双阴性T细胞介导过敏性哮喘中Lag3依赖性抗原特异性保护
过敏性哮喘是一种气道发炎的疾病没有满意的传统疗法能够控制潜在的病理。 新方法能够克服免疫失调的不利影响从而可取的。 这里我们过继转移卵白蛋白(OVA) peptide-primed CD4−CD8−双重否定T细胞(DNT)静脉注射的小鼠模型OVA-induced发现OVA-induced过敏性哮喘气道高反应性,肺部炎症,粘液生产和OVA-specific免疫球蛋白/ IgE生产明显抑制。 OVA-specific DNT细胞的免疫抑制功能依赖于CD11b的抑制+树突状细胞功能、T辅助滤泡细胞增殖,IL-21生产。 机械化、Lag3有助于mhc ii抗原识别和trogocytosis,从而调节由DNT细胞抗原的免疫调节。 vivo-generated交货的有效性有浓度过敏原特异性DNT减轻气道炎症从而支持细胞的潜在利用率DNT细胞治疗过敏性哮喘的治疗。
过敏性疾病和哮喘的患病率增加在世界范围内,这是当今全球面临的重大挑战,威胁人类健康和经济。 此外,过敏性疾病的复杂性和严重性,包括哮喘,继续增加尤其是儿童和年轻人,谁是轴承的最大负担这些趋势1,2。 过敏性哮喘的特征是高反应性、粘液生产、炎性细胞聚集,有浓度过敏原特异性IgE分泌。 目前最常用的有效的方案是皮质类固醇治疗,但患者通常报告的长期副作用3.。 发展的新方法有更好的疗效和更少的副作用必须改善临床治疗。
Th2细胞被认为是最初的CD4细胞+T细胞分泌pro-Th2炎性细胞因子在哮喘4,5。 这种病态的反应是由于allergen-presenting树突状细胞(dc)6,7。 此外,一个令人信服的报告表明,T卵泡辅助(Tfh)细胞在过敏性哮喘的发病机制发挥意想不到的作用8,9。 T细胞亚群与监管职能被发现并应用于自身免疫性和过敏性疾病的治疗10。
双重否定T细胞(DNT细胞)是独一无二的调节性T细胞抗原表达granzyme B和穿孔素但不具体,是近几十年来发现的11,12。 尽管DNT细胞只占1 - 3%的总外周血中T淋巴细胞和淋巴器官的人类和老鼠,这些细胞免疫系统维持体内平衡至关重要13,14。 我们以前的研究表明,CD4细胞+T细胞转换为DNT细胞,可以显著抑制CD4细胞+CD25−T细胞,主要通过穿孔素/ granzyme B通路15。 DNT细胞的过继转移可以防止和扭转的发生自身免疫性糖尿病和延长胰岛移植物的生存同时保护抗原特异性16,17。 然而,DNT细胞缺乏CD4分子,这是一个关键的TCR coreceptor协助识别与mhc ii互动; 机制,允许DNT细胞识别抗原特异性mhc ii和维护仍是未知的。
在这里,我们表明,DNT细胞的过继转移改善卵白蛋白(OVA)全身的气道高反应性,肺部炎症,粘液,炎症细胞聚集,OVA-specific免疫球蛋白/ IgE生产,同时保留过敏原特异性。 我们还提供证据表明lymphocyte-activation基因3 (Lag3)是一个关键分子对mhc ii抗原识别和trogocytosis从而影响抗原免疫调节DNT细胞。
调查OVA-primed DNT细胞的治疗效果(卵子被平反种族成员)在一种OVA-induced过敏性气道疾病模型中,我们过继转移2×106卵子被平反种族成员到OVA-sensitized小鼠静脉注射后首次挑战1%卵子(无花果。1)。
卵子被平反种族成员抑制OVA-induced气道炎症。一个实验过程的示意图表示。 小鼠致敏和两个腹腔内注射卵白蛋白(OVA)或PBS明矾佐剂在0和14天。 老鼠收到2×106OVA-primed DNT细胞(卵子被平反种族成员)静脉过继转移后第一个1%卵子气溶胶在28天的挑战。 老鼠挑战日报在接下来的两天,牺牲了48 h后气溶胶的挑战。b肺部分沾着他走时,不是衡量渗透炎性细胞和分泌粘液细胞的数量。 (酒吧、100µm)。c气道代指数和金边的价值观进行了24小时后,最后的挑战。d老鼠牺牲后,支气管肺泡灌洗(BAL)液体收集和沾Diff-Quik污渍。 细胞的液体是统计和归类为巨噬细胞,淋巴细胞,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。e嗜酸性粒细胞的百分比和数字(Siglec F+CD11b+CD11c-流式细胞术)在肺部进行评估。 4 - 5实验的结果代表得到了类似的结果。 数据显示为均值±扫描电镜;n= 5老鼠每组。 单向方差分析是用来计算的意义。 *P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P< 0.001。 源数据作为源数据文件提供
见图。1 b,老鼠接受卵子被平反种族成员表现出显著降低肺部炎性细胞浸润和粘液分泌过多而参与老鼠。 探讨肺功能是否改善卵巢DNT注射后,我们测量了金边指数DNT细胞治疗后的老鼠和卵子的挑战。 暴露在高浓度的醋甲胆碱(50 - 100毫克/毫升),金边指数显著降低小鼠卵巢DNT-treated相比控制老鼠(P< 0.001,无花果。1 c)。
显著减少数量的巨噬细胞,淋巴细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞在支气管肺泡灌洗(BAL)流体被发现在卵子DNT-treated老鼠(图。1 d)。 流式细胞术分析还显示一个下降的比例和数量在小鼠卵巢DNT-treated lung-infiltrating嗜酸性粒细胞(P< 0.001,无花果。1 e补充图。1)。 此外,肺巨噬细胞的比例明显下降后卵子DNT治疗(P< 0.05,补充图。2),而肺淋巴细胞和中性粒细胞的比例没有变化(补充图。2 b和1 c)。 这些结果表明DNT细胞可能会限制气道炎症和改善OVA-induced过敏性哮喘。
跟踪卵子DNT体内细胞的迁移,我们生成的MOG -或OVA-primed DNT细胞GFP+CD4+T细胞。 我们通过静脉注射相同数量的GFP+DNT MOG或卵子细胞小鼠OVA-induced哮喘和测量GFP的积累+二硝基酚在不同的组织细胞。 MOG DNT细胞相比,卵子被平反种族成员主要是积累在肺部,落下帷幕,脾和纵隔淋巴结(mLN)的老鼠最后48 h后卵子挑战(图。2 a, b)。 这些数据表明,DNT细胞可以迁移到肺/肺部组织施加保护抗原。 因为小鼠腹腔注射致敏的卵子,这是合理的肠系膜淋巴结(肠系膜LN)显示的百分比增加卵子DNT细胞但不是MOG DNT细胞。
卵子被平反种族成员这时候肺产生一种保护作用。 绿色荧光蛋白+CD4+T细胞转化为卵子或MOG被平反种族成员通过刺激卵子323 - 339或撤走- 55肽。 绿色荧光蛋白+被平反种族成员被用来治疗OVA-induced哮喘。一个的百分比和b绿色荧光蛋白的数量+细胞的细胞在淋巴组织总被流式细胞术进行评估。 数据显示为均值±扫描电镜;n= 4老鼠每组。 学生的t -测试是用来计算的意义。 *P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P< 0.001。 源数据作为源数据文件提供
确定卵子DNT炎症CD4细胞可以抑制细胞因子的分泌+T细胞,我们cytokine-secreting CD4调查+卵子DNT治疗后T细胞在肺部(无花果。3)。 卵子DNT-treated老鼠显示显著降低il - 4, IL-21-secreting肺CD4的数量+比未经处理的小鼠T细胞。 与此同时,我们并没有发现显著差异在IL-13 IL-17或由CD4 IFN-γ分泌+T细胞之间的控制和卵子DNT-treated老鼠。 显著降低血清中il - 4和IL-5水平和BAL液il - 4, IL-5和IL-21水平卵子DNT-treated老鼠还揭示了(图。3 b)。 此外,卵子DNT治疗也显著降低了OVA-specific血清中免疫球蛋白g和免疫球蛋白浓度和平衡液(无花果。3 c)。
卵巢被平反种族成员抑制细胞因子和OVA-specific Ig生产。 OVA-sensitized老鼠接受静脉卵子被平反种族成员后第一个卵子转移的挑战。 老鼠挑战日报在接下来的两天,牺牲了48 h后气溶胶的挑战。一个炎性肺cytokine-secreting CD4+T细胞通过流式细胞仪测定。bELISA的BALF和血清细胞因子水平进行了评估。c的水平OVA-specific BALF和血清免疫球蛋白/ IgE评估ELISA。 数据显示为均值±扫描电镜;n= 4 - 5老鼠每组。 单向方差分析是用来计算的意义。 *P< 0.05; * *P< 0.01。 源数据作为源数据文件提供
总的来说,这些观察结果表明,卵子被平反种族成员有选择地这时候肺/肺部组织和抑制il - 4, IL-21, OVA-specific抗体生产OVA-induced哮喘模型。
Tfh细胞专业提供商的T细胞辅助细胞il - 4, IL-21和抗体生产过敏性气道疾病8,18。 我们检测到显著减少频率和总数量的卵子DNT治疗后肺和BAL Tfh细胞(图4补充图。1 b)。 与此同时,肺CD4的比例的变化+T细胞和Foxp3+Treg细胞并不显著(图。4 b补充图。1 b)。 强大的抗原递呈细胞,CD11b+促炎DCs负责Tfh cell-dependent抗体反应19。 我们的数据表明,频率和总数量的肺癌和mLN CD11b+DCs是卵子DNT治疗后显著降低(图。4摄氏度补充图。1 c)。 此外,CD11c总数的比例+mhc ii+直流人口也减少卵巢DNT治疗后。 然而,我们观察到抗炎CD103无显著变化+直流人口(图。4 d)。 的B细胞产生抗体,肺部也显著降低,mLN BAL流体(图。4 e补充图。1 b)。
选择性地抑制Tfh细胞和CD11b卵子DNT治疗+DCs。 OVA-sensitized老鼠接受静脉卵子被平反种族成员后第一个卵子转移的挑战。 老鼠挑战日报在接下来的两天,牺牲了48 h后气溶胶的挑战。一个肺和BALF Tfh细胞(CD4细胞+B220-CXCR5+PD-1+),bCD4+T细胞(CD4+B220-)和Treg细胞(CD4细胞+B220-Foxp3+)比例通过流式细胞仪测定。c肺和mLN CD11b+直流(CD11c+mhc ii+CD11b+),d直流(CD11c+MHC-9II+)和CD103+直流(CD11c+mhc ii+CD103+CD11b-)比例通过流式细胞仪测定。eB细胞(B220的比例+CD4-)mLN(纵隔淋巴结),用流式细胞术检测BALF和肺。 OVA-stimulated骨髓细胞和卵子cocultured被平反种族成员及刺激与gm - csf (20 ng / ml) 3天测试直接影响卵巢的卵子被平反种族成员直流增殖和分化。f骨骨髓来源的比例DCs和CD11b + DCs通过流式细胞仪测定。 卵巢被平反种族成员的直接影响gcostimulatory分子表达和h细胞凋亡在DCs通过流式细胞仪测定。我卵子四聚物+和四聚物-DNT细胞被从OVA-primed DNT细胞流式细胞术进行排序。 四聚物+或四聚物−DNT细胞cocultured与过敏性哮喘小鼠肺DCs为3天。 小额信贷机构CD86和mhc ii的DCs通过流式细胞仪测定。j肺DCs (2.5×104)从卵子DNT cell-treated或未经治疗的哮喘小鼠cocultured 1×105天真的CD4 + T细胞3天。 IL21 IL4-secreting CD4+T细胞通过流式细胞仪测定。 数据显示为均值±扫描电镜;n= 4 - 5老鼠每组。 单向方差分析和学生的t以及被用来计算的意义。 *P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P< 0.001。 源数据作为源数据文件提供
探讨卵巢被平反种族成员对DCs的影响,我们评估了DCs与卵子被平反种族成员cocultures体外(图3天。4 f-h)。 如无花果所示。4 fCD11b总额的比例+DCs和mhc ii+CD11C+DCs被发现时减少cocultured卵子被平反种族成员。 此外,卵子被平反种族成员也抑制costimulatory分子CD40和CD86的表达DCs(无花果。4 g)。 然而,我们没有发现显著变化凋亡比例的DCs(无花果。4 h)。
此外,我们染色OVA-primed OVA-specific MHC II类四聚体(我被平反种族成员b卵子323 - 339四聚体)。 然后,我们cocultured卵巢四聚物+或四聚物-卵子被平反种族成员与肺DCs OVA-induced过敏小鼠体外3天。 如无花果所示。4我,四聚物+和四聚物−在DCs被平反种族成员显著降低CD86表达,CD86表达明显减少当DCs cocultured四聚物+被平反种族成员。 此外,四聚物+DNT细胞而不是四聚物−DNT细胞也可能抑制DCs表达mhc ii。 这些结果表明,卵子被平反种族成员有选择性地抑制肺DCs,这可能是抑制抗原。
来验证是否卵子DNT cell-treated DCs会抑制Tfh Th2细胞分化,我们从小鼠获得肺DCs与卵子DNT细胞治疗或治疗。 然后,这些DCs与天真的CD4 cocultured+T细胞的5天。 如无花果所示。4 j、卵巢DNT cell-treated肺部DCs诱导IL-21和il - 4含量明显降低生产与DCs与未经处理的小鼠相比。
总的来说,这些数据表明,卵子被平反种族成员有选择地减少肺DCs的比例和抑制他们的成熟,这导致减少Tfh和Th2细胞分化。
基于这样的观察:卵子被平反种族成员有效地抑制OVA-induced过敏性气道炎症,我们质疑卵巢卵子后被平反种族成员获得过敏原特异性323 - 339肽刺激。 CD4+T细胞被转换为DNT细胞与卵323 - 339肽或多肽(MOG无关- 55)。 没有CD11b的表达差异,CD11c, MHCII或CXCR5卵子被平反种族成员和MOG DNT细胞之间被发现(补充图。3.)。 致敏C57BL / 6小鼠,挑战与卵子,卵子被平反种族成员对待或MOG-primed DNT细胞(MOG被平反种族成员)如前所述。 有趣的是,MOG被平反种族成员未能抑制OVA-induced过敏性气道炎症和肺嗜酸性粒细胞聚集(图5 a、b)。 同样的,我们没有发现显著减少在DCs的积累,CD11b+DCs和Tfh细胞MOG DNT治疗后(图5 c, d)。
卵子被平反种族成员专门保护小鼠免受OVA-induced气道炎症。 老鼠收到MOG被平反种族成员或卵子被平反种族成员通过静脉过继转移治疗OVA-induced气道炎症。一个肺癌部分是沾)来衡量浸润炎症细胞的积累。 (酒吧、100μm)。b嗜酸性粒细胞(Siglec F+CD11b+CD11c−流式细胞术)在肺部进行评估。c肺DCs (CD11b+CD11c+mhc ii+),dTfh细胞(CD4+B220-CXCR5+PD-1+流式细胞术)进行了评估。 两个实验的结果代表类似的结果。 数据显示为均值±扫描电镜;n= 5老鼠每组。 单向方差分析是用来计算的意义。 *P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P< 0.001。 源数据作为源数据文件提供
进一步证实抗原抑制DNT细胞在过敏性哮喘,我们与HDM诱发过敏性哮喘(屋尘螨)提取BALB / c小鼠(补充图。4A)。 HDM或OVA-primed DNT细胞过继转移到小鼠HDM-induced过敏性哮喘。 与之前的结果相似,HDM DNT细胞,而不是卵子DNT细胞,显著改善炎症细胞浸润(补充图。4 b)和减少嗜酸性粒细胞的积累(补充图。4摄氏度(补充图),Tfh细胞。4 d)和CD11b + DCs(补充图。4 e)。
这些结果表明,DNT细胞抑制过敏性气道炎症,同时保持过敏原特异性。
CD4 T细胞受体的分子coreceptors至关重要,有助于识别抗原肽mhc ii分子的抗原递呈细胞”。 DNT细胞保持抗原的特异性和识别卵子肽由树突细胞没有CD4的表达仍然是未知的。 Lag3据报道是一个分子可以与亲和力高于CD4结合mhc ii20.。 因此,我们测量Lag3 DNT细胞表达。 相比之下,CD4+T细胞,DNT细胞表现出显著的调节滞后根据实时PCR结果(图3的表达。6a)。 明显的表达增加Lag3也证实了流式细胞术(无花果。6 b)。
Lag3击倒了抗原抑制卵巢被平反种族成员。 相对Lag3信使rna表达卵巢被平反种族成员及CD4细胞+T细胞是衡量一个实时PCR和b流式细胞术。 老鼠收到WT卵子被平反种族成员或Lag3−−/卵子被平反种族成员通过静脉过继转移治疗OVA-induced气道炎症。c肺癌部分是沾)来衡量浸润炎症细胞的积累(酒吧、100μm)。d肺嗜酸性粒细胞(CD11b+Siglec F+CD11c-),eDCs (CD11c+mhc ii+),CD11b+DCs (CD11b+CD11c+mhc ii+),fTfh细胞(CD4+B220-CXCR5+PD-1+流式细胞术)进行了评估。gGzmB WT被平反种族成员及表达式Lag3−−/被平反种族成员通过流式细胞仪测定。h相对Prf1和Fasl信使rna在WT被平反种族成员及表达水平Lag3−−/被平反种族成员被实时PCR测定。我DNT被流式细胞术检测细胞的凋亡。jCD69的表达和Ki67被流式细胞仪检测。 数据显示为均值±扫描电镜;n= 4 - 5老鼠每组。 单向方差分析和学生的t以及被用来计算的意义。 *P< 0.05; * *P< 0.01; * * *P< 0.001。 源数据作为源数据文件提供
揭示是否Lag3 DNT细胞对抗原特异性表达的DNT细胞,我们比较Lag3-deficient DNT细胞的抑制作用与WT DNT细胞体内。 CD4+CD25-从WT或T细胞Lag3−−/老鼠转换为卵子被平反种族成员。 如无花果所示。6摄氏度的过继转移Lag3−−/卵子被平反种族成员未能改善OVA-induced气道炎症。 此外,嗜酸性粒细胞的百分比,DCs和CD11b+DCs显示无显著差异Lag3−−/卵子DNT-treated组和对照组(无花果。6 d, e)。 考虑到DCs和Tfh细胞之间亲密联系,我们也观察到的Tfh的细胞群之间没有明显的变化Lag3−−/卵子DNT-treated组和对照组(无花果。6 f)。
DNT细胞控制免疫反应主要是通过穿孔素/ granzyme和Fas / Fas L通路13,15,21。 调查是否削弱的免疫抑制活性Lag3−−/卵子被平反种族成员的差别是与对这些途径,我们评估在DNT细胞抑制基因表达。 如无花果所示。6克无显著差异,观察WT与granzyme B表达Lag3−−/卵巢被平反种族成员通过流式细胞术。 信使rna表达水平Prf1和Fasl也在WT和类似的吗Lag3−−/卵巢被平反种族成员(图。6小时)。 中细胞凋亡DNT略微增加的比例Lag3−−/细胞,但差异不显著(图6我)。 有趣的是,类似于CD4细胞+T细胞22,Lag3−−/DNT细胞CD69表达水平显著增加细胞的激活标志和增殖标记Ki67 WT DNT细胞(图。6 j)。
总的来说,Lag3损耗减少了抗原抑制卵巢被平反种族成员,这减少抑制无关DNT细胞激活,细胞凋亡,或穿孔素,granzyme或Fas L表达式。
调查的影响Lag3由DNT细胞抗原识别,我们评估了WTLag3−−/卵子被平反种族成员通过OVA-specific MHC II级四聚体染色(我b卵子323 - 339四聚体(图)。7一个)。 的比例明显高于我b卵子323 - 339tetramer-positive细胞在卵巢DNT细胞与OVA-primed相比Lag3−−/DNT细胞或MOG-stimulated WT DNT细胞。 相比之下,卵巢tetramer-positive细胞的比例Lag3−−/二硝基酚与卵子细胞启动323 - 339肽没有明显不同,在WT或滞后3-deficient DNT细胞刺激了MOG肽(无花果。7一个)。 澄清是否Lag3由自然DNT细胞对抗原的识别也很重要,从WT或天真自然DNT细胞Lag3−−/与C57BL / 6 j小鼠cocultured mdc 50 ng / ml rmIL-2和1μg /毫升卵子329 - 3395天。 激活和新鲜天真WT或孤立Lag3−−/DNT细胞沾OVA-specific MHC II级四聚体(我b卵子323 - 339四聚体)。 如补充图所示。5,尽管平均卵tetramer-positive自然DNT细胞细胞百分比低于的CD4 T细胞刺激成为DNT细胞,一个更高比例的我b卵子323 - 339tetramer-positive细胞仍在OVA-primed自然WT DNT人口与OVA-primed相比Lag3−−/自然DNT细胞或天真DNT细胞群。 这些结果表明,Lag3也参与自然DNT细胞的抗原识别。
Lag3-dependent抗原抑制卵巢被平反种族成员。一个OVA-specific DNT细胞被OVA-tetramer-PE染色评估。 WT或Lag3−−/CFSE-labeled DNT细胞孵化与DiD-labeled DCs 24 h。bmhc ii分子和c后由DNT细胞捕获coculture通过流式细胞仪测定。 两个实验的结果代表类似的结果。d绿色荧光蛋白+DNT细胞分析了共焦荧光显微镜在孵化后肺DCs DiD-labeled 24 h(酒吧、规模5μm)。e我一b对DCs和Lag3表达GFP表达+DNT细胞分析了共焦荧光显微镜。 (酒吧、规模5μm)。 数据显示为均值±扫描电镜;n= 4 - 5老鼠每组。 学生的t以及用于计算的意义。 *P< 0.05; * *P< 0.01。 源数据作为源数据文件提供
最近的证据表明,trogocytosis对抗原收购DNT细胞很重要23。 如无花果所示。7 b, c,从哮喘小鼠肺DCs沾的分子探针,具有很强的荧光时纳入膜24为24小时,cocultured DNT细胞。 mhc ii分子表达和染色明显减少Lag3−−/DNT细胞比WT DNT细胞。 直接观察trogocytosis过程,我们cocultured GFP+DNT细胞和肺DCs贴上。 共焦显微镜显示DiD-labeled碎片的直流等离子体膜易位到DNT细胞(无花果。7 d)。 此外,DCs和GFP+DNT细胞表面Lag3和mhc ii也染色,分别。 有趣的是,我们观察到Lag3主要富集在表面DNT细胞有直接接触DCs(无花果。7 e)。
总体而言,这些数据表明Lag3重要DNT细胞和抗原递呈细胞之间的相互作用。 DNT细胞可以从树突细胞获得获得分子mhc ii抗原特异性Lag3的协助下。
目前治疗过敏和自身免疫性疾病通常依赖于非特异性免疫抑制和导致不良反应或其他疾病的病人。 创新战略目标allergen-induced特异性免疫反应将提供防止不必要的副作用或死亡的好处,提高患者的生活质量。
DNT细胞是一个独特的类型的调节性T细胞和免疫系统维持体内平衡至关重要13,14。 我们之前确定转换CD4细胞的分化途径+T细胞成DNT细胞15,21。 CD4+T cell-converted DNT强有力地抑制细胞活力紧密相联的,自身免疫反应,长期胰岛和皮肤同种异体移植物存活率和预防和治愈的自身免疫性1型糖尿病15,16,17。
在这项研究中,开发一个细胞治疗过敏性哮喘,我们天真的CD4转换+T细胞OVA-specific DNT细胞体外。 过继转移OVA-primed DNT细胞主要积累在肺部,BALF和脾脏明显抑制OVA-induced气道炎症和抑制粘液分泌过多,支气管代答,嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的浸润。 保护从DNT OVA-induced过敏性气道炎症介导细胞介导的抑制和CD11b Tfh细胞+DCs和IL-21分泌降低,il - 4, OVA-specific抗体。
Tfh细胞辅助T细胞的一个子集为B细胞提供专业帮助,促进抗体的生产25。 此外,Tfh细胞负责启动2型过敏性哮喘8,9,26。 我们的研究表明,DNT细胞治疗显著降低的比例Tfh IL-21分泌细胞和减少OVA-induced过敏性气道疾病,这证明了二硝基酚的直接影响细胞改善过敏性哮喘。 Tfh细胞启动需要costimulatory信号从DCs在淋巴组织,和抗原呈递DCs最佳抗原Tfh细胞的发展至关重要25。 CD11b的关键作用+DCs引发过敏反应已被广泛证实27,28。 此外,CD11b-DCs,尤其是CD103+DCs,似乎抑制过敏性气道炎症29,30.。 这里我们的数据表明,卵子DNT治疗诱导选择性减少CD11b的比例+DCs,主要Tfh-promoting直流子集。 我们没有观察到任何监管CD103明显的变化+DCs或Foxp3+Treg细胞后卵子DNT治疗。 体外coculture骨骨髓来源的DCs和DNT细胞显示显著的抑制效应的DNT细胞增殖,分化和CD11b costimulatory分子表达+DCs。 卵子DNT cell-treated肺DCs诱导显著降低IL-21和il - 4生产与DCs与未经处理的小鼠。 这些数据表明,对CD11b DNT细胞有直接抑制的影响+DCs,进一步抑制Tfh细胞活化和细胞因子的分泌。
先前的研究表明,小鼠和人类DNT细胞抑制同种异体免疫反应和自身免疫反应在一个Ag-specific时尚11,12,15,16。 T细胞已被证明收购类MHC I和II级分子抗原递呈细胞”31,32。 福特等人表明,天真的DNT细胞还可以通过trogocytosis体内获得同种抗原23。 在异基因造血干细胞移植研究中,DNT细胞作为类MHC I /肽反应性T细胞,导致抗病毒免疫反应; 这些结论支持了抗原* 24:02 EBV四聚物测试和观察EBV (BZLF1)特殊细胞因子分泌来响应特定的肽33。 据报道Leishmania-reactive DNT细胞mhc ii限制,反mhc ii抗体阻止核扩散和IFN-γCD4的生产+和DNT细胞剂量依赖性的方式。 此外,Leishmania-infected BMDCs从mhc ii KO小鼠未能诱导增殖和在DN和CD4 IFN-γ生产+T细胞。 相比之下,核扩散和DNT IFN-γ生产细胞的影响最小coculture被感染从CD1d BMDCs KO小鼠后,确认DNT细胞大多mhc ii限制34。 然而,随着DNT细胞缺乏的表达mhc ii coreceptor CD4, mhc ii的识别和维护DNT抗原特异性的细胞仍不清楚。
在我们的研究中,与CD4相比+T细胞,DNT细胞表现出升高Lag3表达式。 Lag3是一种跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族。 比较肽分析Lag3和CD4显示两个分子之间的密切关系35。 Huard等人表明,与相应的CD4分子相比,人类和老鼠Lag3显示对mhc ii 100倍高活动性20.。 有趣的是,在我们的研究中,一个更高比例的我b卵子323 - 339tetramer-positive细胞中观察到OVA-primed DNT细胞相比Lag3−−/DNT细胞。 Lag3-deficient DNT细胞显示弱mhc ii OVA-induced哮喘识别和治疗效果。 此外,我们观察到Lag3积累在DNT细胞和DCs之间的接触表面。 这些结果表明Lag3重要作用的DNT细胞和DCs之间的交互。 Trogocytosis信息contact-dependent膜转移过程通常发生在淋巴细胞和抗原递呈细胞之间36。 在这项研究中,我们也发现了细胞间转移mhc ii和质膜之间的Lag3 DNT细胞和DCs之间的分子。 因此,我们的研究显示,DNT细胞trogocytosis展出并获得抗原特异性Lag3的协助下。
Lag3是一种公认的标记的老鼠和人类T监管1型细胞(Tr1)细胞37。 Tr1细胞优先产生il - 10和发挥免疫抑制作用。 Lag3过继转移+CD49b+CD4+Tr1细胞改善过敏性哮喘10。 然而,是否Lag3调节Tr1细胞的免疫抑制作用还不清楚。 据报道Lag3也是Foxp3的必要条件+Lag3 Treg功能- / -亚展览减少抑制活动38。 据报道,Lag3内在有限Treg炎症的扩散和功能在网站自身免疫性糖尿病模型39。 的过继转移Lag3-deficient亚无法减弱过敏性炎症,展示IL-27 / Lag3轴的关键作用调解Treg过敏性炎症的控制40。 不像Tr1细胞和具体+亚群,既高度表达Lag3 DNT细胞不产生il - 1021并没有具体15,21表达式。 Lag3表情DNT细胞有助于mhc ii抗原识别,从而影响抗原免疫调节的DNT细胞。
总之,vivo-generated, CD4 T cell-converted过敏原peptide-primed DNT细胞施加强大的抗原免疫监管影响allergen-induced小鼠哮喘模型。 高架Lag3表达和trogocytosis由DNT细胞mhc ii抗原识别。 这些数据支持的概念和可行性可能利用这种细胞有浓度过敏原特异性治疗方法的临床治疗过敏和哮喘。
野生型(WT) C57BL / 6 j BALB / c和C57BL / 6 j-gfp,Lag3−−/老鼠从杰克逊实验室购买。 动物被安置和温度控制的环境中特定的无菌条件下饲养在12 h在北京友谊医院光/暗周期。 所有程序都按照指导方针的执行机构的动物保健和在北京友谊医院伦理委员会。
DNT转化细胞在体外进行如前所述15,16。 简单、成熟树突状细胞(mdc)是从lipopolysaccharide-stimulated骨髓细胞来源于C57BL / 6 j小鼠和根据CD86-positive选择分开。 C57BL / 6 j或C57BL / 6 j-gfp CD4+T细胞是孵化与C57BL / 6 j mdc 50 ng / ml rmIL-2(美国PeproTech)和1μg /毫升卵子329 - 339肽,MOG- 55肽(Sigma-Aldrich)或HDM提取(Greer) 7天。 CD3+CD4−CD8−NK1.1−使用FACSAriaII DN细胞分类分选机(美国BD生物科学)。
六到八周大的雄性C57BL / 6 j小鼠腹腔注射致敏的20µg卵子(Sigma-Aldrich) 50μl Imject™明矾佐剂(热费希尔科学)的总量100μl 0和14天。 控制老鼠收到明矾佐剂(PBS)。 开始注射后28天,小鼠暴露于雾化1%卵子(在0.85%氯化钠溶液)30分钟/天,连续3天。 在28天,交货vivo-converted OVA-primed DNT细胞(2×106)都被转移到小鼠尾静脉注射后的第一吸入1%卵子。 HDM-induced过敏性哮喘模型,8-week-old雌性BALB / c小鼠腹腔注射致敏的100µg HDM提取(Greer) 50μl Imject™明矾佐剂。 致敏的小鼠注射(i.n) 25µg HDM提取经连续5天每天从7天。 前女友vivo-converted HDM-primed DNT细胞(2×106)被转移到小鼠尾静脉注射后第一个i.n.挑战。
24小时后卵子气溶胶挑战,醋甲胆碱决心使用无创性气道高反应的整个身体体积描记法(EMKA技术)。 老鼠被放置在个人钱伯斯和暴露于喷雾醋甲胆碱(0、12.5、50或100毫克/毫升在PBS, 0 mg / ml基线)2分钟后跟一个1分钟的休息。 增强的停顿(金边)然后测量了3分钟。 金边的平均价值被表示为每个醋甲胆碱浓度与基线相比金边值。
气管插管,洗两次1毫升的PBS隔离肺。 肺、淋巴结(肠系膜,腹股沟,腋窝和纵隔)和脾脏RPMI 1640中进行处理。 PBS是注入右心室冲洗循环血细胞。 肺与组织切成小块,消化消化解决方案(0.5毫克/毫升胶原酶IV + 8μg /毫升DNase我在哈佛商学院包含5%的边后卫)20分钟前通过70 -µm细胞组织通过一个过滤器(BD生物科学)。 单个细胞的选择Aqua-stained(生活)和CD45+细胞数量。 红细胞裂解缓冲(试剂盒)是用来溶解红细胞。 的支气管肺泡灌洗(BAL)液体沾Diff-Quik污点工具包(Solarbio)根据制造商的指示。
OVA-specific免疫球蛋白和IgE水平测定在支气管肺泡灌洗(BAL)和血清样本收集的实验。 短暂,OVA-specific免疫球蛋白和IgE,一夜之间,high-binding盘子被涂在4°C 5μg /毫升卵子在碳酸盐缓冲,堵塞2%牛奶/ PBS和孵化1:1000-1:10,000血清稀释。 与HRP-conjugated OVA-specific免疫球蛋白检测鼠anti-mouse IgG抗体(Zsbio)。 信号是由孵化与三甲标准解决方案,光密度是阅读在450海里。 总IgE水平量化捕获马伯,生物素检测马伯,并从鼠标streptavidin-HRP IgE ELISA Ready-SET-Go ! 工具包(eBioscience)。 阅读也获得生成标准曲线与纯化小鼠IgE准备。
IL-21生产量化与小鼠血清和BALF IL-21酶联免疫试剂盒(eBioscience)根据制造商的指示。 标准曲线的制备与纯化IL-21老鼠。 的浓度检测il - 4和IL-5 LEGENDplex Multi-Analyte流分析工具对鼠标Th细胞因子(BioLegend)根据制造商的指示。 分析了FACSAriaII (BD生物科学)和LEGENDplex软件(BioLegend)。
串行部分是从formalin-fixed准备、石蜡包埋的肺部组织。 被染色的部分)或周期性acid-Schiff (PAS)试剂和扫描×20放大DM 2500(徕卡公司)。 图片是准备使用LAS版本4.6.1软件(徕卡应用程序套件软件)。 分泌粘液细胞在气道(平均100年10×μm字段)使用光学显微镜检测。 黏液充满的数量(不是+)/ 100μm气道上皮细胞被蒙蔽的方式列举41。 炎性浸润分析得分如下:没有得分为0,1表示“罕见的渗透”,2表示“温和的”(只在局部区域),3:表示“温和的”(< 5细胞株深)和4:表示“严重”(> 5行细胞深)42。 所有成绩都是蒙蔽的方式列举2蒙蔽独立调查人员。
Anti-CD11b (ICRF44,猫稀释1∶101206),anti-CD11c (N418,猫稀释1∶117318),anti-I-A / i (M5/114.15.2,猫稀释1∶107614),anti-CD8a(53 - 6.7,稀释1:50 0,猫100714),anti-CD103 (M290,猫稀释1∶557495),anti-CD40(3/23,稀释1:10 0,猫124611),anti-CD80 (16-10A1,猫稀释1∶104707),anti-Siglec F(猫e50 - 2440,稀释1∶562680)和anti-Ly-6G (RB6-8C5,猫稀释1∶108408)抗体被用来识别直流和粒细胞的人群。 Anti-CD4(猫GK1.5稀释1:50 0,100428),anti-B220 (RA3-6B2、稀释1:400猫103206),anti-CXCR5(猫SPRCL5稀释1:10 0,551960),anti-Foxp3(猫PCH101稀释1:10 0,45-4776-42),anti-GzmB (GB11,猫稀释1∶561142)和anti-PD-1 (29 f。 猫1 a12,稀释1∶135216)抗体和Streptavidin-APC(猫稀释1∶405207)被用来识别T细胞的数量。 猫Anti-IL4 (11 b11,稀释1∶504103),anti-IL-13 (eBio13A,猫稀释1∶12-7133-41),anti-IL-17A (TC11-18H10,猫稀释1∶506903),anti-IL-21(猫4 a9,稀释1∶131905)和anti-IFN-γ(XMG1.2,猫稀释1∶505808)抗体被用来识别cytokine-producing CD4+T细胞。 僵尸AquaTM可确定的生存工具被用来排除死细胞。 僵尸AquaTM可确定的可行性和fluorochrome-conjugated抗体购自BioLegend, eBioscience或BD Pharmingen。
卵巢四聚物染色,悬浮细胞被沾染了我b卵子323 - 339tetramer-PE (MBL)在4°C 1 h。 表面添加了标记抗体没有洗和孵化15分钟。 流式细胞术检测前的细胞被洗一次。 数据收集使用FACSAriaII (BD生物科学)和分析FlowJo软件(树明星)。
卵子DNT从CD4细胞被转换+T细胞如上所述。 CD11c+mhc ii+肺DCs排序从OVA-induced过敏性哮喘小鼠FACSAriaII分选机。 总共4×104DCs是cocultured 2×104卵巢被平反种族成员为3天。 的比例和costimulatory分子表达DCs通过流式细胞术进行评估。
CD11C+mhc ii+肺DCs被流式细胞术进行排序。 5µg /毫升做染料(热费希尔科学)添加到1×106/毫升DCs采用无血清悬浮RPMI 1640中。 DCs是孵化为20分钟37°C和洗两次RPMI 1640中含有10%的边后卫。 直接调查trogocytosis过程,我们cocultured 5×105绿色荧光蛋白+卵子被平反种族成员及DiD-labeled DCs 24 h 24-well板1:1的比例。 共焦显微镜,抗体是兔子anti-mouse Lag3抗体(Abcam)和mouse-purified anti-mouse我b(Biolegend)和DAPI被用作核染色(分子探针)。 驴anti-rabbit免疫球蛋白Alexa萤石546和驴anti-mouse免疫球蛋白Alexa萤石647(热费希尔科学)是用于检测的主要Abs。共焦进行了分析使用共焦激光扫描显微镜(FLUOVIEW FV1000,奥林巴斯)。 图像数据FV10-ASW 4.2显微镜获得的软件。
总RNA提取RNeasy微工具包(试剂盒),和互补脱氧核糖核酸是反向转录'脚本®RT试剂盒(豆类)。 实时PCR与7500年执行快速实时系统(应用生物系统公司)使用SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司)。 在这项研究中使用的引物补充表中列出1。 实时PCR相关值进行了计算与比较Ct方法和规范化对管家基因的表达β-actin。
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