毫升和链霉素100μg /毫升(GIBCO) 37°C湿润孵化器有限公司为5%2。 HepG2.2.15细胞补充了G418 400μg /毫升(GIBCO)保持稳定转染二聚的病毒dna。 HBV-producing质粒pGEM-4Z-HBV1.3,其中包含1.3 U的乙肝病毒基因组(亚型ayw)22王博士是一个礼物,醉的Ryu (Addgene质粒# 65459)。 的SEC24D互补脱氧核糖核酸是克隆到囊二世和生态国际扶轮网站的表达载体pEGFP-C3(美国Clontech,帕洛阿尔托,CA)。 重组质粒测序确认的准确性Sangon生物技术(上海,中国)。 抑制基因表达,细胞转染siRNA工器,由RiboBio合成Inc .(广州)。 所有的转染反应建立了使用Lipofectamine 3000转染试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。
转染48 h后,细胞溶解产物收集使用里帕裂解缓冲与蛋白酶抑制剂(Tiangen,北京)。 溶解产物,包含12μg蛋白,sds - page分离和转移到PVDF膜(美国贝德福德微孔)。 膜与指定的探测主要抗体(抗-SEC24D和anti-beta肌动蛋白; Abcam,英国剑桥)一夜之间在4°C和进一步孵化与相应的辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Bioker、杭州、中国)在室温下1 h。 免疫反应性的乐队是西方ECL贴上清晰的衬底(美国里士满Bio-Rad)。 Beta-actin被用作蛋白质加载控制。 信号强度的量化是ImageJ软件(马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院,美国)。
细胞转染48 h后,上层液体收集在3000转离心10分钟在4°C。 HBV DNA定量实时PCR载荷用病毒DNA的荧光定量PCR检测设备(Acon,杭州,中国)。 HBsAg和e抗原浓度是量化的化学发光微粒使用建筑师免疫测定试剂盒(美国雅培,芝加哥,IL)。 所有的化验进行至少三次后,制造商的指示。
我们进行了自由化的兄弟姐妹传输/不平衡测试(sTDT)23300 sib-pairs在加性遗传模型调整年龄、性别和前五个主成分(pc)。 在复制阶段,执行协会的单核苷酸多态性与乙肝病毒感染在使用叮铃声加性遗传模型(1.07)24随着年龄的增长,性,和前五个人电脑不。 样本的人口外加剂是评估通过电脑分析(PCA)在EIGENSTRAT实现25。 荟萃分析的数据来自家人和病例对照样品进行了评估使用Mantel-Haenszel方法合用的遗传效应26。 异质性与科克伦的检查问测试27。 当P的价值问测试是< 0.1,我们认为有强有力的证据之间的异质性样本。 时间进程使用BRB-ArrayTools软件分析28。 世行的信号强度分析,SEC24D表情,病毒dna负载,HBsAg和e抗原浓度,显著差异是由双尾学生的决定t以及。 一个P值< 0.05被认为是具有统计学意义。
如无花果所示。1和表2,我们进行了关联分析对家庭和病例对照样品。 首先,确定442078 SNVs韦斯分析。 第二,我们执行sTDT质量控制后剩余的98357个snp。 第三,前4000个snp选择复制CHBVIs 1648年和1439年不相关的控制,在31日透露,36个snp基因名义上与样品(乙型肝炎病毒感染有关P值< 0.05)。
工作流的综合功能基因组学的方法来识别乙型肝炎病毒感染的易感基因。 缩写:SNV =单核苷酸变异; SNP(单核苷酸多态性; 加=小等位基因频率; HWE =哈迪温伯格平衡; sTDT =兄弟传输/不平衡测试。
确定哪些基因更有可能影响乙型肝炎病毒感染,我们执行时间分析基于不同时间点的表达数据从HBV-infected收购phh。 我们发现只有三个基因显示显著的时间针对乙肝病毒(图表达的变化。2和补充图。3.)。 的表达SEC24D累积,一般高,依赖于时间在乙型肝炎病毒感染(P= 4×10−4)。 在12天,最大的改变(> 1.5倍),显示一个潜在的相关性SEC24D和乙肝病毒感染。 表达的程度MICAL1(微管相关的单氧酶,calponin和LIM域包含1)SDAD1也显示明显的动态变化(P= 4×10−4和P= 4×10−2分别)。 然而,MICAL1表达式是增加在24 h和减少之后,显示不同的角色在早期(前24 h和)和晚期(post-24 h)对乙型肝炎病毒感染的反应。 为SDAD1,表情变化也显示这一趋势的升序和降序后者,表明不同的在不同的时间点对乙型肝炎病毒感染和一些类型的适应天6。 考虑到潜在的复杂角色MICAL1和SDAD1在乙型肝炎病毒感染和这份报告的主要目的,我们在关注SEC24D。
乙型肝炎病毒感染后时间过程分析。 基因表达数据(日志2转换)提取地理数据集(加入GSE72068)。 平均每个时间点的基因表达程度分别绘制了乙肝病毒和mock-infection组。 红线代表HBV-infected组,蓝色代表模拟组。 误差棒表示标准偏差(SD)。
我们发现一个重要的协会SEC24D多态性与乙型肝炎病毒感染(表2)。 在家庭这个示例中,当比较CHBVI与相应sib-control集团SNP rs76459466 (G > T)与HBV感染风险负相关(优势比[或]= 0.64; 95%可信区间[CI] 0.46, 0.88;P= 5.9×10#3)。 这个协会是复制到一个独立的病例对照样本,这表明rs76459466风险显著降低乙型肝炎病毒感染(OR = 0.86; 95% CI 0.75, 0.99;P= 3.4×10−2)。 因为没有明显的两个样本之间的异质性(P的价值问执行测试> 0.1),荟萃分析结果从两个样品一起。 我们发现rs76459466 T载体较低比非承运人(或乙型肝炎病毒感染的风险元= 0.82; 95% CI = 0.72, 0.93;P元= 2.0×10#3)。 因此,强劲的遗传关联研究和基因表达分析显示一个潜在的作用SEC24D在乙型肝炎病毒感染。
SEC24D属于SEC24亚科和与泡走私。 根据RNA-Seq图谱数据库29,SEC24D表达在不同的组织,包括肝脏。 然而,特定的角色SEC24D在乙型肝炎病毒感染没有被照亮。 因此,我们研究了它对乙型肝炎病毒感染的影响在体外功能实验。
探索的潜在影响SEC24D在乙型肝炎病毒感染,我们调查了大量的病毒dna, HBsAg, e抗原在细胞培养基SEC24D超表达或抑制。 HepG2细胞被pGEM-4Z-HBV1.3转染,要么一起pEGFP-C3 -SEC24D或pEGFP-C3控制质粒(无花果3和4得了)。 与细胞治疗控制向量相比,细胞过表达SEC24D质粒显示病毒dna显著下降负荷70.3±5.8%,HBsAg 59.0±5.1%, e抗原85.1±3.7%。 为SEC24D抑制(无花果3 b和5 a - c),我们使用两个独立的siRNAs,导致显著增强的大量病毒dna 152.8±12.9%和129.8±7.0%,HBsAg 134.6±11.2%和115.7±7.4%,和e抗原129.1±7.9%和112.2±3.3%。 此外,我们复制的抗病毒效果SEC24D有效地抵抗乙肝病毒感染的细胞HepG2.2.15(补充无花果4- - - - - -6)。 乙型肝炎病毒标记物的显著减少SEC24D超表达,但增加了SEC24D抑制。
免疫印迹分析的SEC24D在HepG2细胞蛋白质。 细胞(~ 2×105)被pGEM-4Z-HBV1.3转染,连同pEGFP-C3 -SEC24D(SEC24D)或pEGFP-C3控制向量(控制)(一个)或SEC24D特殊技能siRNAs (siRNA1和siRNA2)或负控制siRNAs (NCRNAs) (B)。 48 h转染后细胞溶解产物收集。 误差棒表示SD; *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。
过表达SEC24D在HepG2细胞抑制乙肝病毒复制。 量在体外检测病毒dna定量实时聚合酶链反应(一个),HBsAg的数量(B)和e抗原(C)是由化学发光检测微粒免疫测定。 所有的转染48 h后收集上层的液体。 误差棒表示SD; *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。
抑制SEC24D在HepG2细胞之二乙肝病毒复制。SEC24D表达式是由两个独立的siRNAs抑制。 的病毒dna检测定量实时聚合酶链反应(一个),HBsAg的数量(B)和e抗原(C)测定化学发光微粒免疫测定。 所有的转染48 h后收集上层的液体。 误差棒表示SD; *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。
为了进一步证实的作用SEC24D在乙型肝炎病毒感染,我们检查是否一个微分的程度SEC24D表达式中存在肝组织从旱獭搜索公共数据库。 土拨鼠可以自然土拨鼠肝炎病毒感染(WHV),一个嗜肝病毒基因接近人类的乙肝病毒。 通常用作动物模型研究CHBVI的发病机理与乙型肝炎病毒有关的肝癌发展在人类30.。 我们调查了SEC24D表达式的感染(n = 60)和未受感染的(n = 63)肝组织WHV模型(无花果。6)。 与对照组相比(平均日志2归一化表达式值为11.90),我们发现明显降低SEC24D表达式(意思是日志2归一化表达式值为12.15)在受感染的肝脏(褶皱变化1.2;P= 0.002)。 符合我们之前的结果,这些数据支持的保护作用SEC24D在乙型肝炎病毒感染。
的表达SEC24D在肝组织中感染和控制组织(加入GSE36533)。 顶级酒吧最大的表达,降低酒吧是最低观察,盒子是第三个四分位数,盒子的底部是第一四分位数,中间栏中值。
在过去的几年中,GWAS常用调查常见疾病的遗传倾向,但确定敏感性变异只能解释一小部分已知的遗传。 使用新的研究策略将有助于识别真正的因果变异。 在这项研究中,我们结合韦斯数据,iSelect-based数组数据和地理表达谱紧随其后在体外实验确定小说易感基因。
在发现阶段,我们使用sTDT韦斯数据的分析来确定单核苷酸多态性与300年相比,300年严重CHBVIs兄弟姐妹的影响。 的主要原因选择sib-pairs发现样品的外显子组测序分析家族式的设计有一个优势的病例对照设计人口分层的鲁棒性31。 然后用最小的前4000个snpP值被选为后续复制。 在复制阶段,这些snp基因分型在1648 CHBVIs和1439组成的一个独立样本无关的控制。 我们发现36名义snp位于31基因验证(P< 0.05)协会相同的方向观察发现阶段。 来缩小候选致病基因,我们执行时间分析来研究基因的表达,显示重要的与时间相关的乙肝病毒引起的变化。 我们发现,随着时间的推移,SEC24D乙型肝炎病毒感染后表达明显增加。 此外,基于上述遗传关联研究,SNP rs76459466SEC24D明显与家庭和乙型肝炎病毒感染病例对照样本,还支持哪一个SEC24D作为乙型肝炎病毒感染的易感基因。 综上所述,该协会研究和过程分析表明SEC24D鼓励乙型肝炎病毒感染是一个潜在的候选基因。
SEC24D位于染色体4 q26和编码的蛋白质参与囊泡贩卖,应该影响乙型肝炎病毒感染过程32。SEC24D抑制致肠病的大肠杆菌- - -肠出血性E。杆菌全身的疾病33。 然而,没有报告关于之间的关系SEC24D和乙肝病毒感染。 通过overexpressing或抑制SEC24D表达式,我们检查了乙肝病毒标志物的数量是否发生了变化。 通过提高SEC24D表达式,我们发现蛋白显著减少了大量的病毒dna, HBsAg, e抗原。 ,抑制SEC24D由两个独立的siRNAs产生显著更大数量的病毒dna, HBsAg, e抗原。 这些数据表明,SEC24D起着保护作用对乙肝病毒感染。 此外,WHV模型肝组织的表达谱表现为感染组织中表达降低与未受感染的组织相比,这进一步支持的抗病毒作用SEC24D在HBV-exposed人。 考虑的重要作用SEC24D在乙型肝炎病毒感染,然后,我们探索了可能的生物通路参与通过分析表达数据与乙型肝炎病毒有关的肝癌患者肝组织从96年(补充表1和2)。 当比较高的样品SEC24D表达与低表达,我们发现262个差异基因(错误发现率(罗斯福)问值< 0.005,| |褶皱变化> 1.5),后被显著改变SEC24D失调。 有趣的是,下面的通路富集分析显示最重要的脂肪酸降解途径。 据报道,脂肪酸生物合成参与丙型肝炎病毒基因组的复制,以及乙肝病毒扩散34。 此外,饱和脂肪酸可以抑制乙肝病毒复制的先天免疫反应通过toll样受体435。 因此,我们推测SEC24D抑制乙肝病毒复制通过增加饱和脂肪酸的数量。 然而,这样一种抗病毒信号通路需要验证。
尽管我们确定SEC24D小说乙型肝炎病毒感染的基因,一些局限性的研究需要考虑。 首先,我们限制我们的搜索候选基因与乙型肝炎病毒感染后不断增强的表现。 然而,一些基因可能参与只有在对乙肝病毒的早期反应,和他们的表达不会保持在所有时间点增加。 因此,需要更全面的研究来发现新的基因。 第二,尽管我们选择前4000个snp复制从韦斯分析家庭样本,只有36个snp显示名义与乙型肝炎病毒感染。 这样一个相对较低的复制可能是由于这两种技术的差异(测序和数组)和样品(家庭和病例对照)。 第三,尽管我们发现SNP rs76459466SEC24D在乙型肝炎病毒感染起到了保护作用,我们没有调查这个SNP的潜在的生物功能。 提供清晰的致病性见解乙型肝炎病毒感染,这和其他单核苷酸多态性基因的生物功能值得进一步调查。 尽管这些潜在的局限性,我们综合遗传关联研究,表达数据在体外功能分析来减少假阳性36。
总之,我们首先显示SEC24D作为一种新型基因乙型肝炎病毒感染通过使用一个集成的功能基因组学的关键策略。 未来的研究,如路径分析和SNP功能研究中,需要更好地定义这个基因的机制在乙型肝炎病毒感染的行动。
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