牛金黄色葡萄球菌的宿主内进化选择SigB缺陷型致病型，其特征在于毒力降低但蛋白水解活性增强和生物膜形成
金黄色葡萄球菌牛乳腺炎的主要原因是,通常导致持久,持久和复发性感染。 因此,年代。葡萄球菌不断改进和牛乳房永久适应环境。 在这项工作中,我们紧随其后年代。葡萄球菌在宿主适应的三个月自然感染奶牛与慢性亚临床乳腺炎。 全基因组序列分析显示一个完整的初始主要变体的替换另一个同基因的变体。 我们报告首次在宿主进化向σ因子SigB-deficient致病型年代。葡萄球菌牛乳腺炎,单核苷酸多态性rsbU(G368A→G122D), SigB-functionality贡献者。 的出现SigB-deficient致病型展览大量转移到新的表型性状组成强大的蛋白水解活性和保利-N乙酰氨基葡萄糖(PNAG)的生物膜的生产。 这可能解锁新的营养资源和促进免疫逃避,可能促进细胞外主机内的持久性。 此外,我们观察到的一种适应性对减毒毒性使用鼠标感染模型。 本研究扩展了SigBσ因子的作用年代。葡萄球菌发病机理,描述到目前为止在慢性感染细胞内所需的持久性。 我们的研究表明,年代。葡萄球菌SigB-deficiency的另一种机制是坚持和巩固葡萄球菌的临床相关性SigB-deficient变异人类慢性感染过程中始终是孤立的。
金黄色葡萄球菌是一个重要的机会性细菌病原体感染人类和多种动物,尤其是奶牛。 在世界范围内,年代。葡萄球菌全身的牛乳腺炎是乳制品行业最大的一个问题对动物福利与强烈的负面影响,食品安全和效率1。 此外,牛最近被确定为主要动物小说来源的人类流行克隆,突显他们的人畜共患的潜力2。 大多数这些感染是慢性、亚临床和以长期乳房内的持久性3.。 目前的治疗用抗生素是低效的,往往会导致复发性感染和最终过早扑杀和替换不可救药的牛。 疫苗接种牛年代。葡萄球菌感染尚未被证明是有效的4。
在牛,两个克隆复合物(CC97 CC151)被描述为最成功的血统,携带不同的分子遗传特性,优化诱导和维持乳腺微环境内的感染5,6。 一些研究报道的周期性复苏隔离属于相同的克隆,表明年代。葡萄球菌宿主适应牛乳腺导致单个或几个在一群坚持亚型7,8。 Niche-specific改变由于宿主中的适应与切换到小殖民地相关变异(scv),并发缓慢增长和减少新陈代谢9。 此外,损失的荚膜多糖(CP),一个重要surface-associated毒性因子,与慢性乳腺炎10。 事实上,一些研究显示non-encapsulated患病率高年代。葡萄球菌菌株在牛、慢性乳腺炎(86%)11,12。 non-encapsulated菌株的患病率也在慢性高于在急性感染人类13,CP表达下降可能是一个关键年代。葡萄球菌表型特征与长期性。 Non-encapsulated菌株都能更好地进入上皮细胞,避免进一步的免疫清除,而CP表达年代。葡萄球菌菌株被证明保护自己免受专业和非专业吞噬作用10。 我们最近表明,胶囊损失,以及入侵内皮细胞和生物膜形成能力与乳腺的长期持久性属性8。 然而,允许主要的遗传和分子机制年代。葡萄球菌亚型成功甚至持续多年来在牛乳房还远未理解。
最近的研究集中在遗传和表型性状的比较基于乳腺炎参考菌株,或临床乳腺炎隔离不同的克隆起源或不同的within-herd患病率8,14,15。 到目前为止,还没有研究年代。葡萄球菌在宿主适应在慢性进展,牛乳腺炎。 在目前的研究中,我们分析了一组分离,收集的三个月从奶牛患有慢性亚临床和未经处理的牛乳腺炎。 获得一个全面的照片在宿主适应,我们进行了深入调查,在牛宿主病原体的进化。
因为降低CP表达式是持久性的指标,我们监视这些变化年代。葡萄球菌使用高通量分离收集从几个奶牛胶囊血清学分型系统16。 从自然感染奶牛,21纵向分离收集相同的乳房季度描绘了从封装到non-encapsulated隔离。 层次聚类分析的光谱傅里叶变换红外(FTIR)光谱数据(图。1)表明,星期5,只有封装(CP5)隔离恢复。 在星期6,封装(CP5)和non-encapsulated隔离都在相同的样本,发现只有non-encapsulated隔离后剩下的星期6,直到结束的抽样过程(14周)。 此外,non-encapsulated隔离显示亏损色素(无花果。1和图S1A),对兔血浆凝固酶活动的损失(无花果。1和无花果。印地C)和强烈的蛋白水解活动增加对牛奶中酪蛋白(无花果1和S3A B)。
层次聚类分析的红外光谱谱数据和表型变化。 红外光谱是用来跟进年代。葡萄球菌荚膜的表达21临床乳腺炎隔离的一种慢性、亚临床牛乳腺炎和显示从封装到non-encapsulation伴随着明显的表型特征的变化。 在最初的隔离; 哈,host-adapted隔离。
深入调查分离株之间的遗传差异,进行了全基因组测序对所有21隔离使用“MiSeq illumina公司平台。 首先,所有隔离被分配到克隆复杂CC97 ST352序列类型。 基因组比较分析证明了克隆祖先,17个snp检测中总共21隔离,导致九同基因的变异(V1到V9)(图。2)。 检测到突变都总结在表S1。 在采样的开始,变体V1,包括第一隔离(在),占主导地位。 星期6,进一步变异来源于V1。 这些隔离分开V1由一个到四个snp。 从星期6起,变体V8在13周左右观察,成为主导。 突变早期隔离(V2- v7)可能发生一个健身成本,因为这些变异被发现后树苗。 相比之下,一个三个单核苷酸突变,区分V的隔离8从V1,可能授予一个优势,因为这些隔离迅速取代V1作为主要变体。 所有的三个单核苷酸突变导致了氨基酸的改变:σ因子SigB积极的监管机构之一,rsbU(SA1872)和两个假想的蛋白质SA0212和SA0192。 在确定的错义突变rsbU(G368A)编码一个甘氨酸/天冬氨酸替代(G122D) c端磷酸酶域中(无花果。2 b)。 最后一周的抽样(14周),最后分离收集,这被认为是host-adapted (HA)隔离,怀有一个额外的SNP在一个假定的蛋白质(SA1828),尽管显示相同的表型V8。
基因组比较分析21收集乳腺炎隔离,RsbU突变和配置asp23RT-qPCR。 (一个)每个圆圈都代表一个同基因的变体(变体1 = V1等),根据菌株SNP的区别,圆的大小与隔离携带它的数量和圈的距离彼此对应SNP (s)的数量。 分离收集的数量在一个特定的周(W1-14)显示在括号(一个隔离第一星期,W1(1)等等)。 见表S1获取详细信息。 v,变异; w,周取样; 在最初的隔离; 哈,host-adapted隔离。 (B)遗传位点编码SigB表达式年代。葡萄球菌。 的灰色地带rsbU基因代表了基因序列的SNP (G368A) HA隔离被确认。 相应的protein-missense突变(G122D) RsbU卡通用红色表示。 (C)Asp23的表达菌株生长在TSB OD 600海里的2.5和5.0被RT-qPCR评估。 数据显示三个独立的方式种植株及其技术副本。 统计差异表达的初始host-adapted隔离决心和未配对的学生t测试log10转换数据。 (* * * P < 0.001)。 在最初的隔离; 哈,host-adapted隔离。
因为我们确定一个SNPrsbU随着失去色素在HA隔离,我们试图确定是否HA隔离与SigB相关联-表现型评估不足asp23基因表达,SigB-functionality的标志17中存在。Asp23信使rna水平明显下降的HA与隔离(无花果。2摄氏度)。 这是一致的(P = 0.013)减少73.4倍Asp23蛋白质丰富的哈,从整个细胞的蛋白质组学方法获得分数(数据未显示)。 作为SigB缺乏控制,我们包括一组同基因的菌株,一个功能齐全的SigB (SH1000,rsbU修复8325 - 4株)和两个菌株与已知受损(8325 - 4,自然11-bp SigB功能rsbU删除和SH1000∆sigB突变体)和评估他们asp23转录。 正如预期的那样,最高SigB-functional应变SH1000获得基因表达,而显著减少asp23表达式被发现8325 - 4和SH1000∆sigB在我们的实验设置(无花果。S2)。 详细的初始表型特征(在第一个采样点,采集)最后隔离(哈,孤立的三个月后)进行。
的一个新的显著的表型特性host-adapted, SigB-deficient隔离是他们显示一个特定的蛋白水解作用强劲1%脱脂牛奶汤以及1%脱脂牛奶琼脂(无花果1和S3)。 相对评估这个蛋白水解活性,年代。葡萄球菌6850年,同基因的的压力sigB有缺陷的突变(6850∆sigB),后者也退化的牛奶蛋白质,但在一个小得多的程度上比HA隔离。 没有牛奶蛋白降解是在隔离观察和6850年野生型菌株(无花果。S3A B)。
探索分泌,保持酶的活性蛋白质与酪蛋白,牛奶中的主要蛋白质成分,zymography执行使用酪蛋白为底物(无花果。3)。 HA而不是在孤立完全退化酪蛋白在大约30 kDa OD6005.0。 几个子表单谷酰基的蛋白质肽链内切酶(SspA)可以检测到2 d-differential凝胶电泳(消化)——MALDI-TOF-MS /女士稍微有不同的等电点(p我)和分子量(无花果。3 b)。 特别是前肽的肽段SspA (pro-SspA)斑点检测3、4和5 MALDI-TOF-MS / MS,但缺席现货6(图。S4),这被证明是在步进式释放蛋白水解处理SspA激活18图中描述的更详细。S5。 此外,锌metalloprotease aureolysin(本身)是只检测到的哈,但不是在隔离的上层清液中蛋白质含量(无花果。3 b)。 这是支持的测试本身mRNA表达,存在,显示出很强的upregulation公顷相比在隔离(图。3 c)。
蛋白水解活性。 (一个)凝胶zymography酪蛋白。 sds - page补充1%酪蛋白为底物,一个白人乐队代表酪蛋白消化。 (B)代表双通道的凝胶图像secretomes初始(绿色通道)和host-adapted(红色通道)隔离在不同OD读数。 不同的丰富的蛋白质被MALDI-TOF-MS /女士(见图。S4)(C)本身的表达菌株生长在TSB的光密度2.5和5.0。 数据显示三个独立的方式种植株及其技术副本。 统计差异表达的初始host-adapted隔离决心和未配对的学生t测试。 (* * * P < 0.001) (D蛋白水解级联卡通,包括蛋白质的分子量(MW)和等电点(p我),改编自萧伯纳等。33。 原来,全长zymogel / 2 d-dige凝胶补充信息图所示。S7。 在最初的隔离; 哈,host-adapted隔离; SspA,谷酰基肽链内切酶; SspB staphopain B; 本身、锌metalloprotease aureolysin。
接下来,我们测试了增加生产α溶血素(Hla),进一步SigB-deficiency众所周知的表型19。 的转录表达hla和分泌的蛋白质(Hla)透露公顷相比的显著增加隔离(图。S6A B)。 然而,测试不同溶血发现细菌到绵羊血琼脂(CBA)显示一个下降溶血性活动相比,HA(图。S6C-E)。
细菌内化后评估两个小时co-incubation细菌和牛乳腺上皮细胞(MAC-T)比较哈,另外包括第一分离收集显示SigB-deficient变体(V8; 隔离15星期6)测试后表型变化可能引起一个额外的SNP在HA隔离。 吸收的HA隔离在隔离相比显著降低(P = 0.0042)(图4A)。 后续生存MAC-T细胞进行实验在24 - 48小时内感染后。 没有区别在胞内持久性MAC-T细胞被观察到在任何两个时间点的和HA隔离(无花果。4 b, C)。 除了较低的内化,HA隔离也表现出显著降低绑定固定化牛纤连蛋白(; P < 0.001),确定一个标准的结晶紫蛋白结合试验(无花果。4 d)。 我们没有得到差异无论是在内化,持久性也绑定到两国SigB-deficient纤连蛋白变体,V8和V9(公顷)。
细菌在MAC-T细胞内化和生存24小时和48小时后固定化牛纤连蛋白和绑定。年代。葡萄球菌菌株被上皮牛细胞系的细胞培养2 (一个)、24日(B)或48小时(C)感染后,细胞外被溶葡球菌酶的细菌。 细菌数量的内化和细胞内生存所示图表a - c和代表的意思是集落形成单位每毫升±SEM、溶葡球菌酶治疗后恢复。 每个酒吧都代表一组三个独立的实验中,至少执行一式三份。 一个未配对的学生t测试是用来比较两个菌株。 (D)固定化纤连蛋白绑定的指数增长阶段细菌显示为均值±SEM的三个独立的实验中,每个执行6技术重复; 双尾非参数Mann-Whitney U检验比较两个菌株的不同绑定。 (一个- - - - - -D)* * P < 0.01; * * * P < 0.001)。 在最初的隔离; 哈,host-adapted隔离; V8,第一个分离收集显示SigB-deficient变体(隔离15后第6周)。
我们下一个调查形成生物膜的能力在体外。 15 (V, HA和隔离8在37°C)增加静态24小时在96孔板,其次是结晶紫染色(图。5)。 HA隔离形成生物膜明显多于隔离。 聚-N乙酰氨基葡萄糖(PNAG),生物膜的主要多糖成分矩阵,是量化与peroxidase-labelled染色后麦胚凝集素(WGA)(无花果。5 b)。 这里,HA隔离产生至少70% PNAG相比(P < 0.0001)在隔离。 SigB-deficient变异,V8和V9(公顷),表现出相同的生物膜表型。
生物膜的形成和PNAG生产。 由静态生长细菌生物膜的形成和PNAG生产,在TSB 24小时37°C。 (一个)数据显示表示规范化结晶紫-生物膜的结果(OD 590海里)除以单个细菌生长确定在600纳米的光密度。 (B)数据显示的结果是细菌PNAG绑定到麦芽凝集素辣根过氧化物酶共轭(OD 490海里)。 (一个,B)这两个图表显示结果的均值±SEM三个独立的实验中,每个执行六个技术复制; 一个未配对的学生t测试是用来比较两个菌株(PNAG)。 双尾非参数Mann-Whitney U测试。 (* P < 0.05; * * P < 0.01; * * * P < 0.001)。 在最初的隔离; 哈,host-adapted隔离; V8,第一个分离收集显示SigB-deficient变体(隔离15后第6周)。
感染小鼠模型被用来研究毒性的差异之间的乳腺炎隔离(无花果。6)。 女性CF-1远系小鼠感染时成为垂死的快高(1×107CFU /鼠标; 无花果。6)比较低(1×106CFU /鼠标; 无花果。6B)细菌负荷,确定毒性剂量依赖效应。 对剂量,在隔离更快的进展和发病率高于HA隔离。 几乎没有观察发病率(1×106CFU /鼠标),当老鼠挑战哈隔离。 相比之下,RF122,应变与严重的乳腺炎,导致发病率最快的发展,类似于在隔离。
细菌毒力测试的腹腔内感染小鼠模型。 kaplan meier曲线显示小鼠感染后的生存与1×107(一个)或1×106(B)与五小鼠CFU /毫升细菌培养液,每组。 kaplan meier和HA-infected老鼠的生存曲线与生存率较进行了分析。 在最初的隔离; 哈,host-adapted隔离。
在这项工作中,我们紧随其后年代。葡萄球菌在宿主适应的三个月期间一种慢性、亚临床牛乳腺炎通过红外光谱的光谱血清学分型。 纵向收集年代。葡萄球菌隔离从封装转向non-encapsulation,改变与慢性感染有关10,13。 在抽样的时间进程,奶牛不与任何抗生素治疗。 因此,健身在宿主适应的优势年代。葡萄球菌对牛主机隔离反映了反应。
比较全基因组分析显示,一个主导和几个异构亚种群基因共存在感染的早期阶段,通过一个或多个附加不同单核苷酸突变,这可能是中性或略有害。年代。葡萄球菌变异率计算等于一个SNP每6到15周17事实上,我们确实发现17个snp导致9克隆变异收集在14周。 我们采样的时间间隔内,我们观察到的一个主导的替代初始变体host-adapted变异,显示SigB-deficient表现型。 后者出现配备一部小说,稳定特征从第一个到最后一个隔离,可能授予一个选择性优势所揭示的表现型。
开发和维护慢性感染,年代。葡萄球菌在宿主适应会导致特定的致病型的出现,如小群体(SCV)和agr有缺陷的变异9,20.。 在我们目前的工作中,我们可以直接追踪的出现SigB-deficient致病型慢性进展中,亚临床牛乳腺炎。 的SigB-deficient致病型可能错义突变引起的rsbU,属于一个基因sigB轨迹。 一个SigB-activity的标志,asp2321,强烈抑制在HA隔离在转录和蛋白质水平。 这也是见过的年代。葡萄球菌8325 - 4 (11-bp删除rsbu)和SH1000∆sigB相比SH1000(全功能SigB操纵子),支持的减少asp23表达HA可以归因于SigB不足,相关的SNP检测rsbU基因。 此外,我们观察到一个亏损色素沉着,减少凝固酶活性蛋白水解活性的增加以及Hla表达式,SigB-deficiency著名的指标19,21。 SigB活动控制了超过200个基因的表达和调控partner-switching机制年代。葡萄球菌22,23。 这种机制的关键点之一是RsbV的磷酸化状态,在磷酸酶RsbU脱去磷酸RsbV SigB激活。 相比枯草芽孢杆菌,RsbU年代。葡萄球菌可能会持续活跃的高水平,没有任何刺激导致内在SigB激活24。 因为我们发现的SNPrsbU基因(G368A) c端磷酸酶域中24,25,人们很容易推测结果甘氨酸/天冬氨酸替代(G122D)导致RsbU RsbV-P-specific磷酸酶活性的丧失,因此sigB仍然灭活。 突变影响SigB-functionality以前检测到在体外(例如,通过连续使培养基)26,27以及从人类感染持续中标识隔离,等年代。葡萄球菌实验室参考菌株NCTC8325 (11 bp删除rsbU)和KS26(终止密码子插入rsbU)28,29。 此外,一种自适应进化的rsbU期间展示了人类慢性支气管感染的三个囊性纤维化患者中,18个基点在帧删除被发现rsbU。 在这里,推断的突变率sigB相关的位点相比高出119倍背景突变率30.。 就在最近,突变rsbU被描述为年代。epidermidis在东道主进化pacemaker-associated心内膜炎31。 我们的数据从一个慢性感染奶牛以及人类研究的发现强调的临床相关性SigB-deficient致病型年代。葡萄球菌发病机制,尤其是在慢性、持续性感染。
除了压力体内平衡的核心作用,SigB有助于一些致病因素定义葡萄球菌的发病机理。 这包括大量的表面蛋白的转录激活(如clfA,fnbpA),而下调分泌毒素和蛋白酶的生产(如本身,sspA,sspB)22。 事实上,我们发现异常强劲SigB-deficient蛋白水解活性,host-adapted隔离与成熟exoprotease SspA,已知葡萄球菌蛋白水解作用的主要原因和蛋白水解的级联激活的一部分。 本身,SspA和SspB分泌活性的发酵菌和必须经过步进式处理完全活跃。 与发酵菌是autoactivated在细胞外,而激活SspA和SspB依赖的蛋白水解级联与流程SspA和随后SspA流程SspB(无花果。3 d)32,33。 我们的数据显示一个完整的激活蛋白水解的HA与级联分离。 这是实验支持的强大的转录upregulation和随后的分泌与HA隔离和发酵菌的SspA和SspB仍不活跃,proform在。 此外,微分丰富的几个不同的SspA蛋白水解乳沟之间的产品在和HA隔离支持pro-SspA转化为成熟,活跃SspA只在HA孤立在符合步进式,trypsinogen-like SspA的处理与最终激活步骤被极度依赖本身18。 增加蛋白质水解与持久性有关年代。葡萄球菌在人类慢性骨髓炎和囊性纤维化34,35。 建议坚持细菌的新陈代谢需要适应glucose-poor,但富含蛋白质的骨组织环境,其中可能包括骨组织的破坏34。 也降解宿主细胞补充系统的抗菌肽和组件年代。葡萄球菌exoproteases是假设35。 除了直接影响主机,葡萄球菌exoproteases被证明打通细菌表面蛋白和提出了重要surface-associated脱落的蛋白质。 特别是,葡萄球菌fibronectin-binding蛋白(FnBPs)非常容易SspA降解36。 结合一个sigB端依赖的表达fnbpA和clfA位点22,这可能解释了host-adapted绑定,SigB-deficient固定化纤连蛋白分离。 高水平的SspA分泌和降低Hla与已报告37,这可能解释了溶血性活动下降SigB-deficient绵羊血琼脂,HA隔离,尽管高架Hla表达和分泌19。 数据提供的证据表明,一个增强蛋白水解过程中活动是有利的一种慢性感染,因为它能抑制细菌的免疫识别和宿主细胞毒性,从而促进访问新的营养来源以及逃避宿主的免疫系统,并可能负责减少毒性HA隔离的腹腔内感染小鼠模型。
此外,内化和生存年代。葡萄球菌在慢性非专业吞噬细胞是一个重要的机制,持续感染38。 这是牛乳腺炎所示,年代。葡萄球菌能在乳腺上皮细胞入侵和生存在体外和可行年代。葡萄球菌已经成功地分离出肺泡细胞,来源于慢性感染牛的奶39,40,41。 损失胶囊表达式与内化率较高35,因此我们预期non-encapsulated HA隔离内化更好。 相比之下,我们观察到轻微,但显著降低了内化成牛上皮细胞的能力,这是符合先前的调查结果,显示激活SigB所需细胞吸收42,43。 此外,没有观察差异和HA分离胞内存活48小时。 因此,哈,SigB-deficient表型似乎不太适合于细胞内的利基。
年代。葡萄球菌生物膜的形成与长期坚持牛乳腺炎44。 事实上,我们发现高水平的生物膜的形成对哈,SigB-deficient致病型。 我们还观察到生物膜的增长PNAG-content HA隔离,主要的胞外年代。葡萄球菌生物膜矩阵,通过生产ica操纵子45。 人们很容易推测,增加生物膜的形成主要是基于蛋白质的生物膜胞外多糖PNAG-dependent而不是矩阵。 确凿的发现,它最近已被证明年代。葡萄球菌sigB-deficient突变体产生更高PNAG-based生物膜与相应的野生型菌株相比,这是降低Ica蛋白质维持较高的周转率PNAG胞合成46。 因此,更高的生产PNAG-based HA生物膜的分离可能导致压力的能力,以适应一个牛宿主细胞外利基促进葡萄球菌的持久性。
鉴于和HA明显的表型变化之间的隔离,变更年代。葡萄球菌毒性可以预期。 因此,哈,SigB-deficient隔离导致死亡率明显降低感染的小鼠模型。 的贡献SigB毒性仍在辩论,因为减毒和保留毒性观察27,34。 它提出了一个减少SigB-functionality可能不是有害的28,复杂,调整监管SigB网络,而调制的毒性比决定47。 然而,我们发现了一个清晰的趋势降低毒性的隔离,正如预期的那样在慢性持续性感染48。
总之,我们表明,SigB-deficient表型的临床相关性,尤其是在慢性、持续性感染。 我们可以证明不那么恶毒的出现,SigB-deficient年代。葡萄球菌致病型由于细菌感染牛乳腺微环境适应。 我们确定了蛋白质水解是一个有利的因素在慢性乳腺感染,可能调解免疫逃避和开发新的营养来源。 此外,增强PNAG-based形成生物膜的能力可能有助于更好的抵抗免疫攻击的主机和更好的适应到细胞外环境。
年代。葡萄球菌隔离从牛奶样品来自常规挤奶的奶牛(瑞士褐牛品种; 手工挤奶支柱和拴在住房维也纳兽医大学)与亚临床乳腺炎的三个月。 在研究动物没有任何临床乳腺炎的症状。 没有细菌接种到动物。 由专业兽医卫生管理是独立于我们的研究。 由于抗生素、支气管炎与系统性政府牛奶取样是中断三个月后的样本集合。 无菌收集牛奶样本在坐标系常规微生物乳腺炎的诊断处理8。
年代。葡萄球菌牛应变RF122 (ST151)49是包括作为参考应变诱发严重的乳腺炎。 菌株685050和它同基因的∆sigB突变体51被用于表型歧视的凝固酶和蛋白水解活性以及staphyloxanthin生产。年代。葡萄球菌6850∆hla (l . Tuchscherr de Hauschopp提供的医学微生物学研究所耶拿大学医院,德国),6850年50和它同基因的∆sigB突变体51被用作控制压力测试牛羊血琼脂隔离溶血性活动。年代。葡萄球菌SH1000528325 - 453和SH1000∆SigB43包括mRNA表达的研究asp23。 所有年代。葡萄球菌隔离是生长在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)(热费希尔科学、Oxoid、汉普郡,英国)补充了红霉素在需要的地方(5µg /毫升)。
红外光谱光谱应变识别、子类型化和CP血清学分型进行如前所述16,54。 层次聚类分析(HCA)资助建设,高分辨率光谱范围的亚种分化进行了碳水化合物成分(1200 - 800厘米−1)使用的平均光谱测量数据上执行三个不同的日子。 CP血清型(CP5 non-encapsulated)是由人工神经元network-assisted监督化学计量学。
隔离使用Illumina公司测序技术与250 - bp paired-end协议MiSeq音序器(Illumina公司)。 图书馆是适应获得测序覆盖至少100倍。 Fastq文件修剪(平均基地30质量,力争覆盖> 100倍)新创组装用天鹅绒1.1.04 SeqSphere +(5.1版本; Ridom,德国明斯特)55,56。 所有基因组存在cgMLST目标≥95%,等位基因名称被分配到基因组序列草案SeqSphere提供的软件。 此外,Illumina公司paired-end读取初始(中)和host-adapted (HA)隔离使用Trimmomatic修剪版本0.3857。 草案的基因组新创组装与13.13.0黑桃版本58,然后用1.13.3 Prokka版本注释59。
1毫升一夜文化从每个应变是由离心沉淀后1分钟(10000克)光密度(OD)在600纳米测量。 细胞收获于200年暂停µl甲醇和孵化55°C 3分钟。 细胞碎片被离心分离后,甲醇提取步骤重复一次,提取收集管相同。 提取的色素被评价的量化OD在450 nm和规范化文化OD 600海里60。
幻灯片和试管凝集试验使用兔血浆根据制造商的指示,热科学™Remel, # R21060。 株蛋白水解能力进行测试,因为生长在脱脂牛奶琼脂1%或1%脱脂牛奶汤,18小时37°C。 蛋白水解活性评估眼睛和生长介质相比没有任何细菌负荷。 溶血性活动被发现测试5µl一夜之间文化(TSB)到CBA和直接溶血评价18小时后37°C,随后进一步4小时孵化在4°C,为“冷溶血试验。
根据Bose Zymography执行等。61。 简单,减少样品(7.5 - 15µg蛋白质/ lane)加载到12.5% sds - page凝胶补充1%酪蛋白。 蛋白质分离在120伏特,最多20 mA在4°C。 在特里同x - 100和2.5%再生后连续用5毫米CaCl平衡2在pH值为7.4,50毫米三20分钟和0.2 M氯化钠,CaCl 10毫米2,50毫米三,0.02% Brij35 pH值7.4 20 - 30小时,凝胶染色一夜之间在室温下使用PageBlue蛋白质染色,用超纯水使退色。
二维差异凝胶电泳(2 d-dige)和MALDI-TOF女士/ MS-based蛋白质识别进行了如前所述62。 简单地说,CyDye消化TM荧光染料(通用电气医疗集团LifeScience)被用来标记蛋白质的细菌沉淀得到的上层清液中10%的柠檬酸。 等电点聚焦对IPGphor III系统上使用cuploading 24厘米IPG干条/ pH 3-10NL(所有通用电气医疗集团LifeScience)。 第二个维度是进行一个Ettan DALTsix电泳系统(通用电气、医疗)。 2的荧光图像d-dige凝胶是在9400年台风扫描仪(通用电气医疗集团)和图像编辑使用ImageQuant TL软件8.1版本(通用电气医疗集团)。
蛋白质斑点被MS-compatible可视化银染色,手动切除,汇集和使退色如前所述63。 消化是8小时37°C使用12.5μg /μl胰蛋白酶(Promega)。 提取肽集中和脱盐使用μZipTips C18(微孔)。 蛋白质被确定通过基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF / TOF) (Ultraflex II,力量Daltonics,德国)用pre-spottedα-cyano-4-hydroxycinnamic酸(PAC目标,力量Daltonics)。 光谱预处理和峰值进行了注释使用FlexAnalysis和Biotools(力量Daltonics)。 蛋白质在UniProt限制搜索分类列表年代。葡萄球菌应变坳USA300,使用以下参数:宽容女士100 ppm; MS / MS公差1达; 一个错过的乳沟允许; 固定的修改:carbamidomethylation cysteins和变量修改:氧化(M)、Deamidated (NQ)、Gln - > pyro-Glu (n项Q)。识别被认为是蛋白质的统计学意义,如果吉祥物> 80.0和肽吉祥物> 20.0。
西方的污点进行小型sds - page凝胶如前所述64。 单克隆anti-Hla-Ab(# 8950),请提供Arsanis生物科学(奥地利维也纳)作为主要抗体,紧随其后的是二级抗体山羊F (ab′) 2反lgG (H + L)合(美国南部生物技术、伯明翰、AL)和检测ECL免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团生命科学)。
细胞培养实验中,一个牛乳腺上皮细胞(MAC-T)线使用65。 内化和生存实验Buzzola相似等。66。 检测细菌生存在24和48小时后感染,初始溶葡球菌酶治疗后1小时的cell-bacteria co-incubation,重复每24小时用新鲜培养基,保证细胞外葡萄球菌的完全删除67。 实验进行至少三次技术一式三份。
年代。葡萄球菌结合固定化牛纤连蛋白被Brouillette检查类似协议等。68和巴赫等。69。 整除指数期的文化(1×108CFU)检测绑定到5毫克/毫升牛纤连蛋白(Sigma-Aldrich)。 细菌沾0.1%结晶紫,Milli-Q水清洗,干盘子和纤连蛋白结合量化测量的OD 590海里(SpectraMax M5吸光度标、分子设备)溶解细菌绑定后结晶紫在30% (v / v)冰醋酸。 实验进行至少三次,每个有六个技术一式三份。
定量生物膜和半定量PNAG评估执行如前所述8。 从三个独立的实验结果评估,每个执行六个技术复制。
RNA提取和存在根据Dommel描述的协议执行等。5,70。 总RNA提取进行菌株生长在37°C的TSB 0 (OD600 0.05), 3 - 6小时(120 rpm和需氧菌)。 引物及其效率表中列出S2。 在循环条件对C1000触摸热循环仪CFX96实时系统(BioRad)使用:激活和DNA聚合酶变性在95°C / 3分钟,其次是35周期的变性在95°C / 10秒和退火/扩展54°C (asp23)4359°C (本身)4359°C (hla)7159.1°C (ρ),54.5°C (rpoD)和59.2°C (dnaN)4230秒,然后融化曲线分析65 - 95°C之间的步骤0.5°C / 5秒。 相对表达水平被Pfaffl使用其他方法计算,与内部校准样品检索时间点零和规范化的几何平均三个参考基因(rpoD,ρ和dnaN)。 意味着相对表达式和标准差计算从三个独立生长样品和他们的技术重复。
女性CF-1远系小鼠饲养在动物园和维护学院Investigaciones en Microbiologia y Parasitologia》(布Aires-CONICET大学)。 本研究进行了按照设定的国际指导方针的建议:11报告BVAAWF /框架/皇家防止虐待动物协会/ UFAW联合工作组细化。 协议是机构批准的动物保健和使用委员会(CICUAL),决议N2780/2018医学院,布宜诺斯艾利斯大学。
5组老鼠在一个2个月的时代被腹腔内感染(i.p)注射0.5包含1×10毫升的暂停6或1×107CFU的年代。葡萄球菌,HA或RF122菌株和2% (w / v)啤酒酵母在TSB肉汤(西格玛化工有限公司)72。 菌落的数量在电镀后的培养液是可行的计算验证了连续稀释的整除TSA盘子。 对照组注射0.5毫升的2% (w / v)啤酒酵母在ip路由TSB肉汤。 老鼠每天监测,直到第五天。 标准建立的端点(全身感染/发病率)达成以下:我)的损失至少15%的体重有或没有折边或“spikey”皮毛和ii)的损失至少10%的体重和弯腰驼背的姿势73。 这些迹象展示动物牺牲,死在生存分析。 老鼠被公司实施安乐死2吸入和随后的颈椎错位。
两种的区别是由一个未配对的学生进行测试t以及(双尾),除非被确认为非正态分布的数据。 在这种情况下,非参数Mann-Whitney U测试使用(双尾)。 最低统计学意义P < 0.05。 生存数据,绘制和分析使用kaplan - meier生存曲线生存率较。 的GraphPad Prism7.0软件是用于所有统计计算。
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